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originali animale) DNA/AN modifica il corredo genetico della cell, diventa “transgenica” DISTRIBUZ GEOGRAFICA TRIALS: I) USA II) EU III) ASIA
Terapie cellulari e molecolari
AA 23-24 Prof. Finotti
1) Prodotti Medicinali per terapie avanzate (ATMP)
1.1 Cosa sono gli ATMP e in quali categorie sono suddivisi Ultimi anni: sviluppo nuova categoria di farmaci basati su materiale genetico, cellule e tessuti. ATMPs (Advanced Therapy Medicinal Product): prodotti medicinali per terapie avanzate 3 TIPI:
- P. MEDICINALI DI TERAPIA GENICA/ GTMP Farmaco è DNA RICOMBINANTE Contengono geni che portano un effetto terapeutico, profilattico o diagnostico Include tecniche di EDITING GENOMICO es. CRISPR-Cas
- “ DI “ CELLULARE SOMATICA/ sCTMP Uso preparato con CELLULE VIVE Contengono cell/tessuti manipolati x cambiare caratt biologiche; NON destinati a essere usati per le = funz CELLULE MANIPOLATE: fatti cambiamenti (aggiunta di seq nel genoma, prelevo e infusione cellule in zona ≠ da quella di origine es. cell ematopoietiche infuse nel cuore) NO manipolaz: trasfusione di sangue, trapianto di midollo 3 TIPI DI CELLULE: AUTOLOGHE (ricevente e donatore =); ALLOGENICHE (d e r ≠); XENOGENICHE (donatore è Uso di CELLULE STAMINALI ADULTE, o del nostro corpo o di donatore o coltivate in lb, in grado di differenziarsi in tessuti ≠
- “ DI INGEGNERIA TISSUTALE/TEP ORGANOIDI/TESSUTI OTTENUTI IN LAB x rigenerare/riparare/sost un tessuto umano es. cute, ossa, cartilagine, cornea Prelevo cell da paziente Metto in lab Creo cute art Reinserisco nel paziente 1.2 Le fasi di sviluppo di un farmaco per terapie avanzate A) STUDI PRE-CLINICI
- STUDI SENZA MODELLI CELLULARI: modelling molecolare
- MODELLI CELLULARI/ IN VITRO (su cell immortalizzate in lab): trasfezioni, tossicità
- “ “/ EX VIVO: prelevo cell da paziente, metto in lab, faccio studi
- “ ANIMALI/ IN VIVO: prima degli studi clinici B) STUDI CLINICI
- Richiesta autorizzazione COMITATI ETICI nelle strutture sanitarie in cui si svolge studio
- 3 FASI fino a Autorizzaz in commercio: solo x farmaci con efficacia risp a quelli esistenti Data da EMA (Agenzia Europea per i Medicinali)
- VALUTAZIONE ATMP: CAT (Comitato per le terapie avanzate)
- Regole: GMP (good manufacturing practice); GCP (good clinical practice); GLP (good lab “) TERAPIE AVANZARE IN EU E IN ITALIA FARMACI ORFANI: medicinali usati x diagnosi, prevenzione, trattamento di MALATTIE RARE MALATTIA RARA: NON colpisce + di 5 persone ogni 10.000 abitanti (β-talassemia, fibrosi cistica)
2) Terapia genica - Introduzione
2.1 Che cos’è la terapia genica DEFINIZIONI: Molte patologie NON trattabili con terapie tradizionali: malattie genetiche MONOGENICHE (mutaz di 1 gene), EREDITARIE, A FENOTIPO REC es. b-talassemia, fibrosi cistica, distrofia muscolare, emofilia 2.2 Panoramica sulle patologie bersaglio TRIALS CLINICI: I) ONCOLOGICHE II) MONOGENICHE. III) CARDIOVASCOLARI x concetto monetario: cancro e cuore patologie + diffuse NUOVI TIPI DI PAT TARGET: A) MULTIFATTORIALI (cardiovascolari e neurodegenerative, diabete) B) TUMORALI; C) INFETTIVE (AIDS, epatite B) D) ACQUISITE (traumi, ischemie) ALLARGATA: inserimento di materiale genetico in cellule vitali, isolate o nell’org RISTRETTA: “ che prevede la modifica del DNA. Secondo questa vaccino a mRNA è terapia genica
x VIA SISTEMICA (es. iniez endovenosa) IN SITU: intratumorale x tumori localizzati, inalaz con aerosol x patologie dell’app respiratorio, iniez sottocutanea o elettroporaz x vaccinaz A) INIEZ X VIA SISTEMICA dell’AN terapeutico (DNA es. vettore plasmidico, mRNA es. vaccini per Covid, siRNA o miRNA): si inietta nel torrente circolatorio (con endonucleasi del siero e cell del sist imm es. macrofagi) B) EXTRAVASAZIONE: esce dai vasi e raggiunge l’organo target leg a rec AN in endosoma Comparto finale (nucleo x DNA o citoplasma x RNAs) TIPI DI TERAPIA GENICA: EX-VIVO: cellule manipolate esternamente dal paziente con gene IN-VIVO: inietto gene therapeutic dirett nel paziente con ≠ vie di somm 2.3 Terapia genica ex-vivo (es. Zynteglo®) e in-vivo (es. Luxturna®) A) EX-VIVO PASSAGGI: 1) ISOLAMENTO delle “Host cells” (da paziente/donatore); 2) CRESCITA in coltura 3) INFEZIONE con retrovirus (ha seq con mutaz) 4) PRODUZ di rDNA da RNA attr trascrittasi inversa 5) INTEGRAZ pr corretta
- SELEZ cell transfettate 7) REINUSIONE nel paziente ZYNTEGLO: CELLULE AUTOLOGHE CD34+ modificate con GENE β-GLOBINICO FUNZIONANTE CD34+: marcatori di superficie di cellule staminali ematopoietiche (capostipiti di cell del sangue) Medicinale x cura β-TALASSEMIA, in PAZIENTI ADOLESCENTI (~12 Y/O) FASI:
- PRELIEVO DI MIDOLLO(= prelievo di cell stam ematop) o ALTRE FONTI MOBILIZZAZ C STAM EMATOP: qualche gg prima somministro soluz x far migrare alcune cell nel torrente circolatorio; con prelievo di sangue prelevo anche c ematop, - invasivo
- ISOLO, SELEZ E COLTIVO C CON GENE TERAPEUTICO: seq di DNA che cod x β-globina
- REINFUSIONE endovenosa del paziente: c spontaneam vanno nel midollo o “CONDITIONING REGIMEN”: x far spazio alle c stam infuse, libero midollo da c normali, regime di condizionam di farmaci che uccidono una parte di cell del midollo APPROVATA da EMA nel 2019 MA da 2022 NON IN COMMERCIO x PROBLEMI DI COSTO (2.8 mln $): UE ha fatto controproposta inferiore e la compagnia ha ritirato, ora solo in USA (FDA) B) IN-VIVO Transgene somm LUXTURNA: x cura pazienti con DISTROFIA RETINICA EREDITARIA con progressiva perdita vista, dovuta da MUTAZ BIALLELICA del GENE RPE SOMMINISTRO FARMACO = seq di RPE65 corretta in un VETT VIRALE ADENOASSOCIATO in formulaz, si inietta a liv della RETINA EX-VIVO vs IN-VIVO DELIVERY: BARRIERE CELLULARI ED EXTRA” A) Endonucleasi del siero e fluidi corporei, sistema imm, interaz non spec, clearance renale, extravasaz dal torrente circ, barriera ematoencefalica, raggiungimento organi target B) Membrane citoplasmatiche e nucleari, endosomi/lisosomi, endonucleasi cellulari IN VIVO: PRO E CONTRO PRO CONTRO EX-VIVO 1) Efficienza metodiche di trasduz in vitro
- Ridotta prob di indurre una risp immune vs vettore
- Costoso
- Personalizzata
- Ottimizzaz tecniche coltura cell in vitro
- Solo x alcune patologie: x le quali si ha fonte di cell da cui poterle raccogliere (SNC difficile, sist ematopoietico + semplice) IN VIVO 1) N° illimitato di pazienti
- Molti tessuti difficili da raggiungere/trasdurre
- Difficile evitare tipi cell ≠ dalla cell target
- Possib di un’attivazione vettore da parte complem e stimolo risp imm
parte cell in stato quiescenza replicativa
C) “ ABLATIVE: NEUTRALIZZAZIONE DELL’ESPR DI UN GENE IL CUI PROD SOSTIENE FORMA PATOLOGICA.
