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DAL DNA ALL’INGEGNERIA GENETICA
I MICROORGANISMI AL SERVIZIO DELLE BIOTECNOLOGIE
VIRUS BATTERI
I VIRUS
I virus sono parassiti endocellulari obbligati, che non possono riprodursi fuori della cellula ospite che infettano. devono entrare e infettare le cellula per sopravvivere. -sono costituiti da:
- genoma virale: costituito da DNA o RNA
- capside: rivestimento proteico che riveste il genoma
- pericapside o envelope: involucro lipidico esterno (presente in alcuni casi) -esistono più di 4000 specie di virus che presentano forme e caratteristiche di superficie molto particolari. -dimensioni dai 20 nm ai 250 nm -sono capaci di infettare gli eucarioti quindi animali e piante (specializzati) es: la viaria era una malattia degli uccelli e c’era il timore che potesse infettare anche l’uomo, fortunatamente non è successo -virus che infettano le cellule eucariotiche sono:
- virus a DNA: contengono un filamento a doppio o singolo DNA papillomavirus umani (HPV) adenovirus una serie di virus specializzati nell’infettare e una serie e specializzata per l’uomo sfruttano il sistema della cellula ospite per replicarsi non c'è nella foto
- virus a RNA: contengono una molecola di RNA a singolo o doppio filamento e hanno sviluppato strategie diverse di infezione SARS-CoV-2 HIV Rabbia Influenza A Ebola TMV Zika virus entra nella cellula, si rompe l’envelope e rilascia l’info generica. RNA entra nel nucleo e viene trascritto dall’enzima polimerasi processo: BATTERIOFAGI I batteriofagi sono parassiti endocellulari obbligati che infettano specificamente i procarioti sono costituiti da una testa con
- genoma virale: costituito da DNA o RNA
- capside: rivestimento proteico che riveste il genoma sono capaci di infettare i procarioti ovvero i batteri -hanno una struttura a coda che gli consente di prendere contatto con la membrana cellulare dell’ospite. infilza la coda per poi iniettare il genoma virale -dimensioni dai 20 nm ai 100 nm -a volte utilizzano il sistema di trascrizione della cellula ospite -a volte il virus contiene informazioni e sfrutta la trascrizione per produrre le proteine genoma a^ base^ RNA = Covid + (piante ( (sud-americal
I BATTERI
I batteri sono cellule procariotiche, prive di nucleo L’informazione genetica è conenuta in un unico cromosoma circolare + contengono delle molecole di DNA accessorio dette plasmide
- Flagelli e ciglia (facoltativi)
- Parete cellulare e capsula (facoltative)
- Membrana cellulare
- Citoplasma
- Ribosomi
- DNA genomico
- Plasmidi composto da: PLASMIDI Il plasmide è una molecola di DNA circolare e a doppia elica -I plasmidi sono sequenze corte (qualche migliaio di paia di basi) possono contenere una decina di geni -contengono una origine di replicazione che può essere trascritta sincronamente al DNA genomico possono essere distinti in tre principali categorie:
- operoni metabolici specializzati;
- geni per la resistenza agli antibiotici (plasmidi R)
- geni per la coniugazione (plasmidi F) Il DNA genomico contiene questi operoni nei procarioti i geni del DNA batterico sono organizzati per OPERONI tante zone organizzate che si coordinano e svolgono determinate funzioni (ci sono diversi operoni in base alla funzione)
si dividono in INDUCIBILI: non vengono espressi ma si attivano in certe situazioni REPRIMIBILI: I geni vengono espressi poi per motivi metabolici viene bloccata la loro espressione tramite una proteina
info Ona separate dal perfettamentegenomico funzionali^ ma^ >^ ormaiad alcuniI^ batteri antibiotici^ sono^ immuni Batteri si scambiano plasmidi
OPERONE LAC
-è l’operone del lattosio: è un gruppo di geni che lavorano insieme per permettere ai batteri di metabolizzare il lattosio affinché la trascrizione avvenga devono esserci 2 sezioni regolatrici strutturali -è l’operone specifico dell’Escheria Coli, che utilizza il glucosio per sopravvivere. quando ce n’è abbastanza l’operone lac è bloccato da una proteina attaccata nelle sequenze regolatrici fa da blocco per l’attacco dell’RNA polimerasi impedisce che i geni vengano espressi -quando il batterio ha bisogno di energia, ma il glucosio non è disponibile, il batterio usa il lattosio come fonte di energia perciò il lattosio di lega al repressore, cioè la proteina, che cambia forma e si stacca: i geni vengono attivati e il batterio può produrre gli enzimi necessari x digerire il lattosio
enzimi coinvolti
- ENZIMI DI RESTRIZIONE endonucleasi che rompono in modo preciso il legame fosfodiestere tra due nucleotidi adiacenti (endonucleasi perché tagliano sempre nel mezzo) -estremità coesive:
- BamHI
- EcoRI -estremità piatte:
- Hae II come facciamo a selezionare il frammento corretto/quello che ci interessa? => taglio il^ cerchio Vettore ~ linearizzato estraggo il^ plasmide^ dal^ batterio taglio il^ gene umano mette I due assiemetratti organismo genericamente modificato & trasformazione batterica X (^) rimettere con^ le^ info Il (^) plasmide aggiunte all'interno cell della. batterica dal^ batterio
- riconosce la catena e (^) taglia riconosce basi^ estremitàPlatte taglio vertic^. I Senza d (^) Io compat = (^) estremita- Coesive Ispecifiche solo^ compatibili le basi complementari· G 12 4 10
