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PARETE CELLULARE
● Formata da peptidoglicani (zucchero complesso) composto da alternanza di NAM e NAG (zuccheri a 6 atomi di carbonio) con legame glicosidico. ● per assemblare le catene ci sono peptidi che formano maglia che protegge la cellula ● GRAM + molto più spessa dei gram-, presenza di acidi teicoici (non attraversano completamente la membrana) e acidi lipoteicoici (attraversano e avendo parte lipidica trattiene la parete alla cellula) ● GRAM - doppia membrana (interna ed esterna), periplasma (spazio compreso tra membrane). Membrana interna ci sono fosfolipidi, mentre in quella esterna ci sono lipopolisaccardi → risposta immunitaria dell’ospite (formati da catena O, core polisaccaride e catena lipidica A) ● è possibile degradare parete con lisozoma (=rompere legami NAM-NAG) ● battere senza parete = protoplasto
MEMBRANA CITOPLASMATICA
● 3 ruoli: barriera di permeabilità, sito di ancoraggio (proteine coinvolte nel trasporto attivo, nella bioenergetica e nella chemiotassi), conservazione energetica (potenziale energetico mantenuto con gradiente di concentrazione degli ioni H+ → forza protomotrice) ● costituita da doppio strato fosfolipidico, contiene anche steroli (per renderla più stabile) → nei batteri no colesterolo ma opanoidi (es. diloptene) ● si trovano proteine integrali di membrana (es. sensori) ● GRAM - parte interna: formata da fosfolipidi e lipoproteine parte esterna: LPS(lipopolisaccaridi) e porine → canali che rendono membrana più permeabile della parete, passaggio piccole molecole
FLAGELLI
● Strutture interamente proteiche composte da: filamento (stessa proteina ripetuta), uncino (permette movimento a spirale) e corpo basale ● rotazione richiede dispendio di energia → forza elettron-motrice ● 3 tipi di organizzazione: unico flagello polare, flagelli lofotrochi, flagelli peritrichi ● GRAM+ corpo basale consente di attaccare il flagello alla parete e alla membrana (dove si trovano degli anelli proteici) ● GRAM- nella parte interna sono presenti più anelli (4) perchè ci sono più strati da attraversare. L’intera struttura è cava → passaggio di monomeri di flagellina per sintesi filamento. Negli anelli si trovano proteine Mot (rotazione flagello con forza elettron-motrice) e proteine Fli (cambiare senso di rotazione). alcuni hanno forma di spirale (spirocheti) e hanno endoflagelli → tra le due membrane, permettono a cellula di ruotare su se stessa anche in ambienti meno viscosi ● sintesi : - formazione anello MS
- assemblaggio altri anelli e uncino
- sintesi del cap (estremità del flagello)
- sintesi del filamento con afflusso di flagellina (controllato da proteine del cap) ● movimento batterico : - chemiotassi → batteri si direzionano in base alla presenza di alcune sostanze chimiche nell’ambiente (tumble = capriole → per cambiare rotazione)
- fototassi → rispondere stimoli luminosi, soprattutto batteri fotosintetici → si posizionano dove lunghezza d’onda è più favorevole
- aerotassi → avvicinamento o allontanamento dall’ossigeno
- osmotassi → avv o all da alte concentrazioni ioniche
batteri controllano il loro ambiente con sistemi sensoriali localizzati sulla membrana cellulare e processano informazioni attraverso via di trasduzione del segnale. ● motilità per scivolamento → solo gram- bastoncellari, molto più lenta, solo se a contatto con superficie solida, secrezione di sostanza mucosa (polisaccaridi), avviene grazie a forza elettron-motrice ● capsule e strati mucosi: - strato S → ruolo di protezione, adesione, riconoscimento e mantenimento rigidità. composto da monomeri della stessa proteina a formare reticolo
- glicocalice → strato gelatinoso composto da polisaccaridi e polipeptidi. Se molto spessa e densa è capsula, se meno densa e estesa è slime layer funzioni: aderire a superfici (es. ospite), difesa dall’ospite, protezione in condizioni avverse, da infezioni virali, da agenti chimici, contro stress osmotico glicocalice può coesistere con strato S
- fimbrie → estensioni non motili di natura proteica, aderenza ai tessuti, più sottili e corte dei flagelli, formazione biofilms
- pili → lunghi e pochi, ruolo nella motilità (polimerizza e depolimerizza: cellula lancia il pilo e lo ritrae trascinandosi), funzione di scambio di materiale genetico nei batteri (processo di coniugazione: passaggio di plasmidi, adesione, formazione aggregati cellulari e biofilms formazione pilo (gram-): - enzima peptidasi trasforma unità di prepilina in monomeri di pilina -pilina viene inserita nel pilo con utilizzo di energia fornita da proteina PilB, questa spinge il pilo verso l’esterno creando posto per nuova unità -quando pilo deve essere ritratto interviene PilT (attività antagonista)
CORPI D’INCLUSIONE
● Dipartimenti all’interno della cellula che fungono da materiale di riserva (es. polifosfati e globuli di zolfo elementare) ● Magnetosomi → servono per orientarsi percependo campi magnetici (magnetotassi) ● Vescicole gassose → strutture proteiche vuote e rigide nel citoplasma, permeabili ai gas e ma non a acqua e soluti, rete molto fitta di GvpA (foglietti B) e GvpC (a-eliche), regolare la posizione dei batteri acquatici nella colonna d’acqua
- Endospore
- strategia difensiva in condizioni avverse
- sporulazione = processo formazione endospora
- cellula viene riempita di acido dipicolinico, calcio e proteine leganti DNA e perde quasi tutta acqua → metabolicamente inattiva e più resistente (uguale gram+ e -)
- vari strati: core (interno, contiene materiale genetico), due membrane con all’interno corteccia, tunica, esosporio formazione : - allineamento DNA lungo asse e allontanamento due unità genomiche
- creazione setto
- invaginazione: formazione due membrane attorno alla futura endospora -si aggiungono altri strati e la cellula va incontro a lisi germinazione : rottura del rivestimento sporale, esocrescita, aumento attività metabolica ● materiale genetico → nucleotide: cromosoma batterico, dove si accumula il materiale genetico → plasmidi: molecole formate da DNA a doppio filamento e circolari, non essenziali per la vita della cellula, ma ne conferiscono vantaggio selettivo.