Inibisce sintesi della pr/interferisce con pr stessa sfruttando azione diretta ac nucleico TIPI DI AN: ANTIGENE, DECOY, ANTISENSO, RIBOZIMI E DNAZIMI, RNA INTERFERENCE (si, sh, micro - RNA), APTAMERI (AN con target: proteine) MALATTIA DI HUNTINGTON: funz cell è persa per un accumulo di pr difettiva. TERAPIA: riduz espr gene mutato attr RNA D) “ RIPARATIVE: RIPARO GENICO in modo mirato e definito del difetto che origina patologia dirett nel genoma. X patologie genetiche ereditarie. EDITING DEL GENOMA/GENE EDITING/GE WITH ENGINEERED NUCLEASES (GEEN): DNA inserito/sostituito/rimosso/riparato attr NUCLEASI ingegnerizzate o “forbici molecolari”. Questa tecnica entra IN TUTTE E 4 STRATEGIE. STEPS: A) cell con gene difettoso B) trasferisco ENDONUCLEASI (tagliano DNA) + DNA TEMPLATO (ha seq corretta) in posizione specifica C) DNA tagliato: attivaz meccanismi di riparo. 3 CASI: gene 1) corretto 2) silenziato (knock-down) 3)aggiungo transgene (seq in +) al genoma
3) Metodi di trasferimento genico
EFFICIENZA DI TRASF: parametro + IMP. Ancora limita applicaz di terapia genica. Criticità: AN deve superare tutte barriere x entrare nella cellula AN: POLIANIIONE, a pH fisiologico DEPROTONATO. Deve superare memb plasmatica: LIPOFILA, IMPERMEABILE a molec POLARI 2 POSSIBILITA’: 3.1 Barriere cellulari ed extracellulari per il delivery di acidi nucleici terapeutici 3.2 Tipi di endocitosi
- FAGOCITOSI: cell eucariotiche specializzate (GRANULOCITI NEUTROFILI e MACROFAGI) internalizzano particelle grandi (>500nM) incluse cell in apoptosi/batteri. Particella internalizzata: FAGOSOMA si fonde con LISOSOMA formazione FAGOLISOSOMA: part degradata
- MACROPINOCITOSI: vacuoli si formano di continuo x INVAGINAZ MEMB; contengono ≠ tipi di soluti nell’amb extra cell comprese pr internalizzate in modo aspecifico. Destrino ~ a fagosoma. LISOSOMI: organuli sferici a contenuto acido (enzimi lisosomiali/idrolasi acide) presenti nel citoplasma, si formano da apparato del Golgi. FUNZIONE: digestione mat ingeriti da est/mat cellulari danneggiati FUSIONE LISOSOMA PRIMARIO + FAGOSOMI/ENDOSOMI = LISOSOMI SECONDARI ENZIMI LISOSOMIALI: prote-, nucle-, glicosid-, lip- asi PH ACIDO: mantenuto da POMPA PROTONICA nella membrana lisosomiale
- MEDIATA DA VESCICOLE RICOPERTE DA CLATRINA (mediata da rec): CLATHRIN COATED PITS (affossamenti della membrana) che contengono rec che si leg a pr nell’amb extrac (transferring, lipopr a bassa densità, TF, Ab) Formazione ENDOSOMA PRECOCE maturazione: “ TARDIVO fusione con LISOSOMA: digestione contenuto ENDOSOMI: vescicole che si originano x invaginaz membrana. Hanno POMPE H+ legate a ATP che acificano l’int A) ENDOSOMA PRECOCE: I che si forma, strutt tubulare e irregolar, pH=6. Molti rec si dissociano da ligandi x basso pH+riciclati verso sup cellula attr mecc trasp mediato da vescicole; B) MATURAZIONE: pH si abbassa 6 a 5= “ TARDIVO. Mat veicolato a LISOSOMA 3 DESTINI del ligando: A) “ TARDIVO; B) Rispedito in MEMBR; C) Va nell’AMB EXTRAC
- ENDOCITOSI: Sfrutto MECCANISMI FISIOLOGICI che regolano entrata di macromolecole nella cell; 2)VIRUS: Veicolo in PARTICELLE BIOLOGCHE naturalmente capaci di oltrepassare membrane
transitorio.
- CAVEOLARE: regioni ricche di colesterolo e sfingolipidi (zattere lipidiche) associate a CAVEOLINA INDIP DA REC, mat NON destinato a LISOSOMI Formazione di CAVEOSOMI: endosomi a pH NEUTRO. Finiscono nel RE/GOLGI Tipiche di alcune cellule: ADIPOCITI, ENDOTELIALI, MUSCOLARI LISCE, FIBROBLASTI FUORIUSCITA DA COMPARTIMENTO VESCICOLARE IMP evitare DITRUZ LIOSOMIALE 2 TIPI di ESCAPE LISOSOMIALE: A) DISTRUZ memb ENDOSOMI; B) PASSAGGIO ATTIVO attr membr endosomi 4 TIPI DI AN TRASFERITI A) OLIGONT: corte seq (20-25 nt) non cod a ds/ss; a DNA/RNA/analoghi (derivati con sostituzioni chimiche nello scheletro zucchero-P, ribosio e basi azotate); ≠ mecc d’az; B) MRNA: seq cod a ss; prima del vaccino Covid poco considerato xk si degrada facilmente, ora + usato C) DNA IN COSTRUTTI PLASMIDICI: molecole circ di DNA ds che esprimono gene terapeutico; scopo: produz almeno 1 mRNA x diventare pr D) DNA IN VETTORI VIRALI: vettori (virus) che entrano attr infezione virale ed esprimono gene; il + usato
- 3 Metodi di trasferimento genico: somministrazione diretta di DNA o RNA nudi AN NON DENTRO PARTICELLE. Usata x OLIGO o DNA PLASMIDICO. Aggiunti nell’amb extrac. Alcune cell internalizzano AN attr A) endocitosi mediata da clatrina; B) invaginaz semplice CELLLULE: FIBRE MUSCOLARI STRIATE (x vaccinaz genetica); CARDIOMIOCITI (x indurre angiogenesi terapeutica); CELLULE PRESENTANTI ANTIGENE APC (macrofagi, cell dendritiche cutanee): x vaccinaz genetica La vaccinazione genetica (a DNA e/o a RNA) VACCINAZIONE a DNA: Vaccino inoculato in plasmide con DNA che cod antigene. Questo espresso in modo SOMMINISTRAZ IN VIVO: iniez diretta di DNA (IM: intramuscolare, ID: “dermica), impiego di metodi fisici di trasferimento genico (gene gun, elettroporazione, dispositivi di rilascio a liv muscolare), vettori virali. VACCINI A mRNA: Ancora NO possibilità di somministrare mRNA NUDI. Vaccino vs Covid: mRNA in struttura lipidica x protez DIFFERENZA TRA VACCINI A DNA E mRNA: A) DNA: elettroporazione x creare pori nelle membrane e aumentare entrata DNA nella cellula; B) RNA: contenuto in struttura lipidica. Codificano SOLO MATERIALE GENICO, NON VIRUS. MA non provati:nessun vaccino ancora ha licenza PRO E CONTRO Semplici Poco efficienti Utilizzo x sviluppo vaccini genetici Effetto transitorio Internalizzaz limitata in 3 tipi di cellule
Metodi di trasferimento genico – fisici
Portano AN a contatto con membrana / temporanea micro-disgregaz. 6 TIPI: 1) ELETTROPORAZ; 2) SONOPORAZ; 3) MAGNETOFEZ; 4) METODI BALISTICI (gene gun); 6) JET INJECTION; 7) INIEZ IDRODINAMICA INTRAVASCOLARE N.B. NO TRASFERIMENTO DNA IN VETTORI VIRALI: non ce n’è bisogno, il virus fa da sé.
