MEDICINA DI LABORATORIO (CI. MICROBIOLOGIA CLINICA), Dispense di Microbiologia Clinica

Scarica MEDICINA DI LABORATORIO (CI. MICROBIOLOGIA CLINICA) e più Dispense in PDF di Microbiologia Clinica solo su Docsity! 1    MICROBIOLOGIA CLINICA  I METODI DELLA MICROBIOLOGIA CLINICA  LA DIAGNOSI BATTERIOLOGICA  La diagnosi batteriologica (come quella virologica o micotica o parassitaria) si prefigge di identificare l’agente patogeno  responsabile di una malattia infettiva, allo scopo di suggerire un appropriato trattamento terapeutico. Nella diagnosi  batteriologica, come nelle altre diagnosi microbiologiche, si hanno a disposizione due possibilità:   DIAGNOSI DIRETTA, volta a isolare l’agente patogeno o un suo prodotto. Le matrici biologiche usate sono:   sangue   feci   urina   biopsia   tamponi  il processamento del campione potrà avvenire attraverso   diagnosi rapida e, quindi, attraverso   → il metodo immunologico, che prevede la ricerca di antigeni dell’agente batterico, caratteristica di   test di agglutinazione,   ELISA   Saggio di immunocromatografia su membrana  → Il metodo molecolare che si identifica con la ricerca di sequenze genomiche dell’agente batterico   PCR   SDA   LCR   Ibridazione di una sonda verso l’agente batterico   Esame colturale che prevede la semina su brodo di arricchimento, terreno solido non selettivo e/o selettivo  e discriminativo. Questo porta all’isolamento del microrganismo in coltura pura che permette  → l’identificazione biochimica, immunologica o molecolare  → l’antibiogramma   DIAGNOSI  INDIRETTA,  atta  alla  rilevazione  della  risposta  immunitaria  dell’ospite.  Normalmente,  questa  si  configura con il movimento anticorpale, anche se non bisogna escludere altre forme responsive.  Il prelievo del  siero del paziente, in particolare, attraverso il metodo immunologico, avviene grazie a saggi   immunoenzimatici (EIA)   radioimmunologici (RIA)   di immunofluorescenza (IFA)    LA FASE PREANALITICA: IL PRELIEVO DEL CAMPIONE  innanzitutto, bisogna che il prelievo del campione biologico sia prelevato da    zone normalmente sterili e, quindi,   sangue e midollo   liquido cefalorachidiano   liquido articolare    liquido pleurico o pericardico   tessuti profondi   vie respiratorie inferiori   urine  (se  il  campione  viene  opportunamente raccolto)   zone con popolazione batterica o microbica residente.   vie respiratorie superiori   Cute   Tratto gastro‐intestinale   Tratto genitale femminile   Uretra  Popolazioni microbiche naturali  Molte differenti specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del corpo (mucose: orale, intestinale,  cutanea) e, in modo analogo, risiedono nell’ambiente che ci circonda (aria, suolo, acqua).  Per studiare i diversi microorganismi che colonizzano un habitat, bisogna, in primis, isolarlo e coltivarlo in forma pura;  dove, per “COLTURA PURA” si intende una coltura costituita esclusivamente da batteri identici che, in teoria, derivano  da una medesima cellula (si potrebbe definire, tecnicamente, come clone).    ISOLAMENTO PER STRISCIO SU PIASTRA  Prevede l’inoculo di un liquido prelevato da brodocoltura, o di un solido costituito da un’ansa di cellule prelevate da uno  slant  (becco  di  clarino)  o  da  una  colonia.  Questo  viene  strisciato  usando  un’ansa  sulla  superficie  di  un  substrato  appropriato (generalmente è una piastra di coltura) dove le cellule vengono distribuite in modo da far crescere colonie  ben isolate, che probabilmente derivano tutte da una sola cellula.                2     METODO DEI QUATTRO ANGOLI   1. Far asciugare le piastre in stufa. La superficie deve essere priva di umidità per  consentire ai microrganismi di rimanere immobilizzati.  2. Con  un  pennarello  scrivere  sul  fondo  della  piastra,  ai  margini,  la  sigla  di  riconoscimento. Segnare, inoltre, il punto di inizio delle prime strisciate   3. Tenere  le  piastre  col  fondo  verso  l'alto  inserite  nel  coperchio  tranne  nel  momento di eseguire le operazioni di striscio.  4. Prendere un’ansa e prelevare un po’ di patina di cellule microbiche dal campione  voluto (se da piastra, badando a prendere solo le cellule e a non bucare l'agar).  5. Eseguire alcuni strisci paralleli sulla piastra pulita in corrispondenza di un quadrante   6. Cambiare ansa e passarla sugli strisci paralleli eseguiti nella parte di fondo, dove cioè le cellule sono di meno. Da  qui eseguire altri strisci paralleli in corrispondenza del secondo quadrante   7. Ripetere  il  passaggio  6  altre  due  volte  ruotando  ogni  volta  la  piastra  ed  eseguendo  la  serie  di  strisci  paralleli  partendo dalla porzione meno densa del nuovo quadrante strisciato   8. Chiudere la piastra con il coperchio, capovolgerla ed incubarla alla temperatura e per il tempo idonei per la crescita  dei microrganismi.   