Genetica: Mutazioni e Variazioni Genomiche | Sbobinature di Medicina Genetica

1 LEZ 21 nov

GENETICA MEDICA

Prof. Fichera

Testo consigliato: genetica umana e medica (Neri, Genuardi), quarta edizione

Genetica Medica

Le malattie genetiche coinvolgono tutta la popolazione, sia in età pediatrica che in età più avanzata.

Nei paesi in cui le condizioni socio-economiche sono più alte, oltre il 50% dei decessi in età pediatrica è

dovuta a malattie genetiche, infatti nei paesi con condizioni socio economiche peggiori (per es. in Africa),

la mortalità infantile è associata ad altre cause. Stime prudenziali dicono che circa il 7% della

popolazione soffre di malattie genetiche. La maggior parte delle malattie genetiche, comuni nella

popolazione generale, non sono malattie mendeliane (in cui c’è un gene responsabile che segrega con

modalità matematicamente determinate, per esempio le malattie recessive devono avere tutte e 2 gli

alleli di un gene colpiti, le dominanti ne basta uno solo) ma sono malattie complesse multifattoriali (in

cui la componente ambientale e la componente genetica si sommano incidendo sull’insorgenza della

malattia). Le componenti genetiche in queste malattie multifattoriali spesso giocano un ruolo minore, è

la somma di tanti fattori genetici di rischio, che poi insieme a fattori ambientali, determina la malattia.

Struttura dei geni eucariotici

Il genoma umano ha circa 3,2 miliardi di bp e circa 20.000 geni. . Dell’intero genoma solo il 2% circa

codifica per proteine, il resto è formato da DNA non codificante.

Nel genoma umano non c’è una distribuzione omogenea dei geni. I geni eucarioti sono composti da parti

codificanti (esoni) e parti non codificanti (introni). Gli introni vengono poi escissi durante la trascrizione

mediante lo splicing.

I geni hanno lunghezze disparate: possono essere di poche centinaia di basi , come nel caso del gene

che codifica per la catena α dell’emoglobina o essere dei geni estremamente lunghi, come quello che

codifica per la titina, una proteina muscolare.

Dopo il progetto genoma umano ci si aspettava che ci fosse un numero di geni molto superiore a quello

che realmente abbiamo, questo perché gli introni possono essere scissi o meno secondo un meccanismo

diverso, che può dare delle isoforme diverse. Dunque non c’è una correlazione stretta dove un gene

porta ad una proteina ma un gene può dare luogo a diverse proteine che possono essere anche molto

diverse tra loro. Molto importante è il promotore (sito di attacco della polimerasi per la trascrizione),

difetti nel promotore possono portare a difetti nella trascrizione (abolirla o rallentarla), poi ci sono gli

enhancer che sono importanti per la regolazione dei geni, si trovano molto lontani dal gene tuttavia

riescono ad interagire con il gene grazie ai loop che si creano a livello dei cromosomi che consentono di

avvicinare il promoter all’enhancer.

La più alta densità genica si osserva nel Chr19, mentre il chr13 e Y mostrano la più bassa densità.

Variazioni genetiche

Sono cambi nella sequenza del Dna (il genoma di riferimento è quello del progetto genoma umano).

Senza variazioni genetiche non ci sarebbe stata evoluzione.

Una variazione di DNA è un cambio che può consistere a livello genetico nel cambio di una o alcune

basi, a livello genomico in pezzi in più o pezzi in meno del genoma.

Malgrado una variazione genetica possa distruggere un organismo, qualora essa avvenga in una

posizione vitale del DNA, la sopravvivenza delle specie nel lungo periodo ha bisogno di cambiamenti nel

DNA per adattarsi a nuove situazioni ambientali. Un sistema teoricamente perfetto nel mantenimento

della sequenza del DNA non avrebbe permesso l’evoluzione.

Il successo più grande per un individuo che si adatta all’ambiente è riuscire a riprodursi. Il termine fitness

definisce il successo riproduttivo di un individuo o di un certo genotipo.

