Meccanismi di replicazione e latenza dei virus Herpesvirus, Appunti di Virologia

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CLASSIFICAZIONE

BALTIMORE:

CLASSE I

VIRUS A dsDNA

(HERPESVIRUS,

EBV, ADENOVIRUS)

HERPESVIRUS UMANI

Il genoma è composto da un dsDNA, lineare nel virione e sottoforma circolare all’interno della cellula ospite. Questo virus replica all’interno del nucleo. Genoma abbastanza grande (125-236Kb) e complesso, contiene all’interno tutte le informazioni per poter esprimere elementi essenziali per la replicazione del DNA e per lo sviluppo della patogenesi, al contrario per l’espressione dei suoi geni necessiterà della RNApol II cellulare. Sono in grado di inibire la sintesi del DNA cellulare, così da indirizzare il pool di precursori nucleotidici nella sintesi del DNA virale. Sono virus specie-specifici, nel caso degli herpesvirus se ne distinguo 8 membri, suddivisi in famiglie a seconda della tipologia di cellule che infettano su cui stabiliranno, con modalità differenti, un’infezione LATENTE. Per infezione latente si intende un’infezione non produttiva e reversibile compiuta dal virus. In questo frangente non sarà prodotta progenie virale, il genoma sarà parzialmente silenziato e di conseguenza non saranno presenti proteine che possano allarmare il sistema immunitario, gli unici geni che saranno espressi saranno fase- specifici per il mantenimento della latenza. Un aspetto importante per il virus, da tenere in considerazione nella fase di latenza, è il mantenimento dell’informazione genetica (PERSISTENZA DEL GENOMA); risulta semplice per i virus che infettano cellule non replicanti (neuroni), in quando hanno meno rischio di perdere l’informazione genetica. Nel caso in cui i virus infettano cellule che vanno incontro a replicazione (cellule B →plasmacellule) il rischio di perdita è maggiore, perché dovrebbero garantire ad entrambe le cellule figlie il loro DNA. Come fanno, se per il

in quando sono stati associati a crescita neoplastica; l’Epstein-Barr è stato individuato nel linfoma di Burkitt, allo stesso modo, l’HHV8 è stato scoperto come uno degli agenti eziologici che causano il sarcoma di Kaposi negli individui immunocompromessi.

HERPES SIMPLEX di tipo I (HSV1)

Famiglia: Herpesviruses

Sottofamiglia: Alphaherpesvirus

Virus rivestito, presenta:

• Envelope, doppio strato fosfolipidico acquisito dalle membrane del Golgi, su cui sono presenti numerose proteine virali (>10) volti ovviamente al riconoscimento e attacco del virione alle cellule target;
• Nucleocapside, icosaedrico composto da 6 proteine diverse;
• TEGUMENTO, matrice presente tra il nucleocapside e l’envelope, composta da un numero di proteine consisti e da RNA virionico. Quest’ultimo importante riversa di messaggeri che possono essere messi a disposizione della cellula infettata per la sintesi proteica senza dover prima passare dalla traduzione del DNA virale.

• Genoma, 150Kb; troviamo una regione unica lunga UL e una regione unica corta US fiancheggiate entrambe delimitate da ripetizione invertite terminali, note come TRL - TRS (esterne)e IRL
  • IRS (interne). I geni degli Herpesvirus non sono clusterizzati, hanno un’organizzazione molto dispersiva e non necessitano splicing (prodotti dei geni virali inibiscono la sintesi proteica cellulare andando a compromettere lo splicing alternativo) in quanto ogni gene ha il suo promotore. Lo splicing, in realtà è presente al massimo durante l’espressione di latenza-specifica. Il genoma di HSVI ha tre origini di replicazione che si attivano durante il ciclo litico, sono: ֎ ORI S, sono due e delimitano la regione unica corta ֎ ORI L, una soltanto e delimita la regione unica lunga Esiste una preferenza di utilizzo tra le tre e si basa su due circostanze: se stiamo infettando produttivamente una cellula epiteliale, quindi una cellula prona al ciclo litico, oppure se siamo in fase di riattivazione dall’infezione latente.