- 4 Elettroporazione Applicaz SERIE DI IMPULSI ELETTRICI x rendere permeabile in man transitoria la membrana e consentire ingresso di macromolecole grandi/cariche (DNA). Sviluppata come metodo di trasf nelle CELLULE IN COLTURA. Poi usata in vivo x trasf nella cute, muscolo, fegato e altri tessuti (rene, polmone, cuore, retina) LIMITAZIONI: 1) danno a tessuto x impulsi elettrici; 2) espressione transitoria DNA EDITING GENOMA con CRISPR-CAS9: usato x far arrivare endonucleasi+DNA in cell staminali ematopoietiche ELETTROPORAZ IN VIVO: pistola appoggiata, dà scariche e somministra DNA es. INOVIO: pistole x iniez STEPS: 1) Vaccino a DNA iniettato in muscolo/pelle 2) Elettroporaz 3) Pori temporanei nella membrana cell
- Membrana cell integra: produz antigeni della malattia cod da DNA del vaccino 5) Cell con antigene ric antigene e trasportano ai linfonodi 6) Ab o killer T-cells riescono a eliminare cellule tumorali/infette
(x internalizzaz e escape) FIBROSI CISTICA PREDOMINANTE
RIASSUNTO METODI FISICI
METODO MECCANISMO DNA NUDO
GENE GUN Part metalliche ricoperte con DNA transfettate in cel
SI
JET INJECTION Iniez locale di liquido attr dispositivo che usa alta P x forzare liq nella memb
SI
INIEZ IDRODINAMICA Iniez di grande V di soluz con DNA e innalzamento P
SI
SONOPORAZ Applicaz di ultrasuoni x aumentare permeabilità membr. Microbolle esplodono vicino membr
SI/NO
MAGNETOFEZ SPION+DNA vicino target attr campo magnetico
NO
ELETTROPORAZ Impulsi elettrici in target x micropori nella membrana
SI
4) Metodi di trasferimento genico – chimici
MODIFICO PROP dell’AN. 2 MODI:
- LEGO AN con molecole che DIMINUISCONO IDROFILIA: + lipofilo = + affine a barriere
- “ Molecole TRASPORTATE nelle cellule es. piccole seq peptidiche che si fondono co membr/rec CLASSI DI MOLECOLE CHIMICHE: A) LIPOSOMI E LIPIDI CATIONICI B) POLIMERI CAT C) PR/PEPTIDI D)ALTRO NON TRASPORTO DNA IN VETTORI VIRALI (=metodi fisici) 4.1 Lipofezione (liposomi e lipidi cationici) - Polimeri cationici A) LIPOSOMI VESCICOLE cost DA DOPPIO FOGLIETTO LIPIDICO e racchiudono CORE ACQUOSO Dim: 20nm a 1μ. Cost da MISCELA di LIPIDI CATIONICI + LIPIDI HELPER/CO-LIPIDI STRUTTURA: TESTA POLARE: all’est del liposoma e nel core + CODA LIPOFILA: rivolte tra di loro = ANFIFILICO LIPOPLEX: LIPOSOMA + AN LIPIDI CATIONICI TIPI: 1) ANIONICI (carica - ); 2) CATIONICI (+, PRINC x AN xk DNA - ); 3) ZWITTERIONICI (+ e - , carica neutra) ESEMPI: DOTMA & DOTAP. Cost da 2 CAT ACILICHE (coda) leg a GR PROPIL-AMMONIO (testa) carico +. Differiscono x coda e quantità di cariche nelle teste LIPIDI HELPER: aiutano la FUSOGENICITY capacità de lipoplex di fondersi con le membrane DOPE (zwitterionico) & DC-Chol (Chol= colesterolo nella porz idrofobica; usato in terapia genica es. LIPOFECTIN: miscela commerciale con + successo LIP CAT (DOTMA) + CO-LIPIDE (DOPE) INGRESSO NELLE CELLULE 2 MODI: A) FUSIONE DELLE MEMBRANE: rilascio DNA nel citoplasma; B) ENDOCITOSI DIP DA CLATRINA MECCANISMO FLIP-FLOP o LIPID MIXING (MESCOLANZA DI LIPIDI) MECCANISMO X ENDOSOMIAL ESCAPE nei LIPOSOMI: nec, altrimenti MATURAZ NEI LISOSOMI e DEGRADAZ INTERAZ ELETTROSTATICA TRA LIPIDI LIPOSOMA-“ ENDOSOMA: FLIP-FLOP X NEUTRALIZZARE CARICHE. DESTABILIZZAZ MEMBRANE = AN NEL CITOPLASMA LIPOSOMI FUNZIONALIZZATI Modifiche a sup del foglietto lipidico A) LIPOSOMI PEGYLATI: aggiunta di CATENE DI PEG (polietilen glicole). Detti anche STEALTH xk INVISIBILI al riconoscimento delle molecole del sist imm PEG: POLIMERO IDROFILICO (solubile in H2O) NEUTRO, NON TOSSICO (biocompatibile) PRO: 1)RIDUCE ADSORBIM ASPEC da parte PR SIERO & altro 2) RIDUCE RICONOSCIM da parte SIST IMM
- RIDUCE CLEARANCE: > EMIVITA 4) PREVIENE AGGREGAZ: formaz di complessi + piccoli B) TARGETING LIGAND: coniugaz con LIGANDI x INDIRIZZARE trasfez in det DISTRETTI C) CO-DELIVERY: coniugaz con FARMACI (AN TERAPEUTICO + MOLECOLA ANTITUMORALE) PRO: 1) Si complessano naturalmente a DNA e interagiscono con membrane cell 2) Internalizzati x endocitosi/fusione 3) DNA rilasciato nel citoplasma (escape) 4) Proteggono DNA da degradaz
A) LEG DNA
B) INTERAZ con MEMB x entrare nelle cellule A) LEG COV (forti) B) NON COV (attraz elettrostatica)
- imp x TARGETING NEL FEGATO Uso di AB MONOCLONALI O FRAMMENTI (es. Ab a ss) B) POLIMERI CATIONICI o NANOPARTICELLE POLIMERICHE ATIONICHE MOLECOLE POLIMERICHE CHE LEGANO IL DNA favorendo ingresso nella cell (NO LIPIDI). Es. PEI: POLI-ETILAMMINA, lineare o ramificata ≠ CONFORMAZIONI: LINEARI, RAMIFICATE, DENDRIMERICHE (ad albero) POLIPLEX: POLIMERO + AN Cost da GR AMMINICO PROTONABILE: assume carica + nei fluid biologici e LEGA DNA 2 TIPI TRASFERIMENTO: 1) POLYPLEX: uso solo polimero;
- MAGNETOPLEX: polimero legato su part con core di ossido di ferro. Strutt a dendrimero INGRESSO NELLE CELLULE: ENDOCITOSI – ENDOSOMA POMPA PROTONICA o PROTON SPONGE (spugna protonica): ENDOSOMIAL ESCAPE CAMBIAMENTO pH ENDOSOMA: GR AMMINICI PROTONABILI determinano ENTRATA DI H+ attr pompa protonica ATPasica. Seguito INGRESSO PASSIVO DI Cl-. AUMENTO CONC IONICO NELL’ENDOSOMA, det INFLUSSO (richiamo x osmosi) di H2O: ENDOSOMA SCOPPIA e DNA nel citoplasma. Detto pH-BUFFERING EFFECT. POLIMERI CATIONICI FUNZIONALIZZATI: CONIUGAZ CON PEG (=a liposomi) DENDRIMERI CLASSE DI POLIMERI. Molecola centrale con braccia ramificata, struttura ordinata e simmetrica.