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Testo consigliato: genetica umana e medica (Neri, Genuardi), quarta edizione

Genetica Medica

Le malattie genetiche coinvolgono tutta la popolazione, sia in età pediatrica che in età più avanzata. Nei paesi in cui le condizioni socio-economiche sono più alte, oltre il 50% dei decessi in età pediatrica è dovuta a malattie genetiche, infatti nei paesi con condizioni socio economiche peggiori (per es. in Africa), la mortalità infantile è associata ad altre cause. Stime prudenziali dicono che circa il 7% della popolazione soffre di malattie genetiche. La maggior parte delle malattie genetiche, comuni nella popolazione generale, non sono malattie mendeliane (in cui c’è un gene responsabile che segrega con modalità matematicamente determinate, per esempio le malattie recessive devono avere tutte e 2 gli alleli di un gene colpiti, le dominanti ne basta uno solo) ma sono malattie complesse multifattoriali (in cui la componente ambientale e la componente genetica si sommano incidendo sull’insorgenza della malattia). Le componenti genetiche in queste malattie multifattoriali spesso giocano un ruolo minore, è la somma di tanti fattori genetici di rischio, che poi insieme a fattori ambientali, determina la malattia. Struttura dei geni eucariotici Il genoma umano ha circa 3,2 miliardi di bp e circa 20.000 geni.. Dell’intero genoma solo il 2% circa codifica per proteine, il resto è formato da DNA non codificante. Nel genoma umano non c’è una distribuzione omogenea dei geni. I geni eucarioti sono composti da parti codificanti ( esoni ) e parti non codificanti ( introni ). Gli introni vengono poi escissi durante la trascrizione mediante lo splicing. I geni hanno lunghezze disparate: possono essere di poche centinaia di basi , come nel caso del gene che codifica per la catena α dell’emoglobina o essere dei geni estremamente lunghi, come quello che codifica per la titina, una proteina muscolare. Dopo il progetto genoma umano ci si aspettava che ci fosse un numero di geni molto superiore a quello che realmente abbiamo, questo perché gli introni possono essere scissi o meno secondo un meccanismo diverso, che può dare delle isoforme diverse. Dunque non c’è una correlazione stretta dove un gene porta ad una proteina ma un gene può dare luogo a diverse proteine che possono essere anche molto diverse tra loro. Molto importante è il promotore (sito di attacco della polimerasi per la trascrizione), difetti nel promotore possono portare a difetti nella trascrizione (abolirla o rallentarla), poi ci sono gli enhancer che sono importanti per la regolazione dei geni, si trovano molto lontani dal gene tuttavia riescono ad interagire con il gene grazie ai loop che si creano a livello dei cromosomi che consentono di avvicinare il promoter all’enhancer. La più alta densità genica si osserva nel Chr19, mentre il chr13 e Y mostrano la più bassa densità. Variazioni genetiche Sono cambi nella sequenza del Dna (il genoma di riferimento è quello del progetto genoma umano). Senza variazioni genetiche non ci sarebbe stata evoluzione. Una variazione di DNA è un cambio che può consistere a livello genetico nel cambio di una o alcune basi, a livello genomico in pezzi in più o pezzi in meno del genoma. Malgrado una variazione genetica possa distruggere un organismo, qualora essa avvenga in una posizione vitale del DNA, la sopravvivenza delle specie nel lungo periodo ha bisogno di cambiamenti nel DNA per adattarsi a nuove situazioni ambientali. Un sistema teoricamente perfetto nel mantenimento della sequenza del DNA non avrebbe permesso l’evoluzione. Il successo più grande per un individuo che si adatta all’ambiente è riuscire a riprodursi. Il termine fitness definisce il successo riproduttivo di un individuo o di un certo genotipo.