conformazionale in grado di stimolare la fusione dell’envelope con la membrana citoplasmatica o endosomiale. Segue la liberazione del nucleocapside a livello citoplasmatico, insieme a tutte le proteine e gli mRNA che costituiscono il ‘’tegumento’’. Poiché la replicazione del genoma virale avviene a livello nucleare, sarà necessario veicolare tramite i microtubuli il nucleocapside a ridosso della membrana nucleare; Il nucleocapside di conseguenza interagisce con i pori nucleari e tramite modificazione dei capsomeri creerà dei pori attraverso i quali passa il genoma virale ritrovandosi all’interno del nucleo; non vi è completo disassemblaggio del nucleocapside la cui componente proteica resta integralmente all’esterno del nucleo cellulare. All’interno del nucleo, il genoma virale circolarizza e avviene l’infezione primaria (cellula epiteliale – ciclo litico), essendo virus a DNA l’espressione è regolata temporalmente; per ordine di attivazione avremo: ֎ α, geni immediati-precoci, sono 5 - 6 proteine, chiamate ICP (infected cell proteins – ICP0, ICP4, ICP22, ICP27), e US1.5; la trascrizione di questi geni avviene anche in assenza di sintesi proteica. I loro prodotti hanno una funzione TRANS- ATTIVATRICE dell’espressione genica. ICP0, ICP4, ICP27 sono responsabili dell’attivazione dei geni β e γ. ֎ β, geni precoci, avviene prima della replicazione del DNA virale e codificano tutti gli enzimi coinvolti nel processo replicazionale, come: TK, RR, DNApol.

• Timidina chinasi (TK), fosforila nucleotidi;
• Ribonucleotide reduttasi (RR), converte i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi.

La funzione coordinata di queste due proteine sarà quella di fornire precursori per la sintesi del nuovo DNA virale. Applicazioni farmaceutiche:

• ACICLOVIR, farmaco antivirale, si basa dell’attività della TK; questo farmaco è un terminatore di catena, il suo utilizzo nella sintesi di DNA comporta l’interruzione della stessa e così impedisce la replicazione virale. ֎ γ, geni tardivi, la cui espressione inizia durante la replicazione del genoma virale ed è massima una volta terminata la replicazione. Producono tutte le proteine strutturali e proteine essenziali che permettono al neo-virione di effettuare una nuova infezione (VP16 e VHS). Ovviamente i geni appartenenti al singolo gruppo sono attivati contemporaneamente, ed essendo l’espressione a cascata prima viene attivato α, che attiva β, che indirettamente attiva γ (indirettamente perché i geni associati a β sono coinvolti nella replicazione che si conseguenza danno lo start all’espressione di γ). La peculiarità degli Herpesvirus, rispetto agli adenovirus o ai papillomavirus, è la loro indipendenza dal macchinario trascrizionale cellulare per quanto riguarda l’espressione dei geni immediati-precoci, in quanto dipende dal fattore trans-attivante VP16, già presente nei virioni; infatti, negli altri virus per poter esprimere i geni immediati- precoci necessitano dei fattori trascrizionali cellulari.