EFFICIENZA > dei polimeri semplici
4.2 Proteine e peptidi PR con DOMINIO BASICO x CONIUGATE con AN su sup dei liposomi/nanoparticelle/polimeri cat x facilitare ingresso A) CPPs: PEPTIDI CONIUGATI con CARGO (AN, PR, Ab, DRUGS). CARGO (AN) associato con PEPTIDE attr INGRESSO NELLE CELLULE 3 modi: A) MACROPINOCITOSI B)ENDOCITOSI (CLATRINA/CAVEOLINA) C) ATTRAVERSAM SEMPLICE CLASSI DI CPPs: 1) POLIPEPTIDI POLICATIONICI: contengono alta % di aa + (ARGININA, LISINA), + usati; 2)ANFIPATICI 3) IDROFOBICI 3 TIPI: 1) DERIVATI da PROTEINE: pr TAT dell’HIV; dominio basico di aa della pr, in grado di attraversare membrane interagendo con proteoglicani 2)CHIMERICI 3) SINTETIC: OLIGO-ARGININA (cost solo da arg, lego AN) B) PEPTIDI FUSOGENICI (FP) Peptide che DESTABILIZZA MEMB dell’ENDOSOMA favorendo rilascio DNA nel citoplasma Es. GALA: PEPTIDE SINTETICO SENSIBILE a pH; promuove FUSIONE delle MEMBR LIPIDICHE e uscita AN CPPs+FP: INTERNALIZZO + ENDSOMIAL ESCAPE es. TAT+GALA C) PROTEINE DI VARIA NATURA PROTEINE ASSOCIATE con LIPOPLEX/POLYPLEX. Es. GalNAc (N-ACETILGALATTOSAMMINA) CONIUGATO con siRNA; fa parte delle ASIALOGLICOPR TRANSFERRINA: lega rec della transferrina sugli epatociti SCOPO: 1) AUMENTO EFFICIENZA ENDOCITOSI MEDIATA DA REC 2) TARGETING DNA D) ANTICORPI FUNZIONALIZZAZ liposomi/nanoparticelle/AN con LEG DIRETTO a Ab. IMMUNOLIPOSOMI: LIPOSOMA FUNZIONALIZZATO su SUP con Ab. Usati come ANTI-CANCER. È) APTAMERI AN a DNA/RNA che si legano a un bersaglio, SFRUTTANDO LA LORO STRUTTURA II (conformazione spaziale) anziché complementarietà della loro seq. NON usano leg covalenti es. struttura a stem-loop es. CPPs + siRNA/plasmide/asODN (oligo antisenso)
STRUTTURA DEL VIRIONE
2 COPIE = di RNA a cui leg pr del nucleocapside (NC), CAPSIDE e infine ENVELOPE con pr di sup (SU, determinano TROPISMO) e transmembrana (TM), poi ci sono anche pr enzimatiche (RT e IN). CICLO REPLICATIVO A) RICONOSCIM TARGET (SU/rec) e FUIONE ENV-MEMBR B) RT RNA in cDNA C)INTREGRAZ nel GENOMA OSPITE D)TRASCRIZ (RNA POL II) e TRADUZIONE ORGANIZZAZIONE GENOMA 2 REGIONI in 5’ (R e U5) e 3’ (U3 e R), che nel PROVIRUS costituiscono LTR. Ogni LTR cost da U 3 , R e U 5. U3 in 5’: prom x trascriz DNA; R in 3’: segnale poliA (termina trascriz) STEPS: A) GENOMA VIR (mRNA): MANCA LTR completo B)RT (cDN): SI FORMA LTR C)TRASCR: mRNA che funge da GENOMA o x cod PR VIRALI (GAG,POL,ENV)) 5.4 Produzione dei vettori gammaretrovirali PROTOTIPO: Mo-MLV (vir della leucemia murina di Molone). PLASMIDE: A)PBS: seq che funge da INNESCO x trascrittasi inv; B)REGIONE CENTRALE SOSTITUITA con GENE TERAPEUTICO PROCESSO: A) PLASMIDE contenente PROVIRUS del vettore retrovirale B) TRASFEZ in C di PACKAGING/IMPACCHETTAMENO: fornisco pr virali “IN TRANS” Cellula che esprime in modo stabile le altre pr del virus TOLTE dalla SEQ GENICA oppure faccio TRASFEZ di PLASMIDI ≠ (plasmide con gene terapeutico + p con gag + p con pol + p con env). C) PRODUZ di PARTICELLA RETROVIRALE INFETTIVA: strutturalmente = a wild-type, con GENOMA ≠, infettiva MA INCAPACE di REPLICAZ AUTONOMA N.B. NON uso PLASMIDE x fare TG, mi serve solo x TRASFEZ IN C di PACKAGING che produce PARTICELLA VIR 5.5 Le cellule di packaging LINEE CELLULARI IMMORTALIZZATE di ORI UMANA/MURINA. Più usate: HEK 293T o NIH 3T I LINEA ottenuta: trasfez permanente di NIH con MLV senza ψ. Ottengo linea che esprime gag, pol, env MA freq di ricombinaz con produz di RETROVIRUS REPLICAZ-COMPETENTI (RCR) troppo elevate. STRATEGIA dello “SPLIT GENOME”: separo seq x gag, pol ed env in PLASMIDI SEPARATI (gag e pol in 1, env in altro). 3 PLASMIDI: A) VECTOR: con gene terapeutico B) GAG POL C) ENV, transfettati nelle C di PACK 5.6 Metodi di implementazione dei vettori retrovirali: DOMANDA D’ESAME
- SPLIT GENOME: SEPARAZ anche di GAG e POL (env già separato) x minimizzare generaz RCR
- PSEUDOTYPING/“TIZZAZ: x AMPLIARE TROPISMO VIRALE e AUMENTARE EFFICIENZA di TRASDUZ (=TITOLO DEL VETTORE, capacità infettiva del virus x cellule, ce ne vanno di +) MODIFICO PR sulla sup dell’envelope (SU,TM) che conferiscono il tropismo. Ottengo part vir ricomb che hanno pr ≠ risp al virus in natura. Sfrutto cap di retrovir di INCORPORARE PR ENV di ALTRO VIR. Es. VSV-G: pr G sull’ envelope del virus della stomatite vescicolare (VSV): causa FUSIONE delle MEMBR CELL Pr G si lega ai fosfolipidi di membrana di AMPIO N° DITIPI CELL e innesca endocitosi. Una volta negli endosomi, si ha FUSIONE tra endosoma-virione e fuoriuscita del virione nel citoplasma. Vettori VSV-G generati in C PACK che esprimono GAG-POL, attr COTRASFEZ di 2 plasmidi: 1 col provirus e 1 con VSV-G. RISULTATO: INFETTIVITA’ 100VV >
- PRESENZA DI + DI 1 GENE (non solo quello terapeutico) ESPRIMO 2 GENI dal prom LTR SEPARANDOLI attr IRES: SITO INTERNO DI ATTACCO al RIBOSOMA STRUTTURA PLASMIDE: 5’ e 3’ LTR; SEGNALE DI INCAPSIDAM; MCS in cui inserisco gene terapeutico; IRES; EGFP: green fluorescent pr x vedere dove sono cell fluo dopo infez Viene prodotto 1 trascritto, poi i RIBOSOMI si leg in 2 punti:su PROM e IRES, esprimendo sia gene terap che GFP
- INTRODUZIONE PROMOTORE nelle LTR x dirigere espressione in modo prom-spec 2 PROM: A) LTR: funge da prom x NEO (o altro gene); B) PROM: “ x TRANSGENE, ed è TESSUTO-SPECIFICO
- VETTORI DI TIPO SIN (SELF-INACTIVATING): delez in U3 del 3’ “LTR” sull’mRNA con rimoz att PROM ed ENHANCER che poi si troverà in 5’ (all’inizio del vettore.). PROM INSERITO A MONTE DEL GENE TERAPEUTICO.