CRESCITA MICROBICA
● Crescita microbica = aumento numero cellule ● per crescere c’è bisogno di fonte di carbonio, idrogeno e ossigeno e fonte di elettroni ● organismi possono essere autotrofi (usano CO2 come fonte di carbonio) o eterotrofi (usano molecole organiche). Inoltre possono essere fototrofi (luce come fonte di energia) o chemotrofi (ossidazione di
- Fattori ambientali che regolano crescita: → temperatura : optimum crescita sempre più vicino a temperatura max (se inferiore membrane gelling: membrana si congela quindi non c’è più trasporto e cellula non cresce, se superiore denaturazione proteine: perdono struttura 3D, membrana perde integrità, lisi). Organismi possono essere psicrofili (maggiore quantità a-eliche -> liquidità, presenza acidi grassi insaturi -> membrana più fluida, produzione sostanze antigelo), mesofili, termofili (resistono alla denaturazione quindi maggiori foglietti B, membrana ricca di acidi grassi saturi) o ipertermofili (acidi grassi saturi e idrocarburi, membrane 1 strato fosfolipidico -> membrana più resistente) → pH : batteri possono essere acidofili (crescere con pH acido) o alcalofili (a pH basici) → attività dell’acqua (aw) : quantità d’acqua disponibile per l’organismo (più soluti si hanno in soluzione, minore è l’attività dell’acqua) aw= Psoln/Pwater (P=pressioni di vapore) osmotolleranti: organismi che crescono in grande intervallo di attività dell’acqua. di solito organismi vivono in ambiente con equilibrio idrico positivo, mentre osmotolleranti possono vivere anche negli altri ambienti, infatti utilizzano soluti compatibili che non interferiscono con metabolismo cellulare (in questo modo concentrazione interna aumenta e rimane sempre più elevata di quella esterna). Organismi possono essere non alofili, alotolleranti, alofili o alofili estremi in base alla tolleranza a concentrazioni di NaCl. → relazione con l’ossigeno : in base alla sopportazione dell’O2, si dividono in aerobi (obbligati, facoltativi o microaerofili) e anaerobi (aerotolleranti o obbligati). forme tossiche dell’ossigeno (ROS) sono superossido, acqua ossigenata, ione idrossido e sono intermedi della reazione di sintesi dell’acqua. Organismi aerobi sono dotati di enzimi in grado di rendere questi intermedi non tossici (catalasi, perossidasi, superossido dismutasi e perossido riduttasi). Per fare esperimenti anaerobiosi si usa metodo Gas-Pak: contenitore con tappo ermetico con struttura di palladio che toglie l’ossigeno (combina idrogeno gassoso con quello in acqua) e si aggiunge con sostanze chimiche che rilasciano anidride carbonica e idrogeno. Oppure si usa glovebox.
TRASPORTO DI MEMBRANA
- Verso l’interno ● Assorbimento di sostanze nutritive può avvenire in vari modi: - trasporto passivo (diffusione): non implica utilizzo di energia, ma osmosi (H20, CO2, O2). - diffusione facilitata: canale formato da proteine trasportatrici non specifiche (permeasi → conferiscono permeabilità alla cellula). Non richiede energia, leggi dell’osmosi: abbassa gradiente di concentrazione (glicerolo, zuccheri e aminoacidi). I canali possiedono un sito dove la molecole si lega, poi subisce una trasformazione strutturale che lo apre verso l’interno e la fa entrare. - trasporto attivo: utilizza energia idrolizzando molecole di ATP (molecole contro gradiente). Esistono uniporto (richiede energia), antiporto (molecola trasportata in una direzione e un’altra nell’altra) e simporto (contemporaneamente nella stessa direzione, non richiede energia). forza elettron-motrice (E.Coli): H entra nel canale secondo gradiente e con simporto entrano anche ioni solfato. Lattosio entra con proteina Lac permeasi. Quando molecole entrano forza elettron-motrice diminuisce perché si riduce gradiente degli ioni H+, quindi poi respirazione cellulare trasporta protoni all’esterno. ● Traslocazioni di gruppo: la molecola viene modificata chimicamente durante trasporto attraverso fosforilazione (aggiunta gruppo fosfato) e con l’aiuto di enzimi (fosfotrasferasi) non specifici che trasportano gruppo fosfato fino a enzima specifico. ● Sistema ABC (ATP-Binding Cassette): tipico dei gram+ e coinvolge proteine di legame periplasmatiche (riconoscono e legano molecola da trasportare in modo molto specifico) assieme a proteine di membrana e quelle per idrolisi ATP. ● Nei gram- tutto più complicato perché ci sono due membrane → più canali, es trasporto ferro avviene grazie a due sistemi coniugati: primo con forza elettron-motrice per far passare Fe all’esterno del periplasma e secondo con sistema ABC per passare da periplasma a citoplasma - Verso l’esterno ● Traslocazione: trasferimento proteina da un compartimento all’altro. Solitamente si tratta di proteine che degradano macronutrienti fuori dalla cellula o fattori di virulenza
● Sistema Sec → più utilizzato dai batteri → 3 componenti: complesso transmembrana, motore citoplasmatico (fornisce energia) e sistema citoplasmatico (riconosce proteine da trasportare) → proteine che devono uscire hanno nella porzione N-terminale una sequenza segnale con porzione idrofila basica, regione idrofoba e porzione polare → trasporto all’esterno: - complesso proteico SecB si lega e aiuta proteina a raggiungere membrana
- SecA si lega a SecB e porta proteina a SecYEG (complesso di membrana)
- SecB rilascia proteina e ATP si lega a SecA, cambiandone conformazione e iniziando traslocazione. Alla fine viene rimossa sequenza finale attraverso peptidasi segnale. ● Sistema SRP: complesso costituito da proteine e molecola RNA, è in grado di riconoscere sequenza specifica proteina nascente. Viene legato a complesso FtsY che lo scorta verso membrana dove trova SecYEG. ● I gram- usano molti sistemi Sec-dipendenti per attraversare seconda membrana: → sistema Gsp: attraversa entrambe le membrane, è composto da varie proteine e utilizza ATP (che si somma a quella usata dal Sec) → sistema TPS (two partner secretion): produzione simultanea della proteina da trasportare all’esterno e della proteina che costituisce il canale. Entrambe possiedono sequenza di segnale e la proteina da trasportare possiede anche la sequenza TPS. Entrambe proteine vengono trasportate nel periplasma da Sec, poi la tpsB crea canale di trasporto. → Sistema di autotrasporto: non necessita di fattori supplementari, la proteina ha tre domini: sequenza segnale N-terminale, dominio interno e dominio C-terminale. Vengono fatti due tagli dalla proteasi per separare proteina vera e propria dai terminali → secrezione attraverso Chaperone/Usher: secrezione e assemblaggio strutture superficiali come Pilo. Sistema Sec trasporta subunità di pilina nel periplasma, poi si lega a chaperonina PapD che scorta proteina e impedendogli di aggregarsi troppo presto. La porta fino alla proteina usher che forma un canale per assemblaggio del pilo. ● Sistemi Sec-indipendenti :
- Tat (twin-arginine translocation system): tutte proteine hanno due residui di arginina nella sequenza segnale. Sistema di trasporto formato da tre proteine: TatA, TatB, TatC. Non richiede ATP. Tre fasi: - intervento chaperonina per non farla legare a Sec, ripiegamento con sistema TatA
- proteina viene indirizzata verso TatBC, nel periplasma viene rimossa sequenza segnale
- Sistema di trasporto ABC: non implica passaggio da intermedio periplasmatico, proteina si estende interamente nel citoplasma, proteina che idrolizza ATP e proteina associata a membrana esterna. Sequenza di riconoscimento è C-terminale.