Questa metodica è usata nei Paesi anglosassoni; in Italia si suole usare il metodo dei tre quadranti: una volta che si fa  la  prima  strisciata,  l’occhiello  dell’ansa  ha,  volta  per  volta,  una  carica microbica  ridotta  tale  che  l’ultima  strisciata  presenterà le cosiddette ‘singole colonie’.  ISOLAMENTO PER DILUIZIONI SERIALI   L’inoculo, solido o liquido, viene diluito all’estinzione ( = fino a raggiungere la diluizione sterile, cioè senza alcuna cellula  batterica).  Di  solito  il  fattore  di  diluizione  è  costante  ogni  passo,  risultante  in  una  progressione  geometrica  della  concentrazione con un andamento logaritmico. L’assenza di cellule batteriche è dimostrabile dall’intorbidimento del  terreno liquido o dalla crescita di altri microorganismi. Dopo aver compiuto le diluizioni seriali, si andrà a piastrare  i  terreni al fine di contare le colonie. Per essere statisticamente valida, il numero di colonie deve variare tra 30 e 300  (anche se si consiglia di contare non più di 100 colonie, altrimenti la conta risulterà molto approssimativa e difficilmente  ripetibile) Il numero di colonie contato verrà moltiplicato per il fattore di diluizione: si potrà, così, contare quante colonie  vitali sono presenti in 1 ml della soluzione di partenza.  TERRENI DI COLTURA  CLASSIFICAZIONE QUALIFICATIVA   TERRENI ELETTIVI: sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o di cavallo, che  consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche. Sono anche detti terreni universali.   TERRENI  SELETTIVI:  sono  terreni  che  favoriscono  la  crescita  solo  di  particolari  specie  batteriche  grazie  alla  presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie (generalmente antibiotici)   TERRENI  DIFFERENZIALI:  sono  terreni  che,  grazie  alla  presenza  di  particolari  componenti,  permettono  di  distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata. I terreni  differenziali contengono spesso dei coloranti che, virano a seconda del metabolismo e, quindi, del pH.     Il terreno al mannitolo‐agar o sale‐mannite o, ancora, TERRENO DI CHAPMAN è   → selettivo perché contiene il 7,5% di NaCl, una concentrazione tale da inibire la crescita di batteri non alofili.   → differenziale perché contiene  il mannitolo:  la  fermentazione del mannitolo, che avviene solamente se è  presente S. aureus, viene palesata per il viraggio dell’indicatore di pH     TERRENI  DI  ARRICCHIMENTO: consentono di aumentare  la carica della specie batterica che si vuole  isolare,  grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in  esame e sostanze che favoriscono lo sviluppo delle specie esigenti. Tipico esempio di un terreno di arricchimento  è IL TERRENO AL SELENITO per le feci: il selenito inibisce la gran parte dei batteri presenti nelle feci, facendo  crescere Shigella e Salmonella.      TERRENO AL SANGUE CON FENOMENI DI Β‐EMOLISI: il terreno è inizialmente di colore rosso, in quanto  sono presenti emazie; dove è avvenuta la β‐emolisi o emolisi completa il terreno si presenta completamente  modificato di colore e, talvolta, se l’emolisi è molto spinta, sarà addirittura trasparente, a causa della lisi totale  delle emazie. In particolare, questo tipo di terreno consente di differenziare gli streptococchi in base al loro  potere emolitico (gli streptococchi β‐emolitici restituiscono una colonia circondata da una zona di trasparenza  (a differenza di quelli α‐emolitici che sono circondati da un alone di colore verde).    INGREDIENTI DEI TERRENI DI COLTURA  In passato, i terreni di coltura venivano preparati con sostanze naturali, poco standardizzate, come i brodi di carne, il  latte  o  il  sangue.  Oggi,  i  substrati  vengono  formulati  a  partire  da  ingredienti  altamente  standardizzati,  semplici  o  complessi o che possono essere acquistati in forma disidratata, con ingredienti già premiscelati.  5    ESEMPI DI METODI GENOTIPICI PER IL FINGERPRINTING E L’IDENTIFICAZIONE DEI CEPPI:   Randomly Amplified Polymorphic DNA – PCR (RAPD‐PCR):  il DNA totale di un ceppo, estratto e purificato con  metodi rapidi (bollitura, resine, etc.), viene amplificato con un solo primer arbitrario: dopo la separazione su gel di  agarosio si produce un pattern poco complesso, specifico per ceppo.   