Le variazioni genetiche possono essere vantaggiose o svantaggiose e possono interessare la linea germinale o la linea somatica. Le mutazioni germinali possono essere trasmesse alla progenie e sono più preoccupanti di quelle somatiche. Le mutazioni somatiche preoccupano di più quando sono premiate dalla perdita dell’inibizione della proliferazione, perché danno cancro (perché di mutazioni ne abbiamo in continuazione nelle nostre cell, quindi le mutazioni somatiche non ci devono preoccupare neanche se colpiscono un gene importante, ma di più quando colpiscono dei geni che inibiscono la proliferazione). Mentre nelle germinali purtroppo basta una mutazione per portare ad un figlio affetto. Le variazioni genetiche non sono necessariamente patogenetiche ma anzi la maggior parte di loro è silente o influenza caratteristiche come l’altezza, il colore della pelle.. Come risultato di un processo mutazionale, un gene può variare tra gli individui relativamente alla sua sequenza. Le differenze di sequenza di un dato gene sono chiamate alleli. Per ogni gene ci sono 2 copie (alleli), possiamo essere omozigoti (2 alleli identici) o eterozigoti (i 2 alleli differicono).Tutti noi in condizioni non patologiche abbiamo due alleli per ogni gene, tranne nel caso del maschio per i geni presenti sui cromosomi X e Y; anche se alcuni alleli sono in comune anche fra questi due cromosomi. Quando parliamo di genotipo intendiamo un determinato l ocus genico (gli alleli presenti in un dato locus genico definiscono il genotipo di in un individuo per quel locus). Se una variante (mutazione) è presente in più dell’1% nella popolazione è chiamato polimorfismo. La variazione genetica può essere determinata da sostituzioni, delezioni o inserzioni di basi nel DNA e può riguardare regioni codificanti e regioni non codificanti. Oggi si sa che molti polimorfismi influenzano il rischio di malattie genetiche complesse: la distinzione tra mutazione e polimorfismo può dunque essere labile. La maggior parte delle mutazioni non viene conservata nella popolazione a causa o degli effetti deleteri (selezione naturale) oppure per deriva genetica. Si ha deriva genetica quando una popolazione, prima estesa su una vasta area, viene frammentata in tante piccole popolazioni che hanno casualmente frequenze geniche molto differenti; il limitato numero di individui e il loro isolamento permettono oscillazioni delle frequenze geniche estremamente ampie e casuali che possono portare alla scomparsa di un allele e alla fissazione dell’altro. La d. genetica agisce soprattutto sui geni cosiddetti neutrali con scarso o nullo valore adattativo. Le mutazioni possono diventare polimorfismi se danno un vantaggio selettivo oppure per deriva genetica (effetto fondatore/collo di bottiglia). Una mutazione (allele) frequente è una mutazione che non è sottoposta a pressione selettiva negativa (spesso questa pressione è dovuta anche all’ambiente). Ad eccezione dell’anemia falciforme (è una malattia Autosomica recessiva ed è caratterizzata dalla produzione di un’emoglobina patologica detta HBS, derivante da una mutazione del gene che codifica per la β globina, una delle 4 catene del tetramero α 2 β2 dell’emoglobina. A causa di tale anomalia l’emoglobina S precipita all’interno del globulo rosso, deformandone la membrana e conferendogli appunto la caratteristica forma di falce. I globuli rossi a forma di falce sono più fragili rispetto ai globuli rossi normali e, a causa di una scarsa flessibilità, tendono a bloccarsi nei capillari, da ciò consegue l’anemia. L’anemia falciforme è una emoglobinopatia non una talassemia. Le emoglobinopatie fanno parte dei disordini genetici (della catena alfa o beta) della sintesi dell’emoglobina e sono alterazioni di tipo qualitativo della composizione delle catene dell’emoglobina, si differenziano dalle talassemie che sono alterazioni di tipo quantitativo (in questo caso si ha riduzione o assenza del prodotto). Le emoglobinopatie sono molto diffuse: esse vengono trasmesse come caratteri ereditari, ed alcune forme presentano una distribuzione geografica particolare, che interessa vaste zone dell’Africa, dell’Asia e dell’Europa. L’anemia falciforme si manifesta solo allo stato omozigote (quando i geni parentali sono entrambi mutanti,) allo stato eterozigote (quando uno solo dei geni parentali è mutante) è relativamente asintomatica, gli individui presentano entrambe le forme di emoglobina e sono più resistenti alla malaria e ciò spiega la sua alta frequenza nelle zone paludose, bisogna per questo considerare sempre l’influenza della selezione ambientale. Questo è anche il motivo per cui in alcune regioni come la Sicilia un allele che dovrebbe essere sfavorito, come quello dell’HBS ha in realtà una frequenza alta. (aggiunto io: questo fenomeno prende il nome di vantaggio dell’eterozigote: entrambi gli alleli vengono mantenuti nella popolazione quando l’eterozigote ha fitness maggiore di entrambi gli omozigoti) In ogni caso a parte rare eccezioni come questa, in cui risulta determinante l’influenza ambientale, possiamo dire che sono gli alleli che non danno patologie gravi e che quindi hanno poca probabilità di

