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Esperimento di ibridazione fra il gene dell'ovalbumina e il suo mRNa maturo Grazie a degli esperimenti effettuati negli anni '79, si scoprì che i geni eucariotici sono discontinui. Attraverso degli esperimenti in cui si formava un ibrido tra un gene e il suo corrispondente RNA messaggero si potevano osservare delle strutture in cui alcune regioni del Dna formavano dei loop mentre l'mRNA era lineare. Le sequenze presenti nel DNA non trovavano delle corrispondenze con le strutture dell'RNA. Maturazione del pre-mRNA Comprende tutte le reazioni che vanno a modificare il trascritto primario dell'mRNA per poterlo rendere maturo. All'interno del nucleo, il trascritto primario contenente gli introni viene maturato grazie l'aggiunta del cap al 5', l'aggiunta della coda di PoliA al 3' e in seguito vengono tolti gli introni. Alcuni RNA hanno ulteriori processi di maturazione che comprendono l'editing.
In seguito l'mRNA viene portato nel citoplasma per poter essere tradotto. All'interno della sequenza, tra la regione 5'UTR e la 3' UTR vi è la CDS (la sequenza codificante) che comprende le regioni non tradotte.
A livello di DNA, la sequenza di un gene può contenere dei tratti di sequenza interposti che non compaiono poi nel trascritto maturo funzionale che vengono chiamate introni , mentre i tratti di sequenza che, unendosi, vanno a formare il trascritto maturo sono stati chiamati esoni. I geni discontinui sono condivisi in tutti gli eucarioti. Nei mammiferi, la lunghezza media totale degli entroni è estremamente elevata rispetto a quella dell'mRNa tant'è che la percentuale delle regioni esoniche del trascritto è molto più bassa. Questa differenza è alla base dello splicing alternativo. Gli introni devono essere rimossi dal trascritto primario (hnRNA) per poter unire gli esoni e avere un mRNa maturo. Gli introni di hnRNA vengono rimossi da un complesso ribonucleoproteico chiamato spliceosoma
- Gli introni del tRNA vengono rimossi da uno splicing enzimatico Gli introni di gruppo I e di gruppo II vengono rimossi da un autosplicing, ovvero una reazione auto-catalitica derivante dallo stesso mRNA.
Diversi tipi di meccanismi di splicing Splicing degli hnRNA Per poter eliminare gli introni, deve esistere un meccanismo che permette il riconoscimento di questa sequenza e distinguerla da quella dell'esone. Nella sequenza, dopo l'esone è presente il sito di splicing 5' (o sito donatore al 5'), subito dopo è presente l'introne le cui prime basi sono sempre la Guanina e l'Uracile che hanno una frequenza del 100%. Subito dopo sono presenti le basi Adenina e Guanina e poi il sito di splicing 3' (o sito accettore 3'). Nella regione precedente al sito di splicing 3' è presente un'adenina che rappresenta il Brach point , la quale è molto importante per la reazione di rimozione. L'adenina si trova a una distanza di 20-50b. Tra il brach point e il sito di splicing 3' è presente una regione chiamata tratto di polipirimidine. Queste sequenze vengono chiamate sequenze consenso dello splicing, che consento di contrassegnare un tratto di Dna
Splicing + Editing
domenica 6 marzo 2022 18:
chiamate sequenze consenso dello splicing, che consento di contrassegnare un tratto di Dna come introne. Modalità di rimozione degli introni: 2 transesterificazioni La prima reazione di transesterificazione avviene in corrispondenza del brach point. L'adenina ha un gruppo OH legato al 2' del ribosio, il quale, grazie a una particolare conformazione, si trova adiacente alla regione che divide l'introne dall'esone. L'ossigeno effettua un attacco nucleofilo sul fosfato della prima guanina dell'introne. Di conseguenza, il legame fosfodiesterico che lega l'introne all'esone viene rotto e l'ossigeno dell'adenina si lega al fosfato della prima guanina dell'introne.
La seconda reazione di transesterificazione avviene a partire dal gruppo OH libero dell'estremità 3' dell'esone che effettua un altro attacco nucleofilo sul fosfato del legame fosfodiesterico che divide l'esone e l'introne. Si forma quindi un nuovo legame fosfodiesterico.