Amplified  Ribosomal  DNA  Restriction  Analysis  (ARDRA‐PCR):  il  DNA  ribosomiale  (rDNA  16S  o  23S)  viene  amplificato con una coppia di primer altamente conservati e tagliato con uno o più enzimi di restrizione. Il pattern  ottenuto dopo separazione elettroforetica è, in genere, specie‐specifico   INDAGINI SIEROLOGICHE  Le indagini sierologiche servono per:   identificazione e quantificazione di antigeni batterici   valutazione della risposta anticorpale dell’ospite ad agenti infettivi (scopo principale)  LA  RILEVAZIONE  DI  MACROMOLECOLE  MICROBICHE  =  rilevazione  della  presenza  di  strutture  antigeniche  specifiche dei batteri, messe in evidenza mediante impiego di anticorpi. Tecniche utilizzate:   reazione di agglutinazione ‐> reazione immunologica in cui un siero contenente anticorpi voi viene cimentato  con un antigene: si ha, quindi, la formazione di un immunocomplesso visibile come un ammasso voluminoso  → agglutinazione  su  vetrino:  prevede  l’impiego  di  anticorpi,  ottenuti  in  un  animale  immunizzato  (spesso  il  coniglio), messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili  → agglutinazione  al  lattice  (AL,  maggiormente  utilizzata):  impiega  dei  reattivi  per  evidenziare  gli  antigeni  polisaccaridici, spesso della capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legare  gli anticorpi in più punti. Per il test si utilizzano anticorpi legati a particelle di lattice   reazione di immunofluorescenza  → immunofluorescenza  diretta:  si  utilizza  un  anticorpo  coniugato  con  fluoresceina  isotiocianato,  che  sia  specifico per l’antigene in esame.  → immunofluorescenza indiretta: si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma non coniugato,  che  viene  riconosciuto  da  un  secondo  anticorpo  coniugato  e  diretto  contro  regioni  costanti  delle  immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto il primo anticorpo (specifico per il treponema pallidum)   tecniche immunoenzimatiche (ELISA) ‐> si basa sull’utilizzo di anticorpi marcati con un enzima (generalmente  la perossidasi), in modo che i coniugati risultanti abbiano una attività sia immunologica che enzimatica. Avendo  uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra, la reazione antigene‐anticorpo è immobilizzata e,  pertanto, potrà facilmente essere evidenziata con l’addizione del substrato che, reagendo con l’enzima, produrrà  una colorazione osservabile a vista e quantificabile con lo spettrofotometro.   western  blot  ‐>  Utile  nei  casi  in  cui  si  vogliano  cercare  antigeni  di  diverso  peso  molecolare:  le  molecole  antigeniche di un microrganismo patogeno vengono separate su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare  e alle caratteristiche (mediante elettroforesi); trasferite su membrana di nitrocellulosa (questo trasferimento si  chiama blot o blottage) e incubate con il siero del pz. Viene aggiunto un anticorpo anti‐immunoglobuline umane  marcato  con  un  enzima  (perossidasi):  la  presenza  di  anticorpi  marcati  viene  evidenziata  dall’aggiunta  di  un  substrato cromogeno specifico sul quale agisce l’enzima, sonde molecolari   Limulus test (rilevazione dell’LPS batterico)   SDS‐PAGE delle proteine cellulari  1. la biomassa cellulare viene raccolta, lavata e lisata (con mezzi chimici o fisici)  2. i residui vengono allontanati e l’estratto proteico viene standardizzato e caricato sul gel di poliacrilammide  3. le proteine vengono separate per elettroforesi  4. il gel viene colorato  5. l’immagine viene analizzata visualmente o utilizzando hardware e software appropriati    RILEVAZIONE DI ANTICORPI (test diagnostici indiretti) –> test diagnostico in cui non si va a misurare direttamente il  patogeno o il suo prodotto ma la reazione immunitaria dell’organismo nei confronti di quel patogeno.    reazione di fissazione del complemento ‐> utilizzata per documentare la presenza di anticorpi nel siero.   Siero del paziente viene privato del complemento e,  inattivato, viene cimentato con  l’antigene,  in presenza di  complemento fresco di cavia. Se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene  ed  il  complemento, a  sua volta,  si  lega all’immunocomplesso:  se  il  siero del paziente è positivo  (cioè contiene  anticorpi contro l’antigene) i globuli rossi di montone rimangono integri; se il siero del paziente è negativo i globuli  rossi di montone vengono lisati. La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina.   ELISA indiretto ‐> si ricerca la presenza di anticorpi (che vengono fissati ed evidenziati da un anticorpo anti – Ig  umane  legato  covalentemente  a  un  enzima  come  la  perossidasi).  La  quantificazione  avviene  con  tecniche  spettrofotometriche,  attraverso  la  valutazione  dell’intensità  del  colore  prodotto  in  risposta  alla  conversione  enzimatica del relativo substrato cromogeno; mentre la reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata per  confronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso.    6    INFEZIONI VIE URINARIE  BATTERI SAPROFITI presenti nel terzo inferiore dell’uretra    Uomo  Donna  Staphylococcus auereus  Neisseriae (non patogene) Neisseriae (specie non patogene)  Acinetobacter Acinetobacter  Lactobacilli. Mycobacterium smegmatis. PATOGENESI  La penetrazione di un germe nelle vie urinarie non implica necessariamente un’infezione: tutto dipende, dal numero e  dalla ricorrenza dei microrganismi e dall’efficacia delle difese immunitarie dell’ospite;  Le vie di penetrazione possono