RISULTATO: in 5’ NO LTR completo dopo l’integraz nel genoma ospite (trascriz inv), ma ha solo R e U5. VIRUS INCAPACE di AFFRONTARE UN NUOVO CICLO di REPLICAZ VANTAGGI: TRASCRIZ TRANSGENE sotto controllo solo di 1 PROM SPEC (es. prom CMV); IMPOSSIBILITA’ di MOBILIZZARE il VIRUS: RIDUZ RISCHIO MUTAGENESI INSERZIONALE x attivaz di proto-oncogeni che, in seguito all’intera, si trovano a valle dell’LTR
- ELEMENTI DI REGOLAZ POSITIVA x riduz silenziamento Es. Seq LCR del gene β-globinico
- SEQ ISOLATRICI: x isolare seq da crom circostante e ridurre mutagenesi inserzionale Es. Vettore β-globinico SIN: contene gene x β-globina, LCR (regolaz +), LTR (SIN), vettore fiancheggiato da INSULATOR a entrambe LTR
- INTRODUZ SEQ REGOLATRICI POST-TRASCRIZIONALI: x aumentare stabilità dell’mRNA che deriva dal transgene, con conseguente aumento di pr prodotta da esso (aumento espr genica). 5.7 Vantaggi e svantaggi dei gammaretrovirus Trasduz efficiente Bassi titoli (se non pseudotipizzati, quasi tutti i vettori lo sono) Integraz nel genoma ospite Mutagenesi inserzionale: Durante integraz (causale) inattivaz gene oncosoppresore o attivaz oncogene Es. SCID-X1: bambini trattati con vettore, dopo qualche anno hanno sviluppato leucemia Buona cap di clonaz (6- 8 Kb) Silenziam espr genica x metilaz CpG nel prom LTR Scarsa immunogenicità Trasduz solo in cell in fase di replicaz 5.8 Strimvelis® vedo p. 16
5) Metodi di trasferimento genico - vettori virali - Parte 2
5.9 Vettori lentivirali, caratteristica che li differenzia dai gammaretrovirus Es. HIV-1 (virus dell’ immunodeficienza umana). Ha gag, pol, env, psi + GENI ACCESSORI: TAT: nec x replicaz, si lega a TAR in 5’ e promuove fase di allungamento trascr REV: interaz con RRE x trasp RNA da nucleo a citoplasma; altri coinvolti nel ciclo riproduttivo SCOPO: TOGLIERE TUTTI GENI che NON servono e fornirli in TRANS, lasciando quelli fondamentali x assemblaggio. Creati vettori di I, II, II, IV gen (sempre – geni)
- Vettori lenti di prima, seconda e terza generazione VETTORI DI I GEN: 3 PLASMIDI SEPARAZ di ENV (VSV-G) veicolat a parte. 3 plasmidi:
- P conTRANSGENE: prom, LTR in 5’ e 3’, ψ, RRE x leg con REV
- P di PACKAGING: CMV, GAG e POL, TAT, REV, GENI ACCESSORI, NO Ψ
- P che cod x pr VSV-G (nell’ envelope): x PSEUDOTYPING PROCESSO: A) TRASFEZ C PACK con 3 plasmidi; B) RACCOGLIERE PART VIR; C)INFEZ A C TARGET PROBLEMI: 1) ALTA PROBABILITÀ DI RICOMBINARE TRA LORO con GENERAZ RCL (lentivirus competenti x replicaz) xk hanno porzioni competenti. 2 )POSSIB DI MOBILAZZAZ VETTORE in seguito a CO/SUPER-INFEZ del paziente con VIRUS CORRELATI: mobilizzaz verso C NON BERSAGLIO o diffusione verso personale medico. Questo xk seq si integra col genoma, ma se paziente entra IN CONTATTO con VERO HIV, mat genetico si ricombina e mobilizza VETTORI DI II GEN: 3 ELIMIAZ GENI ACCESSORI di HIV, TRANNE TAT e REV
- TRANSGENE 2. PACKAGING senza geni accessori 3. VSV-G STESSI PROBLEMI VETTORI DI III GEN: 4 PLASMIDI SEPARAZ DI REV
- P x VETTORE di tipo SIN: TRANSGENE, prom attivo costitutivam (RSV o CMV), NO LTR VIR (deleta U3), “
- PACKAGING: NO REV 3. VSV-G 4. REV
1999: MORTE PAZIENTE con DEFICIT di OTC, trattato con vettore AV II gen. VOLONTARIO di trial. Iniez vettore con gene OTC nel FEGATO (TG IN-VIVO) al alta concentraz. MASSIVA RISP IMM che ha portato alla morte Oggi: AV di I e II usati x TG X TUMORI e VACCINAZ GENETICHE, invece della classica TG sostitutiva. 5.13 Gendicine® I TERAPIA COMMERCIALE. GT x TUMORI della TESTA e COLLO. Usa AV con seq x ONCOSOPPRESSORE p53: Ad-p53 stimola l’APOPTOSI delle c tumorali, si è vista regressione > del tumore in pazienti in combinazione con radioterapia. Terapia IN-VIVO.
- P53 inserito nel vettore 2. Vettore infetta c tumorale ed entra nel nucleo 3. C tumorale over-esprime p 5.14 Adenovirus oncolitici Virus ingegnerizzato che, dopo infez, UCCIDE X LISI preferenzialmente C TUMORALI risp normali. REPLICAZ è CANCER-SPECIFIC. Quando essce dalla cellula c’è LISI cellulare. 5.15 Vettori basati su virus adenoassociati (AAV) AAV (fam Parvoviridae): NON PATOGENI x uomo diffusi nella specie umana. NO ENVELOPE, DNA ss, 12 tipi. REPLICAZ dip da SUPERINFEZ C con ALTRO VIR oppure attr TRATTAM con AG (chimici, fisici) che causano stress genotossico/metabolico. GENOMA 2 ITR, al cui interno ci sono 2 unità trascrizionali: A)REP: cod x pr coinvolte nella REPLICAZ vir e INTEGRAZgenoma; B)CAP: pr CAPSIDE CICLO REPLICATIVO ENDOCITOSI MEDIATA DA REC: leg con rec e internalizzaz nlla cellula. 2 TIPI DI INFEZ: A) INFEZ PRODUTTIVA: conversione DNA a ds, replicaz DNA e trascriz genoma con produz pr Rep e Cap, produz di virioni e lisi cell B) “ LATENTE: vir si iNTEGRA grz a Rep nel CROM 19 , regione AAVS 1 e instaura stato di latenza. Quando poi c’è vir helper (co-infez) o stress x la cell, si attiva e scaturisce infez produttiva. PRODUZ VETTORI AAV Nei VETTORI rimangono SOLO ITR (el in CIS al gene terap) nec x funz AAV, il resto ELIMINATO. REP e CAP forniti da PLASMIDE HELPER
- PLASMIDE con GENOMA AAV: ITR, prom, gene terap, poli-A
- PLASMIDE HELPER: rep e cap + geni helper AAV
- TRASFEZ con Ca-FOSFATO a C HEK 293 (di packaging)
- LISI CELL, PURIFICAZ attr CENTRIFUGAZ con GRADIENTE DI CESIO
- RECUPERO e ANALISI frazioni: TITOLAZ mediane PCR QUANTITATIA + VALUTAZ ESPR GENE TERAP GENE THERAPY con AAV INFEZ PRODUTTIVA: replicaz vitae, lisi cell, trasduz di particelle rAAV: INTEGRAZ in MIN PARTE e CASUALE NO INFEZ LATENTE: NO INTEGRAZ xk vettori NON HANNO REP 5.16 Vantaggi e svantaggi vettori adenoassociati Derivato da virus non patogeno, con vasto spettro d’ospite Capacità di clonaz limitata (5kb) Produz preparaz concentrate NO linea cell di packaging Trasduz ad alta molteplicità: vettori originati da ≠ sierotipi transfettano ≠ tessuti Tropismo limitato ad alcuni tessuti Infez c quiescenti in vivo: c post-mitotiche e a lunga sopravvivenza Scarsa conoscenza dei mecc molecolari di replicaz Efficienti su c differenziate e fuori dal ciclo cell (cardiomiociti, fibre musc striate, neuroni, retina, epatociti) NO risp infiammatoria e immunitaria Espress prolungata (ANNI) NO silenziam genico
5.17 Vettori basati sul virus dell’herpes simplex (HSV) DNA LINEARE ds, di GRANDI dimensioni (120-250 kb) (+grande di tutti), CAPSIDE ICOSAEDRICO, TEGUMENTO (circonda capside), ENVELOPE o pericap con glicopr in sup.