- Sistema di secrezione di tipo III: usato da batteri patogeni per infettare, composto da molte proteine diverse che formano una siringa. Proteine che possono essere trasportate così si chiamano effettori e hanno bisogno di sequenza N-terminale
- Sistema di secrezione di tipo IV: forma il pilo di tipo IV (funzione motoria e coniugazione). Traslocazione di DNA e proteine avviene attraverso contatto con cellula bersaglio. Uso di ATP.
METABOLISMO
● Metabolismo = insieme di reazioni controllate con il fine di ottenere energia (catabolismo + anabolismo) ● l’energia viene ricavata dalla luce (organismi fotoautotrofi) o dal catabolismo (=degradazione dei nutrienti) e viene contenuta nei legami dell’ATP ● per degradare nutrienti si usano degli enzimi per formare metaboliti precursori ● sia nel catabolismo che nell’anabolismo l’energia viene persa sotto forma di calore. Durante una reazione chimica l’energia libera G = energia rilasciata che può essere impiegata in un lavoro utile. ΔG0’ è cambiamento di energia libera: se positivo → reazione endoergonica (richiede energia), se negativo → reazione esoergonica (libera energia, però serve comunque energia di attivazione per rompere legami tra reagenti)
- PATHWAY METABOLICI PRINCIPALI
● Respirazione cellulare
Consiste nella demolizione completa del glucosio per formare anidride carbonica e acqua.
- Glicolisi → glucosio viene demolito per formare due ATP, due NADH e piruvato consiste in 10 reazioni enzimatiche e 3 fasi: - glucosio entra nella cellula e viene fosforilato 2 volte (2ATP→2ADP) - grazie ad un enzima viene trasformato in fruttosio bifosfato - fruttosio viene trasformato in gliceraldeide 3-fosfato (G3P) - produzione delle prime due molecole di NADH perché G3P cede e- al NAD+ - 2 gruppi fosfato vengono rilasciati quindi vengono prodotte due molecole di ATP - rilascio di 2 molecole di acqua - gruppi fosfato vengono trasferiti all’ADP con produzione di 2 ATP e 2 molecole di acido piruvico a tre atomi di carbonio. (avviene fosforilazione a livello di substrato: enzima lega il substrato contenente gruppo fosfato e grazie aiuto di cofattore Mg2+ sposta gruppo fosfato all’ADP formando ATP) Bilancio netto di ATP: 2 molecole di ATP in più
- Sintesi di acetil-CoA → acido piruvico prodotto da glicolisi viene decarbossilato (gli viene tolto un atomo di C) e diventa quindi acetato. Viene poi associato al coenzima A e perde elettroni e protoni grazie ai quali si forma una molecola di NADH da una di NAD+. Quindi si ottiene acetil-CoA che può entrato nel ciclo di Krebs
- Ciclo di Krebs → 8 reazioni enzimatiche che trasferiscono energia contenuta nei legami dell’acetil-CoA ai coenzimi NAD e FAD, riducendoli. Fasi: - acetil-CoA entra nel ciclo complessandosi in acido ossaloacetico (4C) per formare acido citrico (6C). Gruppo CoA viene rilasciato - fase 2-4 la molecola viene riorganizzata. fase 3 si ha decarbossilazione mentre substrato cede protoni ed elettroni con formazione di NADH e CO2. fase 4 viene di nuovo aggiunto CoA - fase 5 viene rilasciato CoA e c’è produzione di ATP - fase 6-8 ulteriori ossidazioni che generano acido ossaloacetico liberando NADH e FADH2. Bilancio netto: 1 ATP, 2 CO2, 3 NADH, 1 FADH
- Catena di trasporto elettronico → una serie di molecole attaccate alla membrana ricevono e cedono elettroni (forniti da NADH e FADH2) fino ad un accettatore finale di elettroni (che è l’ossigeno che non l’aggiunta di elettroni e protoni viene ridotto ad acqua). Componenti: - NADH cede elettroni alla catena e libera NAD+. Gli e- vengono ceduti alla flavoproteina (integrale di membrana che alterna stato ridotto a stato ossidato) - Proteine contenenti metalli - Ubiquinoni → molecole organiche derivate dalla vitamina K. FADH2 cede elettroni a loro - Citocromi → proteine integrali con gruppo eme - nello step finale O2 è accettatore di elettroni e genera molecola di acqua ogni volta che elettroni vengono ceduti, vengono pompati all’esterno della cellula dei protoni che aumentano gradiente di forza elettron-motrice
- ATP sintasi → composta da due subunità F0 (complesso di membrana, funzione di trasportare protoni verso l’interno) e F1(nel citoplasma, funzione di fosforilazione dell’ADP) flusso di e- in F0→rotazione delle proteine C12→ torsione viene trasmessa alla porzione citoplasmatica dell’ATP sintetasi (per mezzo di proteine ε e γ)=> cambiamento strutturale delle subunità β→ consente a F1 di legare ADP e gruppo fosfato → produzione di ATP (fosforilazione ossidativa o fotofosforilazione) C’è anche una struttura formata da proteine b2 e δ che ha funzione di blocco → impedisce alle α e β di ruotare insieme a ε e γ. Proteina β esiste in 3 conformazioni: - conformazione aperta O : bassa affinità per il substrato - conformazione inattiva L: debole affinità per il substrato - conformazione attiva T: alta affinità per il substrato Bilancio energetico totale: da 1 molecola di glucosio si ottengono 38 ATP
● Fermentazione
fermentazione = via metabolica alternativa in assenza di accettatore finale di elettroni (rigenera NAD+) Inizia con la glicolisi ma procede in modo diverso. Non è efficace quanto la respirazione perché la maggior parte dell’energia rimane nei prodotti di scarto (vengono prodotte solo 2 ATP)
- fermentazione lattica: con una sola reazione piruvato viene trasformato in acido lattico
- fermentazione alcolica: due reazioni (decarbossilazione → formazione di acetaldeide e riduzione → produzione di etanolo e ossidazione NADH
- fermentazione acido mista: produce miscela di etanolo, acido lattico, succinico, formico e acetico a partire da fosfoenolpiruvato Vie metaboliche dei lipidi: catabolismo inizia con enzimi lipasi (idrolizzano lipidi con 3 H2O producendo glicerolo e 3 catene acidi grassi). Glicerolo viene fosforilato con ATP e viene poi inserito in step 5 glicolisi, acidi grassi vengono ossidati con produzione di NADH e FAD2H (vanno poi in trasporto el.) Acidi grassi vengono poi accorciati e gli viene aggiunto CoA, quando arrivano ad avere solo due atomi C diventano acetil CoA e entrano nel ciclo di Krebs Vie cataboliche delle proteine: prima cosa idrolisi grazie a enzimi secreti (proteasi). Proteine vengono demolite in aminoacidi in modo da poter entrare nella cellula. Quando ci arrivano subiscono deaminazione e vengono convertiti in acidi organici per poi entrare nel ciclo di Krebs
● Fotosintesi
Due tipi di fotosintesi: ossigenica (produzione ossigeno come materiale di scarto) e anossigenica (no produzione ossigeno nè utilizzo acqua) Negli eucarioti clorofilla contenuta nei cloroplasti, mentre nei procarioti direttamente nella membrana (ripiegamenti detti tilacoidi). Molecole di clorofilla si assemblano e si associano a proteine a formare fotosistemi (assorbono energia luminosa e utilizzano reazioni redox per stoccare energia in molecole di ATP e potere riducente in NADPH). Fotosintesi contiene anche step luce-indipendenti che producono glucosio. Step luce-dipendenti Quando luce colpisce fotosistemi si crea flusso di elettroni fino a clorofilla centrale (centro di reazione). Molecole di clorofilla vengono eccitate e tornano allo stato normale in tre modi: emissione di luce o calore, eccitazione di molecola adiacente o passaggio di elettroni da una molecola all’altra (ausilio di accettatore e donatore). Fosforilazione (produzione ATP) può essere:
- ciclica → e- trasmessi dal centro di reazione a diversi accettatori per poi tornare al centro di reazione (funge da accettatore finale, spesso metallico). Energia liberata viene utilizzata per pompare protoni all’esterno creando gradiente di protoni che serve per sintetizzare ATP.