La rimozione avviene tramite due reazioni di transesterificazioni, ovvero la simultanea rottura e formazione di un legame fosfodiesterico che non richiedono energia. I prodotti di queste reazioni sono: un introne a cappio (lariat), in cui l'adenina è coinvolta in tre legami fosfodiesterici (i due legami iniziali, il terzo legame sul carbonio 2' dello zucchero con l'estremità 5' dell'introne) e un esone tagliato. Spliceosoma Le reazioni avvengono grazie a un complesso ribonucleico chiamato Spliceosoma. Questa è composta da particelle chiamate snRNP U1- 6. (RNA nucleari). Queste sono costituite da una molecola di snRNP associate a proteine. Alcune proteine, quelle Sm, sono comuni a tutti, altre sono specifiche per le varie snRNP (prp, precursor rna processing). Molti snRNA sono importanti perché riconoscono dei siti specifici mediante l'appaiamento di una regione complementare. L'u12 è uno spliceosoma composto da U11- U12 - U5- U4- U6, è presente solo nello 0,5% dei geni e sono importanti perché vanno a riconoscere le estremità AU e AC degli introni. Proteine Accessorie Formazione del complesso E/d'impegno (contiene solo U1) : La particella U riconosce l'estremità 5' dell'introne grazie al fattore di splicing ASF/SF2 che si lega sull'RNA e lega contemporaneamente la particella U1 aumentando l'affinità. All'altra estremità si lega un altro fattore accessorio costituito da due subunità U2AF 65+ (sono le dimensioni delle singole proteine) che si legano sia al sito di splicing 3' che al tratto delle pirimidine. Contemporaneamente, la proteina Bratch point binding protein lega la pirimidina.
Complesso A/pre-spliceosoma: Si ha la dissociazione della proteina BBP e il legame della seconda particella dello spliceosoma U2. L'adenina quindi cambia conformazione.
Nell'assemblaggio, intervengono altre proteine accessorie che coadivuagono le particelle dello spliceosoma. Come si assembla lo spliceosoma nei siti. U1 riconosce e si appaia con l'estremità 5' dell'introne, in particolare, si lega alle prime basi G U. Il sito di ramificazione viene riconosciuto prima da BBP e poi da U2 che si appaia alla sequenza che circonda l'adenina. Tuttavia, si forma un breve tratto di doppio filamento dal quale l'adenina sporge. Questo è fondamentale per la prima reazione di transesterificaizone. U2AF riconosce il tratto di polipirimidine e il sito di splicing 3'. a. Nella formazione del complesso B, U2AF viene dissociato e si aggiungono al complesso U4-U5-U6 legate insieme. Questo legame provoca un cambiamento nell'introne, e legando contemporaneamente U1 e U2, si ha l'avvicinamento dei due siti che devono interagire tra di loro. Di conseguenza, U1 viene rilasciato e U6 prende il posto nella giunzione tra l'esone e l'estremità 5' dell'introne. In seguito anche U4 si distacca e si forma il Complesso C (U2-U5-U6), ovvero il complesso attivo che porta alla formazione delle due reazione di transesterificazione. b. Riconoscimento di sequenze : Alcune sequenze vengono riconosciute dagli smRNA che hanno delle sequenze complementari.
Si può dividere il processo in due stadi: gli elementi dello spliceosoma si vanno a legare al sito di slicing 5', al batch point e al tratto di pirimidine
ESS-ISS intronico. Questa sequenza, in seguito al legame di una proteina reprime la selezione del sito di splicing. Questo repressore, quindi, è scarsamente presente quindi il sistema di splicing si lega sul sito di splicing rimuovendo l'introne. Nel secondo tipo cellulare , il repressore è presente in grandi quantità e si potrà legare alla sequenza silencer facendo in modo che il sistema di splicing non possa legarsi e, di conseguenza, l'introne farà parte del trascritto.
Quando è presente un enhancer vicino a un sito di splicing minore (minore affinità per l'apparato dello splicing) in cellule in cui non è presente l'attivatore, il sito di splicing non viene riconosciuto e l'introne rimane nell'mRNA
Se è il contrario, l'enhancer viene attivato e, in seguito al legame, si ha l'eliminazione dell'introne
Lo stesso motivo può fungere sia da attivatore che da repressore in funzione della sua localizzazione esonica o intronica.
Lo stesso motivo, anche nella stessa localizzazione intronica, può avere attività differenti in diversi geni (mostrati con un colore diverso).