Poi vennero studiati gli STRs (short tandem repeats),: microsatelliti, generalmente sono rappresentati da sequenze di citosine e adenine che si susseguono una dopo l’altra un certo numero di volte in un determinato locus del nostro genoma. Per es. un individuo può avere 18 ripetizioni su un allele e 21 sull’altro, un altro ne può avere 15 su uno e 22 sull’altro. Sono coì importanti perché hanno alleli multipli nella popolazione. È praticamente impossibile che due individui non correlati abbiano casualmente lo stesso profilo per gli STR, per coincidere significa che sono gemelli o è lo stesso individuo, altrimenti è impossibile. (si prendono in considerazione STR presenti su più loci). Questo dato li rende il metodo di elezione per tutta la genetica forense, a partire dai test di paternità per arrivare al riconoscimento senza ambiguità del DNA di un sospetto da una macchia di sangue. Infatti, se il profilo per gli STR preso da due campioni coincide o è perché sono campioni presi dallo stesso individuo, o è perché i due campioni sono stati presi da due gemelli. Gli STR possono essere usati anche nei test di paternità. Sono così importanti perché hanno alleli multipli nella popolazione. Gli SNPs sono biallelici quindi hanno un contenuto di info ristretto rispetto agli STR ma hanno il vantaggio di essere molto numerosi, quindi per l’eventuale riconoscimento di un individuo se ne possono considerare di più contemporaneamente. Hanno inoltre permesso la costruzione delle mappe genetiche e la localizzazione di numerosi geni- malattia. Nel 2004 poi si sono studiate le CNVs (copy Number variants), alcuni sono polimorfismi benigni, altri sono patogenici, hanno permesso di mettere in evidenza cause molecolari di molte malattie. Sono variazioni nel numero di copie di un frammento di DNA (di dimensione superiore a 50 pb) rispetto ad una sequenza di riferimento. Possono essere classificate in:

Copy Number Loss o Deletion: il numero di copie di una data regione è inferiore alla sequenza di riferimento.
Copy Number Gain o Duplication: il numero di copie di una data regione è maggiore della sequenza di riferimento Variazioni genomiche:
Cambio di singola base (mutazioni puntiformi),
piccole inserzioni/delezioni, microsatelliti, minisatelliti,
elementi mobili (300bp-10kb). Varianti genomiche strutturali (>10kb):
delezioni
inversioni
duplicazioni. Possono dare un problema di dosaggio genico la delezione e la duplicazione, l’inversione no perché cambia solo la disposizione). CNV Sono delle varianti genomiche strutturali nelle quali invece di un normale assetto diploide si hanno amplificazioni o perdite. Molte di queste varianti si trovano nella popolazione generale e riguardano

35% del genoma umano (non si riferisce al genoma di un singolo individuo ma al genoma umano nella totalità degli individui). Rappresentano la maggiore fonte di diversità fenotipica insieme agli SNPs. Possono essere sia benigne che estremamente dannose. Dipende soprattutto da dov’è la CNV. Spesso non sono associate a malattia. es: Un esempio di CNV è rappresentato dalla variazione nel numero di copie del Gene AMY1, codifica per un’amilasi, se facciamo un analisi di questo gene nella popolazione vediamo che lungo lo stesso cromosoma, tramite la tecnica fiber FISH (fatto su un cromosoma non in metafase ma stirato), abbiamo diversi alleli. Se facciamo la stessa analisi su individui che hanno una dieta povera di amido, questo numero di copie si riduce di molto (es introduzione in gran bretagna della patata dall’America, il loro corredo genetico non era abituato a digerire queste quantità di amido e quindi aveva poche copie di geni dell’amilasi, e molti bambini non sopportando questa dieta hanno avuto problemi di gastroenteriti a causa del mal assorbimento di questo amido->mortalità elevata, sono stati premiati gli individui che

avevano un alto numero di copie del gene dell’amilasi). NB: il numero di copie è correlato alla tendenza all’obesità. I CNVs sono molto diffusi nella popolazione, tra il 65-80% della popolazione ha una CNV>100kb. Tra il 5-10% una CNV> 500 Kb, l’ 1% una CNV > 1000 Kb. Ci sono alcuni CNV che colpiscono determinate regioni di un gene che sono associate a malattie, quali ad es epilessia, parkinson (ci sono anche CNV che ti dicono che in futuro avrai il parkinson ad es). I CNV hanno funzioni molto importanti, spesso sono associati a duplicazioni di geni coinvolti in abilità cognitive. La differenza fenotipica tra gli individui oltre alla presenza degli SNP è dovuta alla presenza delle CNV nel genoma. Il nostro genoma differisce di circa l’1% rispetto a quello degli scimpanzè ma, se consideriamo anche le differenze dovute ai CNV, questa percentuale sale al 3%. Aggiunto da me: La FISH è una tecnica di ibridazione molecolare in situ con una sonda fluorescente che colpisce un cromosoma e “lo accende,” per cui ci da l’idea se quella regione rappresentata dalla sonda è presente sul cromosoma. La Fiber FISH viene eseguita non sui cromosomi metafasici ma su quelli interfasici. Nella Fiber-FISH, i cromosomi interfasici vengono fatti aderire ad un vetrino in modo che siano allungati e distesi in forma di fibra cromatinica di minimo avvolgimento. La distensione dei cromosomi permette una risoluzione molto più elevata della FISH, fino ad 1 kb. Diversità genomica I genomi di due individui differiscono maggiormente a livello strutturale che a livello di singolo nucleotide. Circa 4 - 24 Mb di differenza è dovuta ai CNVs, ~ 2.5 Mb di differenza è dovuta agli SNPs. Mutazioni: Macrolesioni : -spesso osservabili citogeneticamente -includono grosse: Delezioni, Duplicazioni, Inversioni e Traslocazioni Microlesioni: -coinvolgono meno di 1000 bp -molto spesso solo 1 singola base è alterata -includono piccole sostituzioni, delezioni, inserzioni e duplicazioni MECCANISMI MOLECOLARI DELLE MUTAZIONI