- non ciclica → usata da piante, alghe, protisti e alcuni batteri; serve acqua e per ogni molecola si formano 2 e-, 2 protoni e O2. Elettroni vengono traslocati nei fotosistemi, eccitati dalla luce e passano da accettatori che gli abbassano livello energetico consentendo ai protoni di entrare contro gradiente nella cellula. Elettroni arrivano al fotosistema I, vengono rieccitati e poi passano di nuovo ad altri accettatori. Alla fine arrivano alla NADPasi che li usa per creare potere riducente sotto forma di NADPH a partire da NAD+. Il gradiente creato serve per produrre ATP. Step luce-indipendenti Utilizzano ATP e NADPH creati in precedenza e avvengono nel ciclo Calvin-Benson in 3 fasi:
- Fissazione del CO2 → 3 molecole di RuBP si legano a 3 molecole di anidride carbonica a formare 6 molecole di acido fosfoglicerico
- Riduzione → le 6 molecole vengono fosforilate e ridotte consumando 6 ATP e 6 NADPH.
- Rigenerazione di RuBP → 5 molecole a 3 atomi di C non escono dal ciclo ma formano le 3 molecole di RuBP che reagiranno con CO2 (uso di 3 ATP) ogni giro del ciclo esce 1 molecola di G3P, 2 di queste si uniscono a formare la forma fosforilata del glucosio , nell’ultimo step c’è defosforilazione del glucosio Fotosintesi ossigenica → produce glucosio e ossigeno e consuma acqua e CO Respirazione ossigenica → produce acqua e CO2 e consuma glucosio e ossigeno
(avviene in tutti i casi) e si dice omologa quando avviene tra sequenze omologhe di DNA. Processo:
- inizia con taglio del DNA da parte di enzima endonucleasi (svolge la doppia elica e poi taglia)
- al taglio si legano proteine SSB per facilitare riappaiamento con il DNA del ricevente
- avviene “strand invasion”: filamento del donatore si inserisce nella regione omologa del ricevente
- a questo punto possono avvenire due cose:
- patches: se il secondo taglio viene fatto in corrispondenza del filamento già tagliato. Solo uno dei filamenti di ognuna delle due molecole è eterogeneo (composto da frammenti di DNA diversi)
- splices: il taglio viene fatto all’altro filamento (finora intonso). Alla fine tutti e 4 i filamenti risultano eterogenei ● Trasformazione Fu dimostrata da Griffith nel 1928 tramite un esperimento molto importante (vedi appunti) = processo mediante cui DNA libero viene incorporato in una cellula e determina ricombinazione genetica. Cellule che riescono ad assorbire DNA dall’ambiente sono dette competenti (competitività può essere naturale o indotta). Il DNA è molto fragile. Le cellule di solito assorbono un singolo filamento di DNA di cromosoma batterico, se questo rimane troppo tempo nel citoplasma viene degradato, mentre se viene assorbito dal cromosoma genera ricombinazione non reciproca. Se materiale genetico assorbito è un plasmidio, rimane stabile nel citoplasma. Ricombinazione omologa non reciproca :
- necessita di un donatore e un ricevente
- apertura del DNA, strand invasion → donatore va a inserirsi nella molecola ospite (anch’essa aperta) Come fa filamento a entrare nella cellula?
- DNA donatore si lega alla superficie della cellula grazie a nucleasi (permettono detrazione filamento)
- sono coinvolte altre proteine specifiche della competenza che legano il DNA proteggendolo dalla nucleasi
- DNA viene integrato nel genoma attraverso ricombinazione omologa non reciproca Sistema ingresso batteri Gram - (2 membrane) sistema di trasporto specifico composto da più proteine Sistema ingresso batteri Gram + Proteine con funzioni analoghe al gram -, ma con l’aggiunta di ComFA che è una traslocasi che accompagna DNA nel citoplasma ● Trasduzione Sono necessari virus (fagi/batteriofagi) che infettano i batteri. Sono formati da testa che contiene materiale genetico e struttura proteica. Possono avere ciclo litico (induce batterio a creare nuovi virus e porta a lisi) o ciclo lisogeno (DNA del virus si integra nel batterio senza ucciderlo e attiva il ciclo litico solo in condizioni favorevoli). Virus in grado di compiere entrambi i cicli sono detti temperati, se solo litico sono detti virulenti. Trasduzione inizia con contatto diretto tra batterio e fago, fago inietta materiale genetico e enzimi nel batterio che porta alla degradazione del cromosoma batterico e alla formazione di nuovi componenti virali. Nel citoplasma ci può ancora essere traccia di DNA batterico e può rimanere intrappolato nella testa del fago, che lo integra con il suo (viene detto cellula trasducente). Il virus ha geni batterici, ma ha mantenuto capacità di infettare (=cellula difettiva). Ci sono d 2 tipi di trasduzione:
- generalizzata : non specifica → qualsiasi frammento di DNA può entrare nella testa del fago e essere passato ad un altro ospite
- specializzata : avviene nel momento di induzione del ciclo lisogeno (ripresa del ciclo litico). specializzata perché vengono trasdotte sempre le stesse regioni del cromosoma batterico e il DNA fagico si inserisce sempre allo stesso posto nel DNA batterico. Durante l’induzione il cromosoma è in forma lineare, in seguito si circolarizza e si separa dal DNA dell’ospite, infine si replica e la cellula viene lisa facendo fuoriuscire nuovi fagi. Esistono casi rari in cui non tutto il genoma virale viene circolarizzato ma una parte rimane al batterio quindi parte dei geni batterici finiscono nei nuovi fagi. (vedi caso E. coli pag 46)
● Coniugazione Plasmidio = elemento di forma circolare in grado di replicarsi indipendentemente dal cromosoma dell’ospite.