• ENZIMI DI LIGAZIONE
DNA ligasi: enzimi che catalizzano la formazione del legame fosfodiestere tra nucleotidi adiacenti. incolla le estremità compatibili si chiamano di solito T4 ligasi T7 ligasi si crea una miscela di vettore linearizzato
- DNA di interesse che reagisce a 37°C a cosa serve il dna ricombinante? -ottenere più rapidamente proteine essenziali per il funzionamento dell’organismo umano (es. insulina) -creare librerie a DNA: prendere tutto il genoma e inserirlo in tanti plasmidi -modificare geneticamente organismi vegetali e animali DNA ricombinante è alla base di tutti gli elementi geneticamente modificati gene dell'insulina^ messo^ all'interno^ di^ un^ plasmide^ batterico, il^ batterio^ copia^ l'info^ sottoforma^ di^ MRNA e crea la proteina = singoli plasmidi con un pezzo di (^) DNA organizzazione dei^ pezzi^ così^ che^ vengano letti^ e^ utilizzati OGM
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
sistema in vitro per amplificare il DNA basato sulla capacità dell’enzima DNA polimerasi di sintetizzare un nuovo filamento di DNA a partire da un filamento stampo. REAGENTI: la polimerasi di uno speciale batterio termofilo, l’unica in grado di lavorare a quella temperatura (se no 37) a cosa serve? -ottenere tanti frammenti (inserti) per il clonaggio -diagnostica molecolare (identificazione di mutazioni sul DNA) -scienze forensi (DNA fingerprinting) -identificare microorganismi nell’ambiente e negli alimenti
- Taq DNA polimerasi
- Deossinucleotidi trifosfato (dNTPs)
- Primer
- DNA da amplificare
- Acqua (DNA free)
IL SEQUENZIAMENTO
Il sequenziamento del DNA permette di definire il preciso ordine della sequenza di nucleotidi che formano una molecola di acido desossiribonucleico. usa nucleotid a si (^) appoggia^ la^ polimerasi al^ ripetutoper 30 primer (^) e sintetizza^1 cli Il (^) filamento quindi 230 in flamenti (^) due (^) * copie 900 70 % 60 ° C compatibili^ sequence - PRIMER con flamenti^ estremita del alza e abbassa la temperatura
tante (^) copie creare più copie di un DNA d'interesse es (^). estrarre DNA (^) Mozzarella y vedere se c'è la Salmonella. Tramite PCR (^) possiamo scoprirlo grazie ad^ un^ segnal i (^) pezzi di (^) primer si attaccano sul DNA (^) denaturato
- i deossinucleotidi si attaccano (^) grazie alla polimerasi (^7) si (^) formano = dideossinucleotidi Catene diverse si attaccano nucleotidi (^) particolari e dopo essi si blocca la catena pr sono^ dideossi^ e^ dunque manca^ l'oh^ in^ posizione 3 non c'è più il (^) legame fosfodiestere
esistono diversi metodi di sequenziamento
- Il METODO SANGER o metodo per terminazione di catena inventato nel 1977 è il punto di riferimento per la biologia molecolare
REAGENTI:
dunque questo metodo si basa su una reazione simile alla PCR, ma viene usato solo un primer e dei dideossinucleotidi (ddNTP) modificati che agiscono da terminatori di catena. per ogni provetta cambia solamente il terminatore inserito -si isola il frammento di DNA da sequenziare -I frammenti di DNA vengono uniti ai reagenti necessari per la sintesi dei filamenti complementari e suddivisi in quattro provette, ciascuna con uno dei quattro dideossinucleotidi -in ogni provetta si genera una miscela di frammenti che terminano tutti con lo stesso nucleotide -I prodotti delle quattro provette vengono posti nel gel per l’analisi elettroforetica -procedendo dal frammento più piccolo verso il più grande si ricostruisce l’ordine con cui i nucleotidi sono stati incorporati La tecnologia si è evoluta con il tempo e il rilevamento è automatizzato computerizzato che produce un elettroferogramma la sequenza è data da una serie di picchi (cromato gramma), uno per ogni posizione nucleotidica. In questo esempio i picchi di colore verde corrispondono alla A, ecc…
- Primer
- DNA da amplificare
- Acqua (DNA free
- Taq DNA polimerasi
- dNTPs
- ddNTPs e (^) frammento lo duplico/amplifico In 4 provettee (^) poi divido U dideosinucleotidi =^ terminatori
TECNICHE DI EVOLUZIONE ASSISTITA (TEA)
Le TEA (o New Genomic Techniques - NGT) sono metodologie per modificare il patrimonio genetico diegli organismi viventi in modo mirato. Le TEA non prevedono l'inserimento di DNA esogeno, ma agiscono sul DNA esistente. -CRISPR/Cas9 permette di tagliare il DNA in punti specifici e di inserire o modificare sequenze geniche
- Cisgenesi: inserimento di geni provenienti da organismi della stessa specie o di specie affini
- Mutagenesi mirata: induzione di mutazioni genetiche in punti specifici del DNA
- DNA genomico bersaglio La doppia elica rappresenta il DNA dell’organismo che si vuole modificare.
- RNA guida (gRNA) È una sequenza di RNA progettata in laboratorio per essere complementare al tratto di DNA da tagliare. Serve da “guida” per portare l’enzima Cas9 nel punto giusto.
- Complesso CRISPR-Cas Cas9 è un’endonucleasi, cioè un enzima che taglia il DNA. Si lega all’RNA guida (contiene crispr) e si muove lungo il DNA fino a trovare la sequenza bersaglio.
- Taglio del DNA Quando trova la sequenza specifica, Cas9 effettua un taglio preciso nella doppia elica. Questo taglio genera una rottura a doppio filamento.
Istrutturechsento precise
L (^) Poi RNA (^) guida mette le info