essere:   ematogena o discendente;   ascendente, ovvero i germi colonizzano il perineo e risalgono il tratto urinario per via retrograda verso l’uretra  raggiungendo così la vescica  L’adesione alle cellule ospiti avviene ad opera di adesine (soprattutto fimbrie) che si distinguono in:   pili di tipo 1 (mannosio‐sensibili), comuni a quasi tutti i ceppi. Le fimbrie si legano al mannosio presente nelle urine  e non alla superficie della mucosa dell'ospite, non avviene, così, l’infezione   pili di tipo 2 (mannosio‐resistenti)    Fimbrie P, (mannosio – resistenti) importanti fattori di virulenza che favoriscono l’azione dei ceppi uropatogeni  detti UPEC, sia al di fuori che all’interno del loro habitat;   adesine afimbriali (AFA‐1, AFA‐III).  La  colonizzazione  vescicale  evolve  in  infezione  del  tratto  urinario  (UTI)  quando  l’uropatogeno  aderisce  all’epitelio  vescicale provocando una risposta infiammatoria, con conseguente rilascio di citochine (soprattutto IL‐6 e IL‐8) e di altri  mediatori  dell’infiammazione.  Nel  giro  di  un  paio  di  giorni  si  ha  la  comparsa  della  sintomatologia  e  l’inizio  della  migrazione linfocitaria nel sito dell’infiammazione.  chemochina con un’attività diretta di chemo‐attrazione: richiama rapidamente i polimorfonucleati  dai vasi e dall’interstizio che liberano citochine e altri fattori = l’infiammazione delle vie urinarie.    I leucociti migrano attraverso lo strato delle cellule epiteliali. I linfociti B iniziano a produrre le IgA  secretorie nelle urine dopo il legame con i batteri e svolgono il ruolo di tamponare le infezioni     Fattori che giocano un ruolo importante nell’esordio delle infezioni, soprattutto all’interno delle vie urinarie:  • Virulenza del ceppo infettante (il ceppo deve essere intrinsecamente virulento);  • Dose infettante, il numero delle cellule batteriche che hanno un ruolo nell’infezione;  • Suscettibilità dell’ospite  LE TAPPE DEL PROCESSO INFETTIVO   PENETRAZIONE cui si contrappongono   difese idrocinetiche o idrodinamiche basate su fattori meccanici e fisici: il flusso dell'urina fa sì che i batteri che  non sono saldamente ancorati alla mucosa vengono portati via.   caratteristiche chimiche dell’urina   ADESIONE, inibita da   difese antibatteriche aspecifiche, molecole che rappresentano una difesa immediata e aspecifica contro i batteri  che cercano di invadere il nostro corpo come antibiotici endogeni o glicosamminoglicani   difese immunologiche locali (IgA secretorie)  INFEZIONE.    esordio del processo infettivo altamente dinamico nel quale i leucociti, ad attività fagocitaria, svolgono un ruolo  importante  sia nell’uccidere  i batteri  che cercano di penetrare,  sia nel  rilascio di mediatori dell’infiammazione  (citochine,  chemochine)  che  sono  alla  base  dei  meccanismi  cellulo‐umorali  dell’insorgenza  e  mantenimento  dell’infezione.  FATTORI FAVORENTI L’INSORGENZA DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE   FATTORI ANATOMICI, come    lunghezza dell’uretra, che nella donna è di 3 cm mentre nell’uomo è estremamente più lunga (12‐13 cm circa);    uropatie  ostruttive,  vi  sono meccanismi  patologici  come  calcoli  o  masse  che  premono  sulle  vie  urinarie  che  possono ostruire il deflusso di urina;    anomalie congenite del rene;    lesioni renali acquisite, sia di carattere infiammatorie che di altro tipo.  7    FATTORI FISICI, come    incompleto svuotamento durante la minzione della vescica. Un caso classico è un individuo di sesso maschile con  adenoma prostatico che determina un progressivo aumento del bassofondo vescicale; questo rappresenta la parte  declive  della  vescica  nella  quale  rimane  urina  anche  dopo  la  minzione:  il  mancato  svuotamento  deriva  dall’occlusione portata dalla compressione tumorale;    aumentata pressione intravescicale;   cateterismo vescicale o altre manovre strumentali invasive.  FATTORI CHIMICO‐UMORALI, come    ridotto  volume  urinario,  fattore  importantissimo  sia  per  la  prevenzione  delle  infezioni  sia  per  coadiuvare  la  terapia. Per incrementare il volume urinario, si consiglia di bere almeno 1.5 L di acqua al giorno;    alcalinità delle urine: quando si alza  la fisiologica acidità delle urine si ha una maggiore possibilità di contrarre  infezioni   ridotto potere battericida della parete vescicale;    malattie metaboliche sistemiche, come il Diabete mellito, la Gotta o Ipokaliemia;  ALTRI FATTORI:    ritenzione urinaria abitudinaria;    stipsi;    vulvo‐vaginiti e balaniti.  BATTERI NELLE URINOCOLTURE DI PAZIENTI CON IVU   S. aureus;   S, epidermidis, commensale del tratto cutaneo vicino all’orifizio uretrale;   Serratia Marcescens(enterobatterio);   Proteus(enterobatterio);   Pseudomonas Aeruginosa(opportunista);   Enterococcus aerogenes, è un cocco Gram+ opportunista;   Klebsiella;   Proteus mirabilis;   Enterococchi, batteri di provenienza intestinale come anche Proteus e Klebsiella;   E.coli, il più frequente nelle infezioni delle vie urinarie.  