- usato: HSV-1 (Herpes Simplex di tipo 1). CAPACITÀ di instaurare 2 tipi di INFEZ: PRODUTTIVA (produz part virali e lisi c infetta), LATENTE (genoma mantenuto sotto f DNA CIRC nel nucleo della c). GENOMA
- 2 SEGMENTI: UL (Unique Long) e US (short);
- SEQ RIPETUTE e INVERTITE (interne o term): TRL,S/IRL,S;
- 3 SEGNALI PAC: x incapsidam genoma nelle part virali ESPR GENICA temporalmente REGOLATA: IE (immediatam precoci: pr regolatorie); E (precoci: fat x replicaz); L (tardivi: pr strutt dei virioni) CICLO REPLICATIVO HSV- 1
- LEG con REC sup: fusione envelope con membr, entrata capside+pr tegumento
- TRASPORTO DNA vir al NUCLEO: entrata attr pori nucleari; INIZIO CICLO LITICO/LATENZA NATURALE TROPISMO x C NEURONALI: TG x patologie del SIST NERVOSO. A) INFEZ PRIMARIA: replicaz nelle c epiteliali vicino al sito di esposiz, quindi FIBROBLASTI/C EPITELIALI e MUCOSE. Instaura INFEZ PROD: virioni neosintetizzati rilasciati da c ep e penetrano nelle TERMINAZ NERVOSE SENSITIVE. TRAPORTO ASSONALE RETROGRADO da assone fino al corpo cell del neurone B) INFEZ LATENTE: persistono nel nucleo dei neuroni C) CICLO LITICO RIATTIVATO PERIODICAMENTE (x IMMUNOSOPPRESSIONE= peggioramento stato del sist imm ospite, dovuto a sbalzi termici, febbre,stress, eccessivi UV): TRASP ANTEROGRADO fino ai siti di infez primaria 5.18 Vettori competenti per la replicazione attenuati, difettivi per la replicazione, vettori ampliconi HSV-1 X TERAPIA GENICA di CELL NEURONALI 3 TIPI VETTORI:
- ATTENUATED RECOMBINANT HSV VECTORS (COMPETENTI X LA REPLICAZ ATTENUATI) RMOSSI parte di GENI NEC x REPLICAZ. Untile x propagaz transgene alle c vicine alle trasdotte. TERAPIA ONCOLITICA TUMORI (si replicano nelle c tumorali e lisi), vaccini vivi attenuati anti HSV- 1
- REPLIATION-DEFECTIVE (RD) HSV VECTORS (DIFETTIVI X REP) RIMOSSI TUTTI GENI nec x rep. Quando inoculati entrano in LATENZA e persistono x lunghi periodi
- AMPLICON HSV VECTORS (AMPLICONI) RIMOZ TUTTO GENOMA TRANNE ORI di REP e SEGALE DI INCAPSIDAM (pac)+gene terap. Forma di plasmide (circ), cap di clonaz ampia (150kb). PRODUZ: A)REPLICAZ del plasmide a ROLLING CIRCLE con formaz CONCATAMERI TESTA-CODA; B)PACKAGING: trasfez amplicone + vir helper C) Produz di vett ampliconi VETOTRI SICURI: NO RISCHI di riattivaz/complementaz/ricombinaz con HSV-1 latenti APPLICAZ RD e AMPLICONI: a Liv PRECLINICO x trasferire geni a ≠ tessuti: CERVELLO, MUSCOLO, CUORE, FEGATO (ultimi 3: trasf genic con PROP VACCINALI). Si PSEUDOTIPIZZANO (modifico pr sup x ampliare tropismo) 5.19 Vantaggi e svantaggi vettori derivati da HSV Persistenza in forma latente: espr gene dura x lungo tempo Difficili da manipolare: complessità genoma Ampia capacità di clonaz: fino a 1 5 0kb (Max raggiungibile) Scarsa conoscenza prop biologiche Tropismo x c neuronali El di patogenicità difficili da eliminare CONSIDERAZIONI FINALI CAPACITÀ DI CLONAZIONE (4kb x AAV, 8 retro, 30 adeno, 150 HSV ampliconi) Dimensione media porzione cod geni: 1.5 kb Casi particolari: cDNA grandi (gene DISTROFINA e FATTORE VIII coagulaz); obbligo di AGGIUNTA EL REGOLATIVI (TG talassemie, diabete) SEMPLICITA’ DI PRODUZ
STRIMVELIS: 1 SOOMINISTRAZ, NON RICHIEDE DONATORE (NO rischio di incompatibilità immunologica. PROCESSO: A) ISOLAM C STAM EMATOPOIETICHE dal midollo osseo. Prima di HSCS usati LINFO (facili da coltivare e trattare MA non immortali) B)INFEZ STAM con VETTORE con seq gene corretta; C)REIMPIANTO C INFETTATE nei bambini att infusione endovenosa. X migliorare attecchimento delle cell: CHEMIO a basse dosi SUCCESSO ITALIANO: collab tra ospedale SAN RAFFAELE, GSK e TELETHON. HSCS: CELLULE STAMINALI EMATOPOIETICHE ORIGINE: A) MIDOLLO OSSEO (BM): dette MIDOLLARI; B) SANGUE PERIFERICO (PB) attr MOBILIZZAZ: si trattano pazienti x stimolare migraz dal midollo nel circolo. Dette PERIFERICHE; C) “ CORDONE OMBELICALE (UCB): dette CORDONALI; D)PLACENTARE Sono MULTIPOTENTI, presenti principalmente nell’ADULTO e imp xk dalla loro differenziaz, del progenitore MIELOIDE, derivano tutte le nostre cell del sangue (eritrociti, neutrofili, eosinofili, basofili, monociti).. Sono RICONOSCIBILI xk esprimono marcatore di superficie CD34. “CD34+ cells” corrisponde alle HSCS. β-talassemia/Zynteglo® Mal AUTOSOMICA REC, + di 200 MUTAZ a carico β-GLOBINA che causano malattia, comportando DEFICIT di HbA (EMOGLOBINA ADULTA). HbA: tetramero con 2 dimeri α e 2 β, con al centro GR EME che coordina atomo di Fe x trasportare O 2. MANCA β= NO tetramero α 2 β 2 ; ACCUMULO di cat α che PRECIPITANO nel globulo rosso; DEFORMAZ dei globuli, EMOLISI (si rompono), ANEMIA del paziente e ERITROPOIESI INEFFICACE del midollo. MANIFESTAZ DOPO NASCITA xk β prodotta dopo e sostituisce γglobina = HbF (EMO FETALE) α 2 γ 2. APPROCCI TERAPEUTICI A) TERAPIE CONVENZIONALI: trasfusione di sangue ogni 15 gg. Approccio NON curativo ma allunga vita. Accumulo di Fe negli organi= abbinata a terapia FERRO-CHELANTE x eliminare Fe. B) TRAPIANTO ALLOGENICO di HSC o MIDOLLO OSSEO: RARO xk serve DONATORE compatibile. Prelevo HSC o midollo osseo da donatore e reinfondo nel paziente. Strategia CURATIVA. C) INDUZIONE FARMACEUTICA DI γGLOBINA: farmaci che riattivano nell’adulto D) TERAPIA GENICA e CELLULARE: uso HSC AUTOLOGHE, prelevate, ingegnerizzate e reinfuse nel