- MUTAZIONI PUNTIFORMI:^ variazioni della sequenza del DNA che coinvolgano uno o pochi nucleotidi Sostituzioni di base (variazioni di singoli nucleotidi) :

Transizioni : purina con purina (A, G) e pirimidina con pirimidina (C, T)
Trasversioni : purina con pirimidina e pirimidina con purina
Addizioni o Delezioni di basi : 1 o più nucleotidi sono aggiunti o deleti dai 2 filamenti di Dna. Le mutazioni puntiformi possono essere suddivise in base all’effetto sui prodotti genici (mRNA e/o pro- teine); si possono così distinguere sei tipi fondamentali:
mutazioni silenti: non modificano la sequenza aminoacidica;
mutazioni missenso : un aminoacido viene sostituito da un altro (più rognose per quanto riguarda l’interpretazione, perché non possiamo dire con certezza quello che avverrà);
delezioni/inserzioni in frame : delezioni o inserzioni di uno o più aminoacidi;
mutazioni non senso : un codone per un aminoacido viene sostituito con un codone di stop;
mutazioni frame-shift : in seguito a delezione o inserzione di un numero di nucleotidi non multiplo di tre, si ha uno slittamento della cornice di lettura;
mutazioni di splicing : comprendono mutazioni a carico delle sequenze di regolazione dello splicing (alterata maturazione del pre-mRNA) Danni endogeni del Dna
Errori di replicazione del Dna : causati dagli errori commessi dalla Dna Polimerasi (sono la principale fonte di mutazioni del Dna, lo possiamo vedere quando facciamo amplificazione con PCR, infatti anche la Taq polimerasi commette errori e quindi vengono amplificati frammenti con errori)

Il MMR è deputato alla correzione di due tipi principali di mutazioni: -errati appaiamenti tra basi che non seguono la regola di Watson e Crick (ovvero appaiamenti diversi dai canonici G:C e A:T); -piccole inserzioni e delezioni che si creano a livello di brevi sequenze ripetute (Short Tandem Repeats; STR) in conseguenza dello “scivolamento” della polimerasi. Con il sistema MMR si arriva a 1x10-9^ errori. Problemi nella riparazione del Dna (nel MMR) causano spesso o problemi oncologici o neurologici (perché queste mutazioni si accumulano). 1 su 100- 1 su 1000 sfugge alla riparazione. Tasso di errori per mitosi (nuove mutazioni non prese dai genitori): ogni bambino ha almeno tra 60 e 80 nuove mutazioni che non provengono dai genitori (NB. La spermatogenesi induce molte più mutazioni per mitosi). Il filamento neoformato ha dei tagli (nicks) riconosciuti dal sistema MMR. Il sistema MMR rimuove selettivamente il filamento neoformato. (Aggiunto io)In breve: La proteina MUT S ha una forma a tenaglia, ‘’abbraccia’’ il double strand e scorre lungo il Dna e identifica l’errore grazie alla distorsione che si crea (c’è la presenza di un nick). Una volta riconosciuto il mismatch MUT S ci si lega grazie alla sua attività ATP-asica. L’aggangio di MUT S richiama le proteine MUT L e MUT H che si legano al Dna in posizione adiacente al mismatch. MUT H induce un taglio (il nick) sul Dna che chiama un esonucleasi che degrada il Dna a partire da un’estremità 3’ libera. L’esonucleasi degrada le basi partendo dall’estremità fino alla zona dove si trova MUT S. Infine la Polimerasi sintetizza la parte mancante del filamento correggendo l’errore. Continua nella 2 lezione..

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