L'attività dei motivi di regolazione dello splicing dipende dal contesto: Lo splicing alternativo determina il sesso in Drosophila La determinazione del sesso, ovviamente, è data dal numero di cromosomi sessuali rispetto agli autosomi. Nelle femmine ci sono due cromosomi X per due autosomi contro un cromosoma X nei maschi. Questa differenza, di base, porta ad avere un eccesso di attivatori trascrizionali trascritti dai geni sis-a e sis-b (nei maschi vengono repressi dalla presenza di dpn, una proteina che agisce da repressore trascrizionale). Solo nelle femmine, viene attivato il promotore early (Pe) che porta alla trascrizione di un pre-mRNA, il quale subisce poi uno splicing che genera una proteina chiamata Sxl. Quindi abbiamo la proteina sex lital presente soltanto nelle femmine, questo andrà ad influenzare una serie di eventi di splicing alternativo a cascata.
- Nel trascritto primario del gene Sxl sia nei maschi che nelle femmine , vengono messi Questo perché - > Mentre all'inizio la trascrizione del gene Sxl avviene solo nelle femmine, nelle fasi successive in realtà viene riconosciuto l'altro promotore di mantenimento e questo sia nelle femmine che nei maschi, quindi la trascrizione avviene in entrambi gli organismi. Tuttavia nelle femmine, la presenza della proteina già prodotta dal trascritto precedente, è in grado di andare ad influenzare lo splicing dello stesso trascritto di Sxl.
Nel trascritto primario del gene Sxl sia nei maschi che nelle femmine , vengono messi in evidenza i due esoni e gli introni. Al centro degli introni c’è un sito di splicing 3’ alternativo.
Nel trascritto maschile , nelle cellule maschili, questo trascritto subisce lo splicing e questo sito di splicing 3’ alternativo viene riconosciuto quindi una regione dell'introne viene inserita all'interno del trascritto maturo.
Nelle femmine , invece, la presenza della proteina Sxl tradotta dal trascritto precedente agisce da repressore dello splicing, cioè si va a legare ad un sito Silencing intronico ed in questo modo blocca il riconoscimento di quel sito di splicing 3’ facendo avvenire lo splicing tra i due esoni caratteristici.
La differenza nel trascritto maturo è che nei maschi è presente una piccola regione dell'introne, l’ introne contiene al suo interno un codone di stop quindi la traduzione di questo mRNA produce una proteina tronca che non è funzionale. D'altra parte, invece, l'evento di splicing avvenuto nelle femmine porta alla produzione di una proteina Sxl matura e funzionante. Perciò continua a verificarsi la situazione in cui nelle femmine è presente la proteina Sxl, mentre nei maschi continua a non essere presente a causa di questo evento di splicing alternativo. Quindi la proteina Sxl prodotta, continua ad influenzare lo splicing alternativo del proprio mRNA e allo stesso tempo va a influenzare lo splicing alternativo di un altro gene che si chiama gene Tra. Anche in questo caso il gene Tra è trascritto sia nei maschi che nelle femmine , però anche in questo caso è presente un sito di splicing alternativo, definito regolato, ma lo stesso nel caso dei maschi l'assenza di Sxl porta un certo evento di splicing che include un tratto di introne, mentre delle femmine la presenza della proteina impedisce il riconoscimento di quel sito di splicing e quindi l’introne non viene inserito nel messaggero maturo. Di nuovo questo porta, nel caso dei maschi alla produzione di una proteina non funzionale di nuovo a causa della presenza di un codone di stop all'interno dell'introne; mentre nelle femmine verrà prodotta la proteina Tra. La proteina Tra agisce da attivatore dello splicing Nelle femmine , la proteina Tra funziona da attivatore dello splicing , quindi formando un dimero con un'altra proteina che si chiama Tra-2, si va a legare su un enhancer di splicing esonico e quindi favorisce la selezione di un determinato sito di splicing;
Nei maschi l'assenza della proteina Tra fa sì che questo esone centrale non venga inserito perché non è presente Tra. Quindi in questo caso questo porterà a 2 proteine, che vengono entrambe tradotte e non ci sono siti di stop della traduzione, però sono due proteine diverse a causa della presenza di due esoni diversi. Perciò le due proteine hanno le estremità ammino-terminale identiche ed le estremità carbossi terminale diverse.