VHS: gene tardivo, ‘’ virion host shut-off’’ Contenuto insieme a VP16 nel tegumento, una volta rilasciato nel citoplasma espleta la sua funzione: la degradazione dei messaggeri. Gli mRNA che verranno degradati per la maggiore saranno quelli cellulari, data la loro maggior concentrazione nelle fasi precoci di infezione primaria, anche se di per sé questa proteina VHS non discrimina il messaggero cellulare da quello virale. A supporto della sua attività, dovendo preservare i futuri mRNA virali, viene coinvolta una proteina ICP27, codificata dai geni immediati-precoci, che funge da segnalatore di messaggeri cellulari. Ovviamente l’attività del VHS non deve essere sempre presente, in quanto con il passare del tempo la cellula avrà una maggiore concentrazione di messaggeri virali che non devono essere degradati, per impedire ciò interviene la VP16 che andrà ad inibire VHS. L’azione di VHS è fondamentale per l’infezione virale, poiché permette la riprogrammazione del metabolismo cellulare ed aiuta il virus ad evadere la risposta interferonica. AZIONE DEI GENI: l’attivazione dei geni α, simboleggia un punto di non ritorno, si avrà la produzione delle ICP, che hanno un’attività trans-attivante (controllo positivo) sugli altri geni β e γ. Nello specifico: ֎ ICP4 e ICP27, attività trans-attivante sui geni precoci e sui tardivi. ֎ ICP22, attività trans-attivante sui geni tardivi ֎ ICP0, attività trans- attivante sulle gene precoci. (No legame DNA). Esiste però un controllo negativo per il virus operato da ICP4, andando a reprimere i geni α; una volta che il ciclo replicativo è

terminato non si ha più la necessità della produzione dei geni immediato-precoci. Durante il ciclo litico, il virus che ha rilasciato il suo genoma è soggetto alle risposte di default cellulari; di fatto un DNA estraneo viene silenziato. Di conseguenza, ci saranno tutte una serie di azione compiute dalle proteine virali che permetteranno il mantenimento dell’espressione virale, come: ֎ l’azione della VP16-HCF insieme a OCT1, sarà proprio quella di de-reprimere le regioni regolative dei geni α permettendone la trascrizione. ֎ ICP0, disloca i repressori del genoma di HSV ֎ ICP4, si lega al DNA e promuove la trascrizione dei geni β e più avanti dei geni γ. Alla fine del ciclo litico inizierà la costruzione del capside e l’impacchettamento del genoma, processo che avviene all’interno del nucleo; di seguito il virione dovrà acquisire l’envelope e infine verrà rilasciato. Come avvengono questi eventi? 3 modelli:

1. Dual envelopment model: è quello più accreditato. Il primo step riguarda la traslocazione del nucleocapside dal nucleo al citoplasma. Pertanto, il nucleocapside gemmerà dalla membrana interna nucleare, con la formazione di uno pseudovirione in cui non saranno presenti né tegumento, né glicoproteine. Questo pseudovirione, a sua volta, proseguirà verso il citoplasma perdendo il primo envelope, fondendosi con la membrana

coadiuvata dalla bassissima probabilità che si formino complessi HCF- VP16, questa non potrà avere accesso al nucleo) Contemporaneamente il genoma virale verrà silenziato dal neurone e di conseguenza ‘’fatta fuori VP16’’ non si potrà de-reprimere il DNA virale che resterà silenziato. LAT: geni di latenza-specifici. (latence associated transcript) La fase di latenza NON è priva di espressione genica, vengono espressi i geni LAT. Funzioni: ֎ Stabiliscono la latenza e il suo mantenimento. Tengono a base la sporadica espressione dei geni immediato- precoci. ֎ Riattivano il virus dallo stato di latenza, proteggendola dall’apoptosi. Qualora vi fossero opportuni stimoli esterni, tali da indurre la de-repressione e la riespressione dei geni immediato- precoci. È codificato nella ripetizione interna lunga, è l’unico trascritto che subisce splicing, essendo latenza-specifico lo ritroveremo espresso solo in questo frangente. L’espressione dei geni di latenza sembra essere imputabile alla regolazione a cui sono soggetti i suoi promotori lap1 e lap2 , poiché dipendono dai fattori trascrizionali neuronali. Dal trascritto si ottengono microRNA, i quali è stato riscontrato abbiano complementarità con ICP, spiegando così il ruolo che ha LAT nel controllore l’espressione dei geni α, quindi del ciclo litico.