paziente PROCESSO: 1) Produz virus terapeutico: vettore LENTIVIRALE con gene corretto della β-globina; 2)Isolo da sangue/midollo osseo cell target da paziente: cell HSC/CD34+; 3)Trasduco cell target EX-VIVO: inserisco gene; 4)Reinfondo cell trasdotte: PREPARAZ paziente x farle entrare nella loro “nicchia” ovvero il MIDOLLO ZYNTEGLO FARMACO ORFANO, TERAPIA EX-VIVO basata su LENTIVIRUS, x TDT: pazienti β-talassemici trasfusione- dipendenti, ovvero con talassemia MAJOR (+ grave). VETTORE di tipo SIN: U3 deleto, sostituito con prom CMV x cassetta di espr βglob, regione LCR (enhancer). NON + in commercio x accordo economic (vedi p) P.A.: HSC AUTOLOGHE (degli = pazienti) geneticam modificate con gene, somministrato come INFUSIONE IN VENA a dose che dip dal peso corporeo del paziente. PRIMA della erapia: CHEMIO DI CONDIZIONAM x rirmuovere cell dal midollo osseo Leucodistrofia metacromatica (MLD)/LibmeldyTM Malattia NEUROMETAMOLICA da ACCUMULO di LISOSOMI, AUTOSOMICA RECESSIVA. 1 bambino su 40mila. Causata da difetto gene ARILSOLFATASI A (ARSA): enzima nec a idrolisi dei glicosfingolipidi solfati, difetto provoca ACCUMULO di SULFATIDI (sost metacromatica) nella SOST BIANCA (MIELINA) NELLE CELL NERVOSE, che muoiono x fenomeni fibrotici e cellsuperstici hanno inclusioni tipiche. SINTMI: DANNO NEUROLOICO, DIFFICOLTA’ RESPIRAOTIRE, PARALISI e ATTACCHI EPILETTICI fino a morte. LIBMELDY LUIGI NALDINI: I SPERIMENTAZIONI su MLD con VETTORI derivanti da HIV. Collab tra San Raffaele-Telethon
CELL STAMINALI e PROGENITRICI EMATOPOIETICHE CD4+ trasdotte EX-VIVO con VETT LENTIVIRALE che cod x gene. FARMACO ORFANO, APPROVATO da EMA. C MIELOIDI derivate da HSC corrette migrano nel SNC producendo enzima ARSA, captato dai neuroni. Deficit ereditario di lipoprotein lipasi (LPLD)/ Glybera® LIPOPR UMANA: enzima coinvolto nella RIMOZ TRIGLICERIDI da sangue (metab lipidico). Patologie provoca ACCUMULO di lipidi nel PANCREAS, regime dietetico restrittivo. Farmaco contiene gene di LPL in vetore AAV. Più costoso al mondo: 1mln$, dismesso nel 2017 xk usato in 1 paziente. Amaurosi congenita di Leber/Luxturna® PATOLOGIA provoca DISTROFIA RETINICA con perdita vista, causata da MUTAZ BIALLELICA del gene RPE65. FARMACO: AAV, IN-VIVO DELIVERY: iniezione nella retina del vettore che contiene gene corretto. SMA/Zolgensma® ATROFIA MUSCOLARE SPINALE (SMA), PATOLOGIA NEUROMMUSCOLARE causata da mutazgene SMN1, che provoca riduz pr SMN nec x sopravvivenza MOTONEURONI. MALATTIA AUTOSOMICA REC. Porta a paralisi, difficoltà respiratoria e morte entro pochi mesi x forma più grave. 65 mutaz del gene SMN1, 95% paz con SMA ha mutaz che ELIMINA ESONE 7 in ENTRAMB alleli gene = si azzera pr SMN. FARMACO: AAV, IN-VIVO, a pazienti 2 anni. Ora + caro al mondo: 2 mln $. Somministraz ENDOVENOSA di sosp con vettore, SINGOLA DOSE NON SUFFIC x eff prolungato xk motoneuroni NON si dividono. Emofilia A/RoctavianTM PATOLOGIAè mal ereditaria causata a DEIFICT PR COAGULAZ, che provoca tendenza a emorragie. 2 forme: A= dip da carenza di FATTORE VIII COAGULAZ; B=associata a CROM X (donne sono portatrici sane). FARMARCO: X EMOF A GRAVE, usato in adulti SENZA Ab anti-fatt VIII e Ab anti-AAV. Contiene AAV con gene del fattore VIII, trasportato nelle CELL EPATICHE consento produz di FVIII x lungo periodo. SINGOLA DOSE (FLEBO), non dip dal peso corporeo. TG IN FASE DI SPERIMENTAZIONE (NO FARMACI APPROVATI) Fibrosi cistica: PRODUZ CANALE CFTR FUNZIONANTE PATOLOGIA: mal rara autosomica rec causata da mutaz/delez gene CFTR che cod x pr nelle c epiteliali mucose. CFTR è canale x passaggio Cl all’est cell, con secrez di H 2 O. DEFICIT: CARENZA DI CL e H 2 O NELLE SECREZIONI, provocando ACCUMULO di MUCO e OSTRUZ organi (bronchi, int). CLASSIFICAZ MUTAZIONI: 6 classi, in base a cosa determina mutaz a liv canale (I= NO produz, altre=produz MA difetti nel processar) TERAPIE: AAV, AV, PLASMIDI dentro liposomi cationici, VETT RETROVIRALI, GENOME EDITING. DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE (DMD): PRODUZ DISTROFINA FUNZIONANTE PATOLOGIA: associata a CROM X, DELEZ GENE che provoca ASSENZA di DISTROFINA. DISTROFINA: forma ponte fra CITOSCHELETRO FIBRE MUSCOLARI-MATRICE EXTRACELL x impedire rottura muscolo durante contraz. DEFICIT provoca DEGENRAZ MUSCOLARE PROGRESSIVA. TERAPIE: PROBLEMA xk GENE molto lungo LUNGO. Creaz GENI + corti che producono PR FUNZIONANTI = MINI e MICRO-DISTROFINA, in cui sono stati deleti frammenti (ROD DOMAIN) della distrofina originale. 3 COMPANIES: PFIZER, SAREPTA, SOLID. Sviluppati VETTORI AAV con MICRODISTROFINA, con prom x espr nel muscolo scheletrico e cuore, e cassetta d espr. Somministra in-vivo nelle c muscolari. TG con CELLULE STAMINALI. MALATTIE EREDITARIE TRAPIANTO DI EPIDERMIDE AUTOLOGA: 1) BIOPSIA pelle 2) ISOLAM CHERAITINOCITI 3)INSERIM GENE in CHERATINOCITI STAMINALI, attr VETT VIRALI, seguita da AMPLIFICAZ CELL CORRETTE su feeder layer x generaz EPITELIO GENETICAM CORRETTO. EPIDERMIOLISI BOLLOSA o SINDROME DEI BAMBINI A FARFALLA Pelle estremamente fragile e causa bolle dovute al distacco dell’epidermide dal dera x sfregamenti. Provocato dal MALFUNZIONAM FUNZ ADESIVE delle cellule epidermiche. EB GIUNZIONALE legata a MUTAZ PR LAMININA 5, che media adesione epidermide-derma.