LA DIAGNOSI DELLE INFEZIONI URINARIE   CLINICA,  sintomi ascrivibili all’interessamento delle basse vie urinarie:   pollachiuria, associata a oliguria,    urgenza minzionale talora con incontinenza diurna    dolore addominale durante la minzione = stranguria (sintomo più raro che indica una forma più grave);   urine maleodoranti e/o torbide;   bruciore alla minzione;  La febbre si correla ad infezione del parenchima renale, quando l’infezione è grave o molto estesa.  ESAME DELLE URINE,   valore negativo di leucociti < 10/mL; valore positivo leucociti > 100/mL   Tracce di nitriti (risultato del metabolismo batterico),   Tracce di globuli rossi oppure significativa presenza di emoglobina;   Proteinuria importante;   Cilindri, sono sempre un dato patologico.  URINOCOLTURA,   Raccolta  Coltura quantitativa (CFU/ml) Specifiche  CATETERISMO  VESCICALE   Nel bambino febbrile ≥ 5x105/ml avviene quasi sempre in ambiente ospedaliero ASPIRAZIONE  SOVRAPUBICA  essendo  l’urina  teoricamente  e  fisiologicamente  sterile,  qualunque  crescita  di  patogeni  urinari  è  un  segno di infezione;  Il metodo più invasivo che si  impone in pochissimi casi,  quando si sospetta che l'agente eziologico sia un batterio  aerobio: le urine vengono a contatto con l'O2 ed eventuali  batteri anaerobi muoiono.  MITTO  INTERMEDIO  Nel bambino sintomatico ≥ 5x105/ml Nel  bambino  asintomatico  ≥  5x105/ml in almeno 2 campioni  Materiale raccolto per la diagnosi microbiologia. La prima  parte viene  tolta e  la  successiva viene  trattenuta  in un  contenitore sterile con tappo a tenuta  SACCHETTO  STERILE  Nel bambino sintomatico ≥ 5x105/ml Nel  bambino  asintomatico  ≥  5x105/ml in almeno 2 campioni  Usato quando un bambino è molto piccolo e deve essere  cambiato ogni  20‐30 min  ! 10    Più raramente le faringo‐tonsilliti possono essere causate da    STREPTOCOCCHI BETA‐EMOLITICI DI GRUPPO C o G: S. dysgalactie, S. consellatus.    alcuni CORYNEBATTERI:    C. hemoliticum,    C. diphteriae (Si manifesta nei soggetti non vaccinati contro la difterite)   Bacillo Gram+;   Pleiomorfo;   Asporigeno;   Immobile;   Tipica distribuzione dei batteri a “lettere cinesi”.   La  patogenicità  del  batterio  è  dovuta  alla  produzione  della  tossina  difterica  che  ha  un  particolare  trofismo per le fibre muscolari striate e cardiache.    La  caratteristica,  quasi  patognomonica,  della  faringite  da  C.  diphteriae  è  la  presenza  di  pseudomembrane grigiastre fortemente aderenti alla mucosa della faringe.   L’isolamento colturale può avvenire in:   terreno di Loffler = siero di vitello coagulato, nel quale i bacilli difterici crescono molto rapidamente   terreno di Hoyle = agar sangue arricchito con tellurio di potassio, scaldato a 60°C ‐> Corinebateri  metabolizzano  il  tellurito  di  potassio  riducendolo  a  metallo  (tellurio),  la  cui  precipitazione  conferisce una colorazione grigia‐nerastra alle colonie.  Le colonie possono avere 3 diversi aspetti:  → gravis: colonie grandi, piatte, grigio‐nerastre;  → mitis: colonie più piccole, lucide e cupoliformi;  → intermedius: colonie molto piccole, più o meno lucide.   NEISSERIA GONNOREAE (in pazienti con infezioni genitali),    STREPTOCOCCHI BETA EMOLITICI DI GRUPPO B (S. agalactiae nei neonati),    LIEVITI (candidosi esofagea, ma anche orale e faringea in immunocompromessi),    TEST MICROBIOLOGICI NELLE INFEZIONI DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE  TAMPONE FARINGEO‐TONSILLARE →  faringo‐tonsillite, difterite, angina di vincent, pertosse e infezioni virali   MODALITÀ DI PRELIEVO:  1. Utilizzando un abbassalingua, comprimere delicatamente la lingua sul pavimento della bocca;  2. Inserire il tampone tra le tonsille, al disotto dell’ugola, evitando di toccare la mucosa delle guance, (soprattutto) la  lingua, l’ugola e le labbra poiché fortemente colonizzate dalla flora commensale;  3. Strofinare e ruotare vigorosamente il tampone sul retro‐faringe;  4. Utilizzare tamponi  in dacron, evitando il cotone (tossico per alcune specie microbiche) o l’alginato di calcio (un  inibitore della PCR);  Non eseguire mai il tampone faringeo se vi è un sospetto di epiglottidite acuta perché può indurre una grave ostruzione  delle vie aeree superiori. La diagnosi di tale malattia è su base esclusivamente clinica.    L’ISOLAMENTO COLTURALE è il gold standard, tuttavia è possibile porre diagnosi rapida mediante ricerca antigenica  nel campione (es. agglutinazione al lattice nel campione). Si procede, dunque con:   semina   inoculazione per strisciamento su piastre al sangue (generalmente sangue di montone) non selettive oppure  selettive (come il Columbia CNA agar, contenente colistina ed acido nalidixico, che inibisce i GRAM ‐);   incubazione in atmosfera al 5‐10% di CO2 oppure in anaerobiosi ad una temperatura di 37 °C per 16‐24 h; al  fine  di mettere  in  evidenza  eventuali  agenti  patogeni  francamente  anaerobi.  