Ad esempio:

• miR-H2 è complementare a ICP0, che sarà sequestrato; mantenendo basso il livello di ICP0 si evita che si possa de- reprimere il genoma virale e di conseguenza di innescare un’ipotetica attivazione dei geni immediato-precoci.
• miR-H6 ha come target ICP4, (sono espressi sia in latenza che nel ciclo litico), in questo caso il microRNA svolge un ruolo nella riattivazione del virus. COME SI RIATTIVANO I VIRUS IN LATENZA? ֎ stimoli di stress che portano ad un abbassamento delle difese immunitarie; ֎ elevata esposizione ai raggi UV Studi hanno dimostrato che una cellula sottoposta ha uno stress è soggetta a una riattivazione GLOBALE di tutto il genoma virale, ovvero saranno espressi tutti i geni in contemporea e saranno degradati i trascritti associati a LAT. Responsabile della risposta allo stress è JNK, una serin-chinasi che fosforila l’istone H3, precisamente la serina 10 inducendo la trascrizione. Questa iniziale attivazione non è produttiva, ma essendo comunque stati trascritti i VP16 che hanno facile accesso al nucleo, può svolgere la sua funzione regolando i geni virali, fa questo momento il virus potrà creare nuovi virioni che migreranno in maniera anterograda verso le terminazioni nervose e andranno ad infettare altre cellule come le epiteliali innervate, causando la febbre erpetica, classica manifestazione dell’Herpes labiale.

La trasmissione, 3 ipotesi: ֎ Virus infetta la cellula epiteliale → infezione litica→produzione nuova progenie virale che si diffonde nella parte sottostante fino a raggiungere i linfociti; ֎ Virus trasloca direttamente, senza infezione litica ֎ Virus passa attraverso giunzioni tra le cellule dello strato di rivestimento. Quindi la trasmissione a livello linfocitario, non presuppone sia necessariamente dovuta ai nuovi virioni creati nel primo ciclo infettivo, ma possono essere i virioni stessi a raggiungere i linfociti B naïve dove comincia la latenza direttamente. Quando si parla delle cellule epiteliali infette, si parla di REPLICAZIONE PERMISSIVA, in quanto consentono la completa replicazione litica virale. Nel caso invece delle cellule B si parla di REPLICAZIONE SEMIPERMISSIVA, la cellula contiene alcune copie non integrate (episomi) del genoma del virus che vengono replicate ogni volta che la cellula si divide, questo ovviamente quando il virus sviluppa latenza delle cellule infettate. Le cellule B oltre ad essere soggette alla latenza del virus, possono essere stimolare e trasformate dal virus. Eventi infettivi: il virus incontra il linfocita B naïve, in cui si stabilisce latentemente, nel frattempo la cellula B svolge il suo normale decorso, quindi attraverso un processo di differenziamento, passa dal centro germinativo, in cui si avrà un ulteriore modificazione di espressione genica (dove verrà ridotta l’espressione di latenza-specifica), fino alla fuori uscita dal centro germinativo come cellule B della memoria. La latenza virale fa sì che ci siano comunque trascritti, ma non prodotti proteici, così da non sollecitare la risposta dell’ospite da parte del sistema immunitario.

Da questo stadio il virus può essere riattivato grazie a degli stimoli che coinvolgono la cellula B, come: stimoli differenziativi che promuovo il differenziamento in plasmacellula, che sarà permissiva per la produzione di progenie virale. ANTIRECETTORI VIRUS EBV: ֎ Cellule epiteliali: gH, gB, gL; il virus prende contatto con le cellule epiteliali usando i recettori delle EFRINE (recettore A2). Il recettore dell’efrina è tirosin-chinasico che riconosce l’efrina ancorata sulla membrana plasmatica di un’altra cellula, il loro legame è funzionale al riconoscimento, adesione, segnale proliferante o migratorio. La de-regolazione di questi recettori può contribuire allo sviluppo neoplastico; infatti, il recettore A2 è regolato positivamente in molto tipi di tumore. (possibili target terapia) ֎ Cellule B: gp350, gp42 e gH, gB, gL; o Gp350 riconosce antigene CD21(CR2); o Gp42 riconosce HLA di classe II; o gB funzione fusogenica (per entrambe le cellule); La distinzione delle componenti proteine anti-recettoriali sull’envelope giustifica il fatto che alcuni virus EBV abbiamo un tropismo per le epiteliali e altre un tropismo per le cellule B; infatti, saranno le prime prive di gp42, perché influenza il legame di gH-gL sulle cellule epiteliali. Infatti, quando questi eterodimeri sono impegnati nell’interazione con la gp42 non sono liberi di interagire con il recettore.