Ag ESPRESSO in modo TRANSITORIO. Internalizzati da C MUSCOLARI, CHERATINOCITI, DENDRITICHE (APC). RISPOSTA provocata dalle pr espress:
- IMMUNITARIA di tipo CELL (mediata dai LINFO KILLER, CD8+ T CELL ACTIVATION): pr associate a MHC di CLASSE I su sup cell = UCCISIONE CELL INFETTE
- IMM di tipo UMORALE (ANTICORPALE): APC presentano Ag associato anche a MHC-II, ric da LINFO T CD4 HELPER, che mediano attivaz LINFO B = PRODUZ Ab PROCESSO: PLASIMDE a DNA trasfettato in A) APCs: 1)APCs che esprimono Ag viaggiano dino ai LINFONODI 2)MHC-I attivano CD8+; MHC-II attivano CD4+T –– ATTIVAZ CELL B: Ab B) CELL SOMATICHE: CELL APOPTOTICHE esprimono Ag & ATTIVAZ CELL B – Ab 6.6 Geni codificanti per anticorpi e anticorpi intracellulari (scFv, sdAb, intrabody, minibody) Ab: 150kDa, 4 cat polipeptidiche (2h,2l) con Ag-binding site nella porzione variabile, unite da ponti diS. PROBLEMA X TRASFERIMENTO GENI che li CODIFICANO. Sfrutto: REGIONI CDR (Complementary Determining Regions): 3 regioni IPERVARIABILI di VH,L che ric in man spec Ag A) INTRABODY (AB ITRACELLULARE): ScFV e Sd, si localizzano DENTRO LE CELL. Ab NATURALI: SECRETI nel siero/ESPR S SUP LINFO B. LOCALIZZAZ: citoplasma, nucleo, RE; BERSAGLI: qualsiasi pr nella cell FUNZIONI: A)BLOCCO INTERAZ tra 2 PR; B)BLOCCO LEG pr-DNA; C)BLOCCO FUNZ ENZIMA; D)RILOCALIZZAZ PR in altri compartim cell
- ScFv (single-chain variable fragment/fr variabile a singola cat) Ab INGEGNERIZZATO con 1 CAT POLIPEPT con VH,L (regioni variabili), che contengono 3 CDR e connesse da PEPTIDE LINKER (25aa). Peso: 29 kDa, 250aa tot. Possiede determinanti strutturali x leg Ag
- Sd Ab (single domain Ab/anticorpo a singolo dominio) NANOBODY: Ab cost da 1 dominio corrisp a regione con CDR di 1 CAT (VH o VL). Peso: 15 kDa N.B. ScFv e Sd NON hanno FUNZIONI EFFETTRICI (CDC: fissaz complem), LEG A REC CELL (ADCC: citotosicità cell dip da Ab) xk queste sono ASSOCIATE a REGIONE Fc degli Ab naturali. B) MINIBODY: miniAB con regione VL/H di un ScFv + regione derivata da Fc x stimolare DIMERIZZAZ di 2 cat ScFv e FORMAZ PONTI DI-S. (CH2 o CH3 dimerizzano spontaneamente). + STABILI, +ATT vs Ag Es. MINIBODY ANTI-CCR4 trasferito attr VETTORE AAV x trattam LINFOMA CUTANEO della CELL T. CCR4 è REC SOVRA-ESPRESSO sulle neoplasie cell T. Minibody ric CCR4, lega e INIBISCE la sua azione (proliferaz cell) 6.7 Geni codificanti per subunità del T-cell receptor (TCR) SCOPO: TRASFERIRE nei LINFO T geni che cod REC che li indirizzano vs Ag SPECIFICI. TCR: REC TRANSMEMBR dei linfo T, responsabile del RICONOSCIM Ag PRESENTATI da MHC (> COMPL ISTOCOMPATIBILITA’) presente sulle APC (cell presentanti Ag). ETEROTRIMERO composto da 2 CAT α e β. Ciascun cat formata da estr N-term (extracell) da:
- DOMINIO Ig VARIABILE (V): 6 REGIONI CDR ipervariabili (3 x V di ciascuna cat). Ag e MHC si legano qui
- DOMINIO Ig COSTANTE (C); 3)REGIONE TRANSMEMBRANA; 4) CODA CITOPLASMATICA. Ogni CLONE di LINFO T ha migliaia di TCR TUTTE =, SPEC x 1 Ag. Cloni che hanno SPECIFICITA’ ≠ espr TCR ≠. COMPLESSO del TCR LEG tra TCR e MHC-Ag, attiva COMPL TCR, che serve x TRASUZ SEGNALE e ATTIVAZ LINFO T. COMPL TCR cost da: TCR leg attr leg non-cov a CD3: pr x trasduz segnal, cost da ETEROTRIMERI. APPROCCIO DI IMMUNOTERAPIA ADOTTIVA TRASF in linfo T di GENI che cod CAT α e β di TCR x SPEC Ag (TUMORE) ottenuto da CLONE NATURALE di CELL T PRECEDENTEM SELZIONATO. ITER: 1)IDENTIFICO Ag; 2)ID GENE che cod x TCR che ric quell’Ag (geni ottenuti selezionando cloni di cell T in che ric Ag); 3)INSERIM TRANSGENE attr vett virali NEI LINFO T del paziente
STEPS: 1)PRELIEVO LINFO T; 2) COLTURA EX VIVO LINFO T; 3) TRASFERIMENTO GENI che cod CAT α,β del TCR che ric Ag; 4) ESPANSIONE in VITRO; 5) INIEZ nel PAZIENTE; 6)DISTRUZ C NEOPLASTICHE/INFETTATE da VIRUS 6.8 C himeric antigen receptor e cellule CAR-T (cenni): impieghi, evoluzione, esempi (KYMRIAH®) - Il concetto di targeting trascrizionale: promotori costitutivi, promotori tessuto-specifici, promotori inducibiloi/regolabili (sistema tet-on/tet-off, promotore con sequenze HRE) TCR CHIMERICI o CAR (Chimeric Antigen Receptor) FUSIONE tra ScFv & DOMINI X SEGNALI COSTIMOLATORI (CD28) & CATENA CD3ζ del COMPLESSO TCR. 3 DOMINI:
- EXTRAC/ECTODOM: regione di RIC AG (es CD19) formata da scFv. ScFv cost da 2 regioni variabili della cat pesate e leggere di Ab unite da peptide linker
- TRANSMEMBRANA: regione proteica IDROFOBICA che attraversa membrana e dà STABILITÀ al rec
- INTRAC/ENDODOM: regione di ATTIVAZ LINFO T costituito da DOM SITMOLATORIO (CD3ζ del TCR) e DOM COSTIMOLATORI (CD28) RICONOSCIMENTO Ag INDIP da MHC. CAR-T CELLS: Chimeric Antigen Receptor Cells-T LINFO T INGEGNERIZZATI che esprimono CAR, il quale RICONOSCE ALCUNI TUMORI. Linfo T mantengono MEMORIA della risp agli attacchi, spesso tumori eludono risp mimetizzandosi. Si è visto in passato che prelevando, moltiplicando in vitro, reinfondendo linfo T di pazienti malati, si riduceva il tumore. TERAPIA + PROMETTENTE VS CANCRO. CAR-T a contatto con c tumorale: RC Ag, produce CITOCHINE, UCCIDE cell tumorali e PROLIFERA = INIBIZ CRESCITA TUMORE. EVOLUZIONE CAR-T: 4 - 5 GENERAZIONI a seconda dell’ENDODOMINIO FASI DI PRODUZIONE CELL CAR-T
- PRELIEVO SANGUE: LEUCAFERESI, processo che seleziona det cell sangue;
- ISOLO E RIPROGRAMMO LINFO T: trasferisco attr VETTORI VIRALI (lenti, retrovirus) geni che esprimono CAR= ottengo CAR-T;
- MOLTIPLICAZ IN VITRO; 4) PRE-TRATTAMENTO: CHEMIO a basso dosaggio 5)INFUSIONE: CAR T ATTACCANO TUMORE; 6) MONITORAGGIO IMPIEGHI CAR-T: TERPIA CAR-T ANTI-CD CAMPO ONCO-EMATOLOGICO (tumori ematologici: leucemie, linfomi): x pazienti che NON RISPONDONO a terapie tradizionali o RICADUTA dopo trapianto di midollo Es. A)KYMRIAH: LENTI, ANTI-CD19. I terapia con CAR-T approvata; B)YESCARTA: RETRO 3 CASI su membrana LINFO T:
- TCR INTRODOTTO: ingegnerizzato, ric Ag ESPOSTO da parte MHC;
- CAR INTRODOTTO: ingegnerizzato, riconosce 1 Ag di sup;
- TCR ENDOGENO: wild-type.
7) Strategia antigéne-TFO
AN NON CODIFICANTI come AGENTI TERAPEUTICI FARMACI COSTITUITI da DNA, RNA O ANALOGHI con BERSAGLIO: AN o PR CELLULARI Sono ODN (OLIGODEOSSINT), ON (OLIGONT) e ANALOGHI (=caratt a ODN MA con MODIFICHE CHIMICHE). COMPLEMENTARI, si legano attr leg con basi del DNA cellulare. TARGET FARMACOLOGICI: DNA, RNA o PR STESSA. SCOPO: INATTIVAZ GENI; STRATEGIE ABLATIVE STRATEGIA ABLATIVA. FINALITÀ: INATTIVAZ GENICA VEDI P. CLASSI di ODN:
- ANTIGENE (TFO): oligont (deossi e ribont) e analoghi, COMPLEMENTARI a DNA;
- ANTISENSO A) ASO: “ compl a mRNA, INIBISCONO ESPR GENICA o MODULANO SPLICING; B) siRNA, miRNA: “ con FUNZ REGOLATORIA; C)RIBO e DNAzimi: “ compl a RNA e in grado di CATALIZZARNE TAGLIO.