Lo  Streptococco  è  aerobio‐ anaerobio facoltativo e ciò vuol dire che cresce sia in aerobiosi che in anaerobiosi.   Al termine dell’incubazione si recuperano le piastre e si osservano ad occhio nudo.   aspetto colonie    Piccole colonie (dal diametro di 0.5 mm), cupoliformi, con margine continuo, secche (o raramente mucose).   La β‐emolisi è più evidente in condizioni anaerobie perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno.  Questo fatto vero in modo assoluto per lo Streptococco Pneumonie (per il quale quindi si richiede una doppia  incubazione), mentre non è vera per S.Pyogenes, dove l’emolisi Beta si evidenzia anche in ambiente aerobio.   aspetto microscopico   Colorazione Gram: cocchi Gram+, disposti in corte o lunghe catenelle, talvolta (raramente) a grappolo.   test biochimici   Catalasi ‐ se è Streptococcus Pyogenes (a differenza degli stafilococchi che, invece, sono catalasi +);   La sensibilità alla bacitracina a bassa concentrazione è stata utilizzata fino ad alcuni anni fa come metodo di  screening, ma i risultati talvolta non sono attendibili.    Positività alla prova della PYR, (anche alcuni ceppi dei gruppi C e G possano essere positivi);   Sensibilità alla bile.  11    ESAME MICROSCOPICO PER L’ANGINA DI VINCENT   il  tampone  faringeo  viene  strisciato  su  vetrino  portaoggetti,  colorato  con  colorazione  di  Gram  (o  Ziehl‐Nielsen)  ed  esaminato a massimo ingrandimento (1000 x).  → l’esame negativo = presenza di morfotipi propri della flora commensale (es. cocchi, bastoncelli, miceti);  → l’esame  positivo  =  presenza  di  fusobatteri  che  si  presentano  di  forma  allungata  e  con  le  estremità  appuntite  (Fusobacterium spp.) o spirilli Gram‐ (Borrelia spp.), normalmente assenti nella flora orofaringea.    INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE    Bronchite;   Polmonite;   Ascessi polmonari;   Empiema pleurico.  I PIÙ COMUNI PATOGENI implicati nelle infezioni delle basse vie respiratorie:  BRONCHITI ACUTE   Virus respiratori (nel 90% dei casi)   Bordetella pertussis      Mycoplasma pnemoniae   Chlamydia pneumoniae   POLMONITE DI  COMUNITÀ   Streptococcus pneumoniae   (agente eziologico della polmonite lobare franca)  Mycoplasma pneumoniae   (= polmonite atipica di Eaton),    bacilli Gram‐ enterici (quindi Enterobacteriaceae),  virus influenzali, Hantavirus, Coronavirus…   raramente  Mycobacterium  tuberculosis  e  supercalifragilistichespiralidosoi    Haemophilus influenzae,    Legionella spp.   Klebsiella spp.,    Staphylococcus aureus   Chlamydia spp.     Moraxella catharralis    POLMONITE  NOSOCOMIALE   Pseudomonas aeruginosa,   Enterobacter spp.,    Klebsiella pneumoniae,    Acinetobacter spp.,    Legionella spp.,      Haemophilus influenzae   Staphylococcus aureus    Streptococcus pneumoniae    POLMONITE ACUTA   Nei bambini si hanno, soprattutto  virus respiratorio sinciziale,    i virus parainfluenzali I, II, III;    più rari sono i virus influenzali A e B.     Tra gli adulti è molto frequente   il virus influenzale A o B,    il virus respiratorio sinciziale   Gli  adenovirus  (soprattutto  nelle reclute militari)  POLMONITE   =  infezione  del  parenchima polmonare  distale  ai  bronchioli  terminali,  associata  ad  evidenza  clinica  e  radiologica di  addensamento di aree polmonari  POLMONITE ACUTA  Ha un’insorgenza rapida ed è caratterizzata da    malessere,    febbre elevata ingravescente oppure improvvisa con brividi scuotenti (nella polmonite pneumococcica).    Il  sintomo  principale  è  rappresentato  dalla  tosse.  Negli  adulti  la  tosse  diviene  produttiva  con  la  formazione  dell’escreato costituito da materiale purulento più o meno ricco di polimorfonucleati negli alveoli e nei bronchioli.   Segni di alterazione degli scambi gassosi alveolari dovuti alla presenza dell’essudato: aumento della frequenza  respiratoria, dispnea e, nei casi più gravi, cianosi.    Vi sono diversi tipi di polmonite:    POLMONITE LOBARE: denota un processo alveolare che coinvolge un intero lobo;   POLMONITE LOBULARE: denota un processo che coinvolge una porzione di un lobo (lobulo);   BRONCOPOLMONITE: denota un processo alveolare diffuso in zone diverse, contigue ad un bronco;   POLMONITE  INTERSTIZIALE  O  POLMONITE  ATIPICA:  infezione  sparsa  dell’interstizio  (quindi  vicina  all’ilo  polmonare) che coinvolge zone ricche di fibre elastiche e di fibre collagene.  È sostenuta da microrganismi diversi tra cui:   Mycoplasma pneumoniae (agente eziologico della polmonite atipica primaria di Eaton);  → ha uno spiccato tropismo per le cellule ciliate che attacca e distrugge.  → È il più comune agente di infezioni polmonari nella fascia di età tra i 5 e i 35 anni  → responsabile di epidemie (es.scuole) che si diffondono lentamente, (periodo di incubazione di 10–14 gg)   alcuni  virus  (come  RSV,  Adenovirus).  Nel  2003  è  stata  registrata  un’epidemia  di  polmonite  atipica  da  Coronavirus (SARS‐CoV); nel 2019 quella da SARS‐CoV‐2   Fra i miceti, Cryptococcus neoformans, Aspergillus e Candida spp. possono essere responsabili di polmonite  atipica in pazienti fortemente immunodepressi.  comune  soprattutto  negli  immunodepressi  e  nei soggetti affetti da fibrosi cistica.  12      DIAGNOSI DIFFERENZIALE FRA POLMONITE TIPICA E ATIPICA      TIPICA ATIPICA  ESORDIO  rapido con febbre alta e brividi più subdolo (5 ‐ 7 giorni)  RADIOLOGIA  addensamento intra alveolare addensamento  interstiziale,  diffuso,  ma  con  particolare riferimento alla zona peri‐ ilare.  ESAME  OBIETTIVO  vi è sempre il consolidamento la presenza del consolidamento dipende dalla  diffusione dell’infezione  ESCREATO  purulento e rugginoso (per la rottura di piccoli  capillari  per  l’avanzamento  rapido,  repentino,  del processo infettivo)  mucoide ETÀ  Ogni età  Tipica negli adolescenti   DOLORE  PLEURICO  ‘a pugnalata’ (pleurite consensuale) Raro  CONTA  LEUCOCITARIA  aumentata, 12000 o molto più alti e sono quasi  tutti neutrofili  normali o soltanto leggermente aumentati     POLMONITE BATTERICA  STREPTOCOCCUS  PNEUMONIAE è  l’agente eziologico più  isolato nella “polmonite di comunità” (responsabile del  90% di tutti i casi di polmonite). Il batterio arriva al polmone per via inalatoria, colonizza i piccoli bronchi, si replica e dà  origine al processo infiammatorio a livello degli spazi alveolari, in cui si accumula un fluido ricco di proteine. Può, poi,  diffondere agli alveoli vicini dando luogo alla polmonite lobare.   Si possono avere, spesso, batteriemie e infezioni extrapolmonari come artrite settica, endocardite, meningite e sepsi.      POLMONITE ACQUISITA IN OSPEDALE  Insorge in un tempo compreso o superiore le 48h dal ricovero e si configura essere come la seconda causa più frequente  delle infezioni nocosomiali: si registrano dai 5 ai 10 casi ogni 1000 ricoveri; l’incidenza risulta molto più elevata se il pz  è sottoposto a ventilazione meccanica. È la prima infezione nocosomiale se si considera la mortalità (che è del 70% circa)  e morbilità. La degenza, per questi pz, aumenta di 7‐9 giorni.    IL RUOLO DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA NELLE INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE  L’obiettivo è quello di rilevare l’agente eziologico per permettere la terapia appropriata, mirata o personalizzata.  I test disponibili sono:   L’osservazione  microscopica  di  un  vetrino,  quindi  l’osservazione  dell’escreato  con  opportune  colorazioni  per  mettere in evidenza batteri e funghi;   L’esame sierologico nel caso di alcuni virus o di batteri come M.pneumoniae e C.pneumoniae;   La ricerca dell’antigene, soprattutto nel caso di batteri come L.pneumophila e S.pneumoniae e di virus come il  virus respiratorio sinciziale   La PCR, sempre più frequente oggigiorno, che, attraverso l’utilizzo di cartucce forniscono un risultato nel giro di  poco più di un’ora. È utilizzata per diagnosi dei virus respiratori e dei batteri fastidiosi (che possono crescere con  difficoltà o non crescere proprio nei terreni di coltura);   La coltivazione virale, la quale è però una tecnica molto complicata e ha bisogno di personale molto esperto (tanto  che attualmente non viene utilizzata quasi mai).   Dagli  anni  2000  è  diffusa  l’applicazione  della Multiplex  RT‐PCR,  che  è  provvisto  di  cartucce  che  possiedono  all’interno tutti i reattivi per fare la diagnosi su un unico campione di 10‐20, agenti eziologici diversi di natura sia  virale sia batterica: dopo un tempo di circa 50min, viene fuori il risultato basato sull’amplificazione di un gene o di  una porzione di esso che è caratteristico e conservato per quell’agente virale o batterico.   Biomarker pur non essendo specifici come le PCR, sono molto utili soprattutto in presenza di una negatività dei  test specifici. Si può avere:   hsCRP (proteina C reattiva ad alta sensibilità);   PCT (procalcitonina), importante in tutte le forme di sepsi e nelle forme di polmonite.  Fattore  importantissimo è  IL  TEMPO: nelle polmoniti e,  in generale, nelle  infezioni respiratorie, un ritardo di più di  quattro ore  (dopo  il  ricovero ospedaliero) nel  trattamento antibiotico è associato ad un significativo aumento della  mortalità: è, quindi, necessaria una diagnosi rapida di polmonite ed un’accurata diagnosi differenziale dalle malattie  respiratorie virali e dalle cause non infettive, necessaria al fine di stabilire la terapia più appropriata.        