Anche la proteina Tra va ad influenzare lo splicing e in particolare lo splicing di un gene che si chiama dsx (double sex), trascritto sia nei maschi che nelle femmine. La differenza è la presenza della proteina Tra che è presente solo nelle femmine. Queste due proteine vanno ad agire favorendo lo sviluppo del maschio in un caso e lo sviluppo della femmina nell’altro caso - > sono attivatori e repressori trascrizionali dove nel caso del maschio vanno a reprimere i geni femminili e nel caso della femmina vado a reprimere i geni maschili e ad attivare quelli femminili. Quindi si tratta di 3 eventi di splicing alternativo a cascata che portano allo sviluppo o dei maschi o delle femmine. Quindi tre esempi di proteine che andando a legarsi alle loro specifiche sequenze sul messaggero, sono in grado di influenzare l'evento di selezione del sito di splicing. Quando avviene lo splicing? Lo splicing si verifica più frequentemente co-trascrizionalmente perché molte delle proteine e dei complessi che partecipano alla splicing vengono reclutate dalla coda carbossiterminale della subunità maggiore del RNA polimerasi sulla base dei diversi stati di fosforilazione. Splicing effettuato da introni autocatalici Gli introni sono in grado di effettuare lo splicing senza l'intervento dello spliceosoma o di altri enzimi. Il primo introne scoperto, di gruppo I, è stato il primo RNA autocatalitico. Struttura secondaria degli introni da autosplicing di tipo I Gli introni da autosplicing di tipo 1 sono lunghi fra i 250-500 nucleotidi , sono presenti in una
convalidato anche da un'analisi di tipo strutturale che ha portato un’analisi molto dettagliata della struttura secondaria e terziaria e della regione dello spliceosoma formata da U6, U2 e l’introne e la regione formata tre il dominio 6 ed il dominio 5 degli introni di gruppo 2 che sono quelli che fanno parte del complesso catalitico ed è stata notata questa somiglianza strutturale a livello di queste due regioni. Quindi questo ha fatto proporre che gli introni di gruppo 2 siano sostanzialmente dei precursori dello spliceosoma e che quindi sia nata questa come una reazione basata su un attività catalitica dell’RNA e che poi si sia evoluta nella formazione di un complesso di cui fanno parte anche le proteine, ma che la reazione vera e propria sia basata proprio su un attività catalitica delle RNA. Editing
- La deamminazione sito-specifica
- l’inserzione o delezione di residui di Uridine Per editing si intende un cambiamento dell'informazione genetica, con sostituzione o inserimento di particolari nucleotidi a livello dell’mRNA, senza quindi che venga modificata la sequenza sul DNA. I meccanismi più diffusi che portano all'editing sono due: Apolipoproteina-B di mammifero (29 esoni) La deaminazione è stata scoperta studiando l’apoliproteina-B nei mammiferi. Questa è una proteina il cui gene contiene 29 esoni. Nel fegato , l’mRNA, dopo lo splicing, non subisce nessun’altra modifica e quindi l’mRNA viene tradotto ed in questa posizione si ha l'inserimento di una glutammina. La glutammina è una funzione specifica di trasporto del colesterolo e dei trigliceridi endogeni.
Quando lo stesso mRNA viene espresso nell 'intestino, subisce questa reazione di Editing , cioè una deaminazione sito-specifica proprio in corrispondenza di questo codone CAA. In questo codone la Citosina subisce la deaminazione, trasformandosi in Uracile. Il cambiamento della tripletta del codone CAA in UAA , inserisce un c odone di stop (UAA è un codone di stop). Di conseguenza, l’mRNA verrà tradotto portando la produzione di una proteina che fino all’esone 25 è identica a quella espressa nel fegato, nell’esone 26 invece compare il codone di stop , quindi la traduzione termina in quel punto.
Perciò, viene prodotta una proteina più corta che però è attiva e svolge una funzione diversa rispetto all’altra, ovvero trasporta i lipidi nell'intestino. La reazione che si verifica: l'enzima responsabile di questa modifica si chiama citidina deaminasi e rimuove il gruppo amminico della citidina, trasformandola in uridina. All’interno dell’ esone 26 , il codone 2153 è rappresentato da un codone CAA che codifica per la glutammina. Questo mRNA viene sottoposto a splicing e ha un destino diverso in dipendenza del tipo di tessuto in cui viene espresso: Editing a carico dell’Adenina La deaminazione da parte di un enzima che si chiama adenosina deaminasi di RNA (ADAR), trasforma l'adenina in Inosina. Quindi, al posto del gruppo amminico viene inserito un ossigeno. L'Inosina è una delle basi rare che può essere prodotta per modificazione nell’RNA. Questo è stato studiato soprattutto sull’mRNA del recettore del glutammato. Si è visto che in una posizione particolare, un’ adenina viene riconosciuta dall'enzima ADAR che la va a modificare in inosina. Al fine di questo