CICLO DI LATENZA:

Le cellule B della memoria sono cellule quiescenti, ma in alcuni casi possono riprendere l’attività proliferativa per il mantenimento del pool staminale (DIVISIONE OMEOSTATICA). Di conseguenza è importante che il genoma virale sia in grado di replicarsi per mantenere il proprio materiale genetico. Lo fa tramite replicazione episomale, permettendo così la distribuzione della sua informazione genica qualora le cellule in cui risiede decidano di dividersi. Utilizza l’ORI P, origine plasmidica, ed utilizza la DNApol cellulare. Durante la fase di latenza, nelle cellule infettate, sono state osservate la produzione di: ֎ antigeni nucleari di latenza:

• EBNA1, garantisce la replicazione episomale e la segregazione dei genomi neosintetizzati nelle cellule figlie.
• EBNA2, fattore trascrizionale necessario per attivare i promotori dell’espressione degli EBNA3 e dei LPM (attiva anche c-MYC); EBNA2 quando è presente induce un iper- proliferazione delle cellule infettate, fa esprimere tutti i geni e quindi rende visibile la cellula al sistema immunitario, il virus deve però essere rapidamente spegnere l’espressione proteica e lo fa tramite gli EBNA 3;
• EBNA-3A/3B/3C repressori trascrizionali di EBNA2;
• EBNA-LP, coopera con EBNA2. ֎ proteine di membrana di latenza:
• LMP-1, oncogene virale , si comporta con un recettore CD costitutivamente attivi; la sua espressione induce la fase S del ciclo cellulare, previene l’apoptosi, cambia l’espressione di antigeni di superficie e controlla la produzione di citochine.

• LMP-2A, si comporta come un recettore costitutivamente attivo delle cellule B (BCR), di conseguenza aiuta a mantenere la cellula B naïve iper-proliferante
• LMP-2B, ֎ piccoli RNA non codificanti (EBERS), agiscono come inibitori della risposta interferonica antivirale, inibitori di PKR. Possono essere responsabili di uno stato infiammatorio abbastanza rilevante. ??????????? ֎ piccoli miRNA che contribuiscono allo stato di latenza. La cellula stabilisce diversi programmi di latenza: ֎ LATENZA DI TIPO 0, sono presenti sono gli EBERS e nessuna espressione proteica. Caratteristico nei linfociti B circolanti; stadio acquisito dalle cellule normali. ֎ LATENZA DI TIPO 1, presenta EBNA-1 e gli EBERS; caratteristico delle cellule B della memoria circolanti e quiescenti. Stato che si verifica nel linfoma di Burkitt. ֎ LATENZA DI TIPO 2, presenta EBNA - 1, tutti gli antigeni di membrana LMP e gli EBERS, stato presente nel linfoma di Hodgins, nei carcinomi oro-faringei e nei carcinomi gastrici. ֎ LATENZA DI TIPO 3, viene espresso tutto, gli antigeni nucleari, di membrana e gli EBERS. In questo stadio il virus è parecchio visibile al sistema immunitario, data la produzione di tutte le componenti proteiche (STATO IPERPROLIFERATIVO), infatti solo alcune cellule passeranno allo step successiva, quelle che avranno in seguito down-regolato EBNA2 e spengo il promotore Cp. Stato