15      DIAGNOSI DI LABORATORIO  vengono prelevati i campioni respiratori: tamponi nasofaringei e orofaringei e, con questi, si può procedere alla   rilevazione del genoma virale (RNA) dei campioni mediante test molecolare (RT‐PCR; qRT‐PCR)  → i geni S, E, M, N vengono sfruttati per allestire i test molecolari:  1° Test screening: gene E  2° Test confermatorio: gene RdRp o N.   isolamento virale in coltura di cellule   test sierologici (rapidi: qualitativi gocce di sangue o semiquantitativi da sangue venoso) tenendo conto che:  → le IgM, prodotte nella fase iniziale dell’infezione, forniscono una protezione a breve termine (5/6 settimane)  → le IgG prodotte durante la prima infezioni sono, generalmente, responsabili della protezione a lungo termine  (nel caso di questa infezione durano, però, 4/5 mesi)  → si è visto come le IgA (immunoglobuline secretorie) si presentavano prima delle altre nelle mucose di naso e  bocca, come prima difesa dell’agente patogeno   test di sieroconversione, ossia il passaggio da una forma di negatività a una forma di positività              16    MICROBIOLOGIA DELL’APPARATO CARDIOVASCOLARE  Il sistema cardiovascolare appartiene al gruppo di distretti anatomici che sono normalmente sterili, quindi le infezioni  intravascolari (le batteriemie, sepsi e shock settico) e le infezioni del cuore (pericarditi, miocarditi ed endocarditi) sono  dovute a batteri che provengono dall’esterno.  LE BATTERIEMIE    TRANSITORIE (a volte intermittenti) si manifestano in seguito ad eventi particolari (per esempio, estrazione di  denti o tecniche invasive di tipo diagnostico‐terapeutico). Sono così definite perché le difese immunitarie sono in  grado di eliminare l’agente responsabile, per cui la batteriemia si esaurisce in un tempo limitato.    PERSISTENTI: oltre a manifestarsi clinicamente con ipertermia associata a brividi, possono preludere la comparsa  della SEPSI.               L’evoluzione della sepsi può essere:    Rapida: si passa rapidamente dalla sepsi acuta allo shock settico;    Lenta:  progressione  lenta  con  esito  in  endocardite  infettiva  caratterizzata da micro‐emboli ed ischemie.    La  sepsi  si  definisce  come  un’infezione  che  deve  presentare  almeno  due  criteri  della  SIRS  (sindrome  da  risposta  infiammatoria sistemica). Sono state individuate diverse forme di sepsi:   SEPSI SEVERA: sepsi con una o più disfunzioni di organo/sistema dovuta a ipoperfusione o ipotensione   cardiovascolare (ipotensione o shock)   respiratoria (ipossiemia)   renale (anuria o oliguria)   SHOCK SETTICO: sepsi grave con ipotensione resistente alla “fluid resuscitation” (tecnica rianimativa che consiste  nel tentativo di ripristino della perfusione dei tessuti vitali mediante somministrazione di fluidi per via intravenosa)  e che richiede intervento farmacologico (agenti vasopressori o inotropici, generalmente sostanze simpatiche come  le catecolammine o ammine biogene con effetto vasocostrittore). ‐> la pressione arteriosa è inferiore a 70mmHg   MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome) – ipotensione e ipoperfusione che risultano in disfunzione a livello  di diversi organi e sistemi.   MOFS – Multiple Organ Failure Sydrome   CID – Coagulazione Intravascolare Disseminata  3 alternative della fase finale, spesso mortale e letale, dello shock settico; sovrapponibili temporalmente     In tutti i casi è presente, dunque, una coesistenza di evidenza di infezione e almeno altri due criteri della SIRS tra:  → temperatura elevata (sopra i 38°C) o ridotta (sotto i 35°C)  → frequenza respiratoria elevata a riposo (più di 20 atti respiratori al minuto),   → variazione delle cellule bianche (> 12000mm2 o < 4000mm2),   → presenza di forme immature delle cellule bianche   → aumento della frequenza cardiaca a riposo (più di 90 battiti al minuto).     sindrome da risposta infiammatoria sistemica, caratterizzata dalla produzione  di citochine come TNF‐α, IL6, IL8 e IL12     I PIÙ COMUNI AGENTI EZIOLOGICI DI SEPSI BATTERICA  BATTERI GRAM –    enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella, P. aeruginosa).    Acinetobacter, (che, insieme a Klebsiella, ultimamente, è responsabile di numerose infezioni ospedaliere, spesso  con elevata resistenza agli antibiotici.   Meno frequentemente si possono riscontrare infezioni da salmonella, haemophilus e nesserie  → Sedi di origine: polmone (sede principale), cavità addominale, torrente ematico, tratto urinario  BATTERI GRAM +   Stafilococchi: S.aureus e stafilococchi coagulasi‐negativi (CoNS)   Streptococchi: S.pyogenes, S. viridans e, soprattutto, lo S.pneumoniae  → Le sedi di origine possono essere cute, tessuti molli, cateteri, apparato respiratorio.          dal greco σήψις, “putrefazione” = è una sindrome clinica costituita da un insieme di  specifiche  alterazioni  emodinamiche,  respiratorie, metaboliche  e  immunologiche,  scatenata  da  un  processo  infettivo  ma  che  ha  come  substrato  patogenetico  un’abnorme risposta infiammatoria sistemica