- Possono essere incompatibili → non possono essere presenti contemporaneamente nella cellula (perché competono per inizio replicazione), vengono detti correlati
- alcuni enzimi sono detti episomi → sono in grado di integrarsi nel cromosoma e ne controllano la replicazione
- curing = perdita di plasmidio da parte della cellula (succede quando non c’è pressione selettiva per il suo mantenimento)
- Plasmidi si trasmettono tramite coniugazione con un processo replicativo (alla fine sia ricevente che donatore ne hanno una copia) (vedi esperimenti p 47) Processo:
- pilo di tipo IV consente alla cellula di avvicinarsi alla cellula ricevente formando un ponte (permette trasferimento anche di alcuni geni del genoma batterico)
- nel punto oriT il plasmide inizia a svolgersi e uno dei due filamenti passa nell’altra cellula
- allo stesso tempo viene sintetizzato il nuovo filamento nel donatore. Il batterio ricevente è detto exconiugante. La sintesi inizia con l’ enzima Tral (fa parte del rilassosoma) che taglia il DNA in corrispondenza di oriT e lo srotola. Poi attraverso replicazione a cerchio rotante avviene sintesi del DNA. Un plasmide molto studiato è il plasmide F (E.coli→ consente ai ceppi di scambiare materiale genetico) che è un episoma. Cellule che possiedono plasmide F non integrato sono dette F+, mentre quelle con F integrato sono dette Hrf. La presenza del plasmide F induce 3 cambiamenti nella cellula:
- capacità di sintetizzare il pilo
- mobilitazione del DNA cromosomico per trasferirlo ad un’altra cellula
- alterazione dei recettori di superficie (in questo modo cellula non è più in grado di comportarsi come ricevente per coniugazione) Quando una cellula è F+ si trasforma in Hrf tramite ricombinazione e può ancora sintetizzare il pilo e comportarsi da donatore con una cellula F-. La cellula ricevente però potrà diventare F+ solo se il donatore è F+ e non se è Hrf. Inserimento del plasmide nel cromosoma:
- l’inserimento avviene sempre in corrispondenza di siti specifici (IS) che mostrano omologia con la sequenza del plasmide
- in seguito si ha linearizzazione nel plasmidio (ora non può più replicarsi ma può ancora sintetizzare pilo)
- dato che ci sono diversi siti di inserzione del cromosoma, si possono avere diverse cellule Hrf (Hrf diversi trasferiscono i geni in ordine diverso e cambia anche il senso in cui i geni iniziano ad essere trasferiti: orario o antiorario). Non succede quasi mai che F- diventi F+ perché non viene mai trasferito l’intero plasmide F.
- il trasferimento avviene tramite ponti di coniugazione e porta al passaggio di alcuni geni del cromosoma batterico
- infine il pilo depolimerizza e il ponte tra le cellule scompare Sfruttando il trasferimento dei geni batterici è possibile mappare i geni e le loro funzioni (tramite coniugazione interrotta). Il plasmide F nella cellula Hrf oltre a inserirsi nel cromosoma può anche fare il processo opposto (escissione→ adesso si chiama F’) e può portare via alcuni geni del cromosoma batterico. Si possono inoltre formare cellule diploidi. - Trasposoni e trasposizione Trasposone = gene capace di muoversi all’interno del genoma; contiene brevi ripetizioni terminali invertite IR alle estremità del DNA e un gene che codifica una trasposasi (riconosce le proprie sequenze IR nel genoma, taglia il DNA bersaglio e inserisce il trasposone). Le sequenze d’inserzione (IS) sono i tipi più semplici di elementi trasponibili e non trasportano informazioni genetiche oltre a quelle necessarie per muoversi in nuovi siti. Sono lunghe circa 1000 nucleotidi che si integrano solo in siti specifici di un genoma o di un plasmide. ● Trasposizione semplice o conservativa Trasposizione:
quella del cromosoma batterico
- presenza di marcatori selezionabili (es. resistenza a qualche antibiotico) → facilitano riconoscimento e selezione dei cloni
- Vettori di prima generazione : es. pBR322 (resistente a ampicillina e tatraciclina); ha siti di taglio singoli. Fasi di clonaggio: si taglia pBR322 ed il DNA bersaglio con uno specifico enzima di restrizione. Al termine della ligazione si formano due prodotti:
- pBR322 circolarizzato cresce in ampicillina e tetraciclina.
- pBR322 ricombinante cresce solo in ampicillina, perché l’inserzione del DNA bersaglio inattiva il gene tet. → colonie di batteri che ospitano DNA ricombinante sono ampicillina-resistenti e tetraciclina-sensibili e si possono isolare indirettamente grazie alla tecnica del replica plaiting.
- Vettori di seconda generazione : contiene il gene lacZ (permette di metabolizzare lattosio). L’enzima di restrizione taglia il gene in corrispondenza del “polylinker cloning sites” (breve segmento di DNA con molti siti di restrizione differenti). Se il plasmide si richiude su se stesso il gene lacZ rimane funzionale, mentre se vi è l’inserzione del DNA il lacZ non è più funzionale. Si piastrano le cellule in un terreno contenente antibiotico per selezionare i trasformanti e per sapere quali hanno assorbito il DNA si aggiunge X-gal (se non hanno assorbito DNA diventano blu)
- Virus come vettori : viene molto usato il fago lambda → può essere modificato togliendo geni J e N (permettono di attuale ciclo lisogeno: inutile) e sostituendoli con DNA esogeno. Fasi
- isolare il DNA e tagliarlo con enzimi di restrizione alle estremità del frammento
- ligasi unisce DNA esogeno con DNA del virus (il frammento deve avere giuste dimensioni)
- si aggiungono tutti i componenti del fago in modo da formare particelle fagiche con frammento nella testa
- il fago adesso è in grado di infettare batteri Mutagenesi sito-diretta : ● Consente di causare mutazioni all’interno di uno specifico gene, e non mutazioni casuali come nella mutagenesi tradizionale. ● Dopo aver clonato un gene di interesse in un virus a singolo filamento, si sintetizza un piccolo oligonucleotide (50-70 basi) di DNA che contiene la base che si vuole cambiare, facendo poi in modo che esso si appai con la sequenza perfettamente complementare (tranne per la base/basi mutate) di un DNA a singola elica. ● Poi l’oligonucleotide può essere allungato con l’uso di una polimerasi → si crea doppio filamento che può essere inserito in un organismo per trasformazione (serve per creare proteine con specifiche mutazioni). ● Il vettore contenente il DNA mutato viene inserito in un ceppo batterico mutante incapace di produrre la proteina in questione, in modo da verificare se la mutazione abbia potuto indurre il plasmide a non produrre più la proteina o se questa viene comunque espressa. Mutagenesi a cassetta e inattivazione genica : ● serve per studiare funzione del singolo gene → si crea un mutante uguale al wild tipe tranne che per quel gene. ● Si taglia il gene con enzimi di restrizione (EcoR e BamH1 ) che tagliano nel punto E e nel punto B. Con EcoR si inserisce una cassetta resistente ad antibiotici. ● In seguito il plasmide viene tagliato in forma lineare da BamHI e inserito all’interno di una cellula che contiene il wilde type del gene. ● In alcune cellule, viene riconosciuta la regione omologa nel dei geni e ciò porta a un evento di ricombinazione omologa. Solo le cellule che riescono a crescere in presenza dell’antibiotico contengono il gene, che però è molto probabilmente disattivato. In questo modo scegliamo il gene che si vuole inattivare.
GENOMICA MICROBICA
I genomi batterici contengono quasi esclusivamente regioni codificanti, a differenza delle cellule eucariotiche il cui DNA è composto solo per il 2% da geni codificanti, mentre il resto è composto da regioni regolatrici. La genomica fa riferimento al sequenziamento, alla mappatura e all’analisi del DNA e si divide in:
- strutturale → esamina struttura fisica del genoma ( determinare e analizzare la sequenza di DNA del genoma)
- funzionale → studia i meccanismi del genoma
- comparata → pone a confronto diversi genomi per risalire alle differenze e alle affinità tra essi. Inoltre confrontando due organismi si può vedere quali aree hanno in comune e quali sono uniche. (più l’organismo è evoluto minore è la percentuale codificante del genoma). I geni che entrambi i genomi (che si vanno a comparare) possiedono sono detti ortologhi , che compongono il Cluster of Orthologus Genes ( COGs ), anche detto core genome, nucleo del genoma. C’è anche il NODG (Non Orthologus Gene Displacement), di cui fanno parte geni essenziali che sono contenuti solo in uno dei due genomi. - Sequenziamento del genoma Il sequenziamento genomico può essere realizzato con più tecniche:
- sequenziamento genomico di I generazione : non viene più utilizzato. Prevede clonaggio. Come prima cosa è necessario digerire il genoma con diversi enzimi di restrizione, ottenendo milioni di frammenti da clonare. Grazie a vettori plasmidici trattati con gli stessi enzimi si ottengono plasmidi ognuno contenente un frammento del genoma. Questi vengono poi inseriti in una popolazione batterica e la popolazione risultante va a formare una libreria genomica , che contiene quasi tutti i geni dell’organismo. Vettori:
- BAC (cromosomi artificiali batterici) → derivati dei plasmidi F, hanno sempre una regione in cui inserire il frammento
- YAC (cromosomi artificiali del lievito) → si esplicano nel lievito come normali cromosomi, ma contengono regioni dove si può inserire DNA esogeno Dopo si passa al metodo Sanger: si basa sull’uso di nucleotidi alterati (dideossinucleotidi→ nucleotidi a cui è stato sostituito un OH con un H→ interrompono polimerizzazione).
- Si considera porzione di DNA da sequenziare,
- lo si denatura (mettendolo a 94°C),
- si creano e si inseriscono i primers (conoscendo già la parte iniziale del DNA da sequenziare),
- si inseriscono nucleotidi modificati e DNA polimerasi.
- si divide DNA in 4 provette e si mette in ognuna un dideossinucleotide diverso
- avviene polimerizzazione che si stoppa ogni volta che incontra nucleotide modificati
- si vengono a creare frammenti di lunghezze diverse e con elettroforesi su gel di agarosio si riesce a sequenziare DNA
- tecnica shotgun : si clona l’intero genoma per ottenere tanti piccoli frammenti che verranno poi assemblati in una singola sequenza. poi avviene l’annotazione (analisi dei geni per evidenziarne le funzioni → si identificano codone di inizio e di stop e si sta che tra i due c’è un gene). annotazione : identificazione della proteina codificata. Si procede poi con la predizione della categoria funzionale della proteina tramite confronto con sequenze note e disponibili in banche dati. Le varie categorie geniche sono presenti in percentuali diverse all’interno del genoma → genomi più piccoli hanno per lo più capacità essenziali (es traduzione e replicazione DNA → regolati da geni cromosomici), mentre geni più grandi hanno una percentuale molto piccola del loro genoma dedicata alla traduzione e alla replicazione del DNA (sviluppano molti geni che regolano la trascrizione e la traduzione del segnale). Pangenoma : genoma esteso di diversi ceppi di una stessa specie Metagenoma : genoma di un determinato ambiente in cui vivono molte specie diverse che formano una comunità microbica
● classe V: RNA a singolo filamento a polarità negativa, che quindi non può essere usato direttamente come mRNA. Anche in questo caso serve la RNA replicasi, perché dal filamento negativo vengono prodotti filamenti positivi e da questi le proteine virali. Dai filamenti positivi ovviamente saranno poi riprodotti altri filamenti negativi che poi andranno a finire nel capside. ● classe VI: retrovirus a RNA, a singolo filamento positivo, che però a differenza della classe IV non viene direttamente usato come trascritto ma passa da un intermedio di DNA a doppio filamento. Per fare questo serve un enzima in grado di passare da RNA a DNA, creando copie di cDNA (complementary DNA). Questo enzima è la trascrittasi inversa e viene fornita dal virus stesso. La trascrittasi inversa produce copie di DNA negativo a partire da RNA positivo; vengono poi create copie dell’altro filamento e a questo punto si ha DNA completo che funge da intermedio, da cui viene prodotto RNA messaggero positivo, che viene a sua volta tradotto in proteine. Sempre dall’Inter ed io vengono prodotte copie di RNA+ che finiranno nel capside. Di questa classe fa parte il virus dell’HIV. ● classe VII: DNA a doppio filamento, ma processo diverso dalla classe I. Il genoma viene trascritto in mRNA+ che produce proteine virali e enzimi. L’RNA+ viene però anche retrotrascritto grazie alla trascrittasi inversa per produrre DNA- da cui viene poi prodotto DNA completo da inserire nel capside. Ciclo replicativo di ogni classe:
- Adsorbimento : il virus si lega a recettori sulla membrana citoplasmatica della cellula ospite.
- Penetrazione e decapsidazione : l’attacco del virus alla cellula permette l’ingresso della particella virale nella cellula ospite, dove il capside si degrada, esponendo il genoma virale
- Espressione genica e sintesi delle proteine virali : genoma viene trascritto per essere tradotto in proteine, che possono attaccarsi alla membrana citoplasmatica della cellula ospite. Spesso le proteine passano anche per altri organelli della cellula, come il reticolo endoplasmatico e l’apparato di Golgi. Vengono prodotti in questa fase gli enzimi di cui la cellula ha bisogno.
- Replicazione del genoma virale : contemporanea alla fase 3 e produce le copie del genoma che torneranno i nuovi virioni.
- Assemblaggio e maturazione dei virioni : di forma l’envelope, il capside si avvicina alla membrana in corrispondenza delle proteine virali e viene espulso dalla cellula. Nella fase di assemblaggio del capside esso passa attraverso l’apparato di Golgi e il reticolo endoplasmatico, circondandosi di proteine che in precedenza avevano aderito a questi organelli.
- Fuoriuscita dalla cellula: dei virioni maturi tramite gemmazione (esocitosi). - Casi specifici ● Virus dell’herpes : appartiene alla classe I, espressione genica in 3 tempi in cui vengono prodotte proteine strutturali → fase immediata-precoce (viene prodotto mRNA e trasportato nel citoplasma), fase precoce (vengono prodotti enzimi per replicazione genoma virale) e fase tardiva. Nel replicare il DNA virale viene prodotto un concatenamero di DNA (molecola di DNA che comprende più volte genoma virale). Il concatenamero viene poi tagliato e il DNA inserito nel capside. Il virus in questo caso passa sia dal Golgi che dal reticolo endoplasmatico, arricchendosi di membrane. ● Poxvirus : Virus di classe I (però la replicazione nel citoplasma e non nel nucleo); fornisce lui stesso gli enzimi per replicazione e trascrizione; tre fasi: quella precoce, quella intermedia (viene prodotto mRNA) e quella tardiva; le prime proteine prodotte regolano l’espressione delle fasi successive; il virus si arricchisce di membrane passando dal Golgi e dal reticolo endoplasmatico. ● Poliovirus : virus di classe I; ciclo semplice ( il materiale genetico può essere usato direttamente come trascritto); il capside non entra nella cellula, ma viene solo iniettato il materiale genetico che viene subito tradotto in un’unica poliproteina che viene poi scissa da proteasi fornite dal virus stesso →in questo modo vengono prodotte le proteine strutturali che poi andranno a comporre il capside ● Classe V : (virus influenza) Riproduzione:
- Proteina HA lega recettori sulla superficie cellulare
- Rilascio nucleocapside
- Replicazione nel nucleo
- Traduzione nel citoplasma
- Alcune proteine tornano nel nucleo per l’assemblaggio del nucleocapside
- Proteine dell’envelope inserite nella membrana del RE e trasportate poi dal Golgi
- Gemmazione ● Classe VI : (retrovirus) Ciclo replicativo:
- genoma organizzato in 3 regioni: gag (proteine strutturali), pol (enzimi virali) e env (glicoproteine del capside)
- Retrotrascrizione, integrazione, espressione genoma virale, sintesi proteine virali, assemblaggio virioni, gemmazione
- La proteina di superficie viene traslocata nel RE, transita dal Golgi e si localizza nella membrana plasmatica
BATTERIOFAGI
Come si contano i virus? Prima si creano delle piastre con batteri sensibili al virus in questione e i batteriofagi; in una parte si mettono solo i batteri mentre dall’altra batteri+batteriofagi. Le particelle virali compiranno il ciclo litico e il giorno seguente sulla placca non ci saranno più batteri perché lisati dai virus. I batteriofagi iniziano interazione con la fase di adsorbimento: il genoma virale viene iniettato nella cellula batterica; poi può proseguire con il ciclo litico (sintesi di tutte le proteine necessarie per l’assemblaggio dei nuovi virioni + lisi della cellula) oppure con il ciclo lisogeno (genoma virale si integra nel genoma batterico senza causare problemi alla cellula, fino a attivazione ciclo litico) Fasi di infezione dei batteriofagi: eclissi, fase di latenza, fase di scoppio.
- Fago T ha ciclo litico molto veloce e lo compie solo su E.Coli:
- Dopo un minuto dall’attacco, la sintesi di DNA e RNA dell’ospite cessano e inizia la trascrizione di alcuni geni fagici.
- Dopo due minuti vengono sintetizzate le prime proteine virali
- Dopo quattro minuti inizia la replicazione del DNA virale.
- Dopo 20 minuti inizia l’assemblaggio dei nuovi virioni.
- La lisi avviene dopo circa 25 minuti ed è provocata dal lisozima, codificato da geni virali Adsorbimento: avviene tramite aggancio delle proteine caudali virali ai recettori della cellula ospite. La struttura della guaina poi si contrae (a mo 'di siringa) iniettando il materiale genetico (fase molto specifica→un virus è in grado di legarsi a un solo tipo di ricettore). In assenza di un recettore questa fase non avviene. Fase di iniezione : le proteine caudali interagiscono con i polisaccaridi della membrana esterna, contraendosi e permettendo alla parte centrale della coda di entrare in contatto con la parete del batterio; poi un enzima virale crea un poro da cui il DNA virale viene spinto nella cellula. Restrizione : il batterio si difende dal virus (solo quelli con doppio filamento) attraverso endonucleasi che tagliano determinate sequenze del genoma virale mentre il cromosoma batterico viene protetto tramite metilazione. Permutazione circolare : suppongo che il genoma virale sia suddiviso in regioni A, B, C, D ... Y e Z, che comprendono l’intero genoma virale. Quando si ha la duplicazione vengono prima prodotte singole unità (che hanno già tra loro parti ridondanti), che si uniscono a formare un concatenamero contente varie volte il genoma di tutto il virus, che per essere inserito nel capside deve essere tagliato con enzimi di restrizione. Tuttavia la testa di T4 può ospitare una molecola di DNA leggermente più lunga di un intero genoma, dunque vi è la comparsa di terminazioni ridondanti. I virioni sono quindi differenti uno dall’altro, in quanto le regioni ridondanti sono diverse. - Batteriofagi temperati Sono in grado di fare ciclo lisogeno (inseriscono il loro genoma nel cromosoma dell’ospite e poi inducono ciclo litico). ● lambda: senza fibre caudali, ha genoma di DNA liberale a doppio filamento con una coda di 12 nucleotidi a singola elica (estremità cos); nella cellula batterica queste sequenze terminali complementari si associano e il DNA è rilavato in una forma circolare che contiene 48502 paia di basi.
- Alcuni virus non producono effetti riconoscibili su colture cellulari, quindi alcune sperimentazioni vanno fatte su animali (tipicamente topi). La stima quantitativa viene fatta con l’iniezione di una diluizione seriale in un certo numero di animali. Si determina poi una diluizione al punto finale, alla quale muore metà degli animali inoculati (LD50). La LD50 è la dose letale per la metà degli individui, in base alla quale si classifica la pericolosità del virus.
- Conta delle particelle virali: necessita l’utilizzo del microscopio elettronico a causa delle dimensioni dei virus. Dalla conta dei beads (piccole particelle), sapendo quanto volume avevo inizialmente riesco a conoscere la concentrazione dei virioni. ● Purificazione dei virus: 5 metodi
- Centrifugazione differenziale → una serie di centrifugazioni con finalità di isolare i virioni da tutte le altre particelle (prima si eliminano le molecole più piccole, poi le più grandi)
- Centrifugazione in gradiente di densità → si mette nella centrifuga un tubo con un gradiente di zucchero (2 soluzioni) con densità maggiore nella parte bassa e minore in quella alta. con centrifuga le particelle si dispongono in base alle loro densità: separando i vari strati si isolano i componenti
- Precipitazione differenziale → si usano sostanze che fanno precipitare sostanze organiche (es. solfato di ammonio di cui conosco la concentrazione a cui precipita il virus → la si porta a un livello inferiore in modo che precipiti tutto tranne il virus).
- Denaturazione e precipitazione dei contaminanti → tutte le molecole vengono denaturate e fatte precipitare attraverso fattori chimici e fisici. Il virus rimane nella fase acquosa e si riesce ad isolare
- Degradazione enzimatica dei costituenti cellulari → solo se il virus è protetto da enzimi degradativi come nucleasi e proteasi utilizzati per degradare le molecole organiche. Viroidi=piccole molecole di RNA circolare a singolo filamento (non sa produrre proteine quindi è dipendente dall’ospite → interferisce sulle normali funzionalità dell’ospite). Prioni=proteine capaci di generare malattie (es. mucca pazza). Non si replica autonomamente: induce le altre proteine ad assumere forma patogena
REGOLAZIONE METABOLICA
Non tutti i geni vengono espressi contemporaneamente → gli organismi devono essere in grado di rispondere a cambiamenti esterni e regolare la sintesi di macromolecole. Il controllo può avvenire sia sull’attività degli enzimi, a livello post traduzionale, sia a livello di RNA o DNA, a livello trascrizionale o traduzionale.
- Regolazione post traduzionale Regolazione degli enzimi (es. regolazione feedback). Con questo sistema quando si ha una certa concentrazione di prodotto finale esso si attacca a uno degli enzimi a monte della via metabolica, inibendo (inibizione allosterica, perché il prodotto non lega il sito attivo, ma il sito allosterico) la sintesi del prodotto stesso o il contrario. Alcune modifiche post traduzionali a enzimi implicano la formazione di legami covalenti (generalmente causati da addizione e delezione di piccoli gruppi funzionali dalla proteina → il legame modificante crea cambiamento conformazionale della proteina alterando attività enzimatica). Es. enzima glutammina sintetasi ( produce l’aminoacido glutammina). Quando la concertazione di glutammina è sufficiente nella cellula l’enzima deve essere inibito, e questo avviene con l’attacco di AMPc (AMP ciclico), che si lega con legami covalenti. Alcune proteine batteriche subiscono “protein splicing”. Molte proteine batteriche però vengono prodotte prima sotto una forma inattiva dove una sequenza detta inteina impedisce alla proteina di essere attiva. Associata poi a una proteasi, in grado di tagliare e assemblare nuovamente la proteina, viene rimossa l’inteina e la proteina diventa funzionale quando è necessaria. - Regolazione a livello trascrizionale ● Inibizione di geni che codificano determinate proteine non necessarie al momento. Per fare questo vengono usate DNA binding protein → interagiscono in modo molto specifico con alcune regioni del DNA (lavorano in coppia come dimeri o tetrameri) e sono a tutti gli effetti dei regolatori trascrizionali. ● Altri regolatori hanno una struttura ad elica-giro-elica costituito da aminoacidi in grado di formare una struttura secondaria ad α elica composta da un elica che funge da dominio che riconosce il DNA e di un’elica stabilizzante (es. enzima cl: inibitore di lambda)
● Dito di zinco : con una proteina che lega uno ione di zinco. In queste proteine vi sono almeno due strutture a “dito”, forma specifica che garantisce il legame con il DNA. ● Leucine zipper: formata da due unità con proteine che contengono regioni con residui di leucina regolarmente ripetuti (cerniera). Questi domini sono legati a due eliche di riconoscimento che sono quelle che legheranno il DNA. La parte superiore del dimero è implicata nella stabilità molecolare. Controllo negativo della trascrizione ● Avviene attraverso la repressione (spegnimento di un operone → enzimi che regolano produzione di determinate proteine vengono sintetizzati solo quando questa scarseggia; es. arginina che si comporta come corepressore) e l’induzione (processo opposto → enzima viene sintetizzato solo quando è presente il suo substrato; es. lattosio che si comporta da induttore). Tutto ciò comporta l’inibizione della trascrizione. ● L’RNA polimerasi batterica da sola non è in grado di riconoscere le regioni di DNA a cui legare per cominciare la trasduzione, infatti è associato al fattori sigma, che riconosce il promotore, la regione immediatamente a monte del gene. Nei batteri in particolare sigma riconosce due regioni: quella -10 e quella -35, numeri che indicano la posizione rispetto all’inizio del gene. Le sequenze delle regioni -35 e -10 possono essere diverse, ma in genere sono ben conservate. Controllo positivo della trascrizione ● Prevede azione di un attivatore al posto del repressore. ● es. maltosio: geni che regolano catabolismo del maltosio vengono attivati solo in presenza di questa molecola. Quando però il maltosio è presente esso si lega all’attivatore, che cambia conformazione e può legare RNA polimerasi e promotore per dare via alla trascrizione.
- Sistemi di controllo globale dei batteri Sono meccanismi di regolazione che rispondono a segnali ambientali 1) Repressione da catabolita o “effetto glucosio” Nel caso di enzimi reprensibili da catabolita la RNA polimerasi può legare il DNA che li codifica solo in presenza di un attivatore proteico del catabolita, il CAP ( proteina allosterica e si può legare al DNA solo se prima si è legata con AMPc, che viene prodotto dall’ATP con la produzione di pirofosfato) si possono presentare quattro situazioni: - presenza di glucosio → la sintesi dell’AMPc a cura dell ’adenilato ciclasi viene inibita, dunque il CAP e di conseguenza la RNA polimerasi non legano il DNA. - bassi livelli di glucosio → l’adenilato ciclasi non è più inibita: l’AMP ciclico lega il CAP e la trascrizione procede efficacemente. In questo modo viene controllato l’operone del lattosio. - non si ha nè glucosio nè lattosio→ repressore del lattosio è legato all’operone → anche se in questa situazione il cAMP lega il CAP al DNA non sarà possibile la trascrizione. - tanto glucosio e tanto lattosio → non si ha repressore legato al DNA → si ha livello basale di espressione genica 2) Risposta stringente in seguito a carenza di amminoacidi → blocco temporaneo di sintesi di rRNA e tRNA → mancanza assemblaggio di nuovi ribosomi => inibisce intera sintesi proteica. Viene indotta da due nucleotidi guanina modificati ppGpp e pppGpp , dopo che per mancanza di nucleotidi viene caricato un tRNA vuoto. Infatti proteina RelA produce tanti ppGpp e pppGpp che svolgono importante ruolo di regolatore: - inibiscono sintesi di rRNA e tRNA - Attivano operoni deputati alla sintesi degli amminoacidi mancanti Qualsiasi segnale ambientale ha la possibilità di essere regolato all’interno della cellula. Ad esempio: - Presenza o assenza di ossigeno → batterio regola respirazione aerobica o anaerobica - Temperatura → cellula risponde con shock termico - Limitazione NH3 → diverso utilizzo di azoto - Presenza composti ossidanti →stress ossidativo con attivazione di enzimi specifici che vanno a degradarli - Danni al DNA → risposta SOS da parte della cellula