riconoscimento è importante la formazione, nell’mRNA, di questa struttura secondaria e parliamo dell’mRNA primario perchè contiene ancora l’introne. Qquesto suggerisce che l’ editing debba avvenire prima dello splicing perché possa formarsi questa struttura secondaria che viene riconosciuta dall'enzima ADAR che va a modificare questa particolare adenina. La presenza di una Inosina, genera una modificazione nella lettura durante la traduzione perché può formare dei legami con tutte e tre le altre basi azotate. Tuttavia, l'Inosina viene letta come una Guanina e di conseguenza si lega a una Citosina. Di conseguenza, viene prodotta la modificazione dell'amminoacido glutammina in un amminoacido arginina , il quale si trova a contatto con la membrana e le sue proprietà funzionali alternano la
quale si trova a contatto con la membrana e le sue proprietà funzionali alternano la permeabilità della membrana nei confronti del calcio. Editing dovuto all'inserimento di residui di uridina
- Una regione ricca di poli U Un’àncora , che è una sequenza complementare ad una porzione della regione dell'mRNA
- L a regione vera e propria dell’Editing Il caso più studiato è quello del gene per la citocromossidasi 2 nel Gene coxll. Viene definito criptogene perchè non veniva identificato in quanto la sequenza sul DNA non corrispondeva alla sequenza della proteina che veniva studiata. Questo perché nella sequenza della proteina, e quindi dell’mRNA dal quale era stata tradotta, erano presenti delle U aggiuntive rispetto alla sequenza presente sul DNA. Fu scoperto che, una volta trascritto il gene, veniva modificato attraverso questo meccanismo di editing che prevede l'intervento di una molecola di RNA che viene detta RNA guida. Nell’RNA guida si distinguono 3 regioni: RNA guida si appaia con l’mRNA nella regione àncora quando non trova la complementarità sull’mRNA e forma dei balg in corrispondenza delle uridine mancanti.
- Una endonucleasi riconosce questo particolare tratto di doppio filamento
- Taglia in corrispondenza dell'mRNA Nello spazio in cui l’mRNA è stato tagliato vengono aggiunte delle U grazie ad un enzima che sfrutta l’appaiamento con l’RNA giuda. Siccome nell’RNA giuda sono sempre presenti delle Adenine nei punti di mis-match , sull’mRNA verranno aggiunte delle U da un enzima che si chiama Uridilil-transferasi 3’ terminale.
Alla fine una ligasi si unisce i terminali 5’ a quelli 3’ del messaggero e quindi la sequenza corretta è quella definita da questo RNA guida che attraverso l’appaiamento va a determinare in quale punto esatto dovranno essere inserite le U.
Come funziona? Si è pensato per tanto tempo che l'editing fosse un processo raro, a scarico solo di pochi geni, MA gli ultimi dati ottenuti grazie alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione ,che sono tecniche di sequenziamento che sono state applicate ai trascritti, ai trascrittomi, ed hanno permesso di identificare tantissimi mRNA che subiscono l'editing e quindi che non hanno una corrispondenza con la loro sequenza di DNA, MA che vengono modificate proprio grazie a questi meccanismi. Import ed export di macromolecole attraverso la membrana cellulare e nucleolo Tutti gli RNA che vengono prodotti durante la trascrizione subiscono una serie di modifiche: Una volta che sono stati modificati possono andare a svolgere la loro funzione e per fare questo molti devono attraversare la membrana nucleare o devono spostarsi dal nucleo verso il nucleolo. Quindi c'è un tutta una serie di spostamenti, cioè di Import ed Export di macromolecole attraverso la membrana nucleare e dal nucleo verso il nucleolo o verso l'esterno. Perciò piccole molecole fino ad un massimo di circa 40 kDalton, può passare per semplice diffusione passiva ma complessi di dimensioni maggiori passano attraverso il poro nucleare con un meccanismo finemente regolato e che richiede l'intervento anche di altre proteine per mediare questo trasporto. Gli spostamenti che vanno dal nucleo verso Il citoplasma interessano per esempio le proteine, i tRNA, gli snRNA. Gli snRNA che vengono prodotti nel nucleo ma alcune delle particelle devono essere trasportate all'esterno per completare l'assemblaggio della particella snRNP, per poi rientrare all'interno del nucleo. L’rRNA, lo stesso, l’RNA viene prodotto all'interno del nucleolo e le proteine ribosomiali che vengono prodotte nel citoplasma devono rientrare nel nucleo e poi nel nucleolo dove avviene il completamento dell'assemblaggio dei ribosomi e c'è la fuoriuscita delle subunità ribosomiali dal nucleo verso Il citoplasma. Quindi devono avvenire una serie di passaggi. Molti di questi avvengano attraverso il complesso che è definito complesso del poro nucleare. Il complesso del poro nucleare Si trova immerso all'interno della membrana che media quindi il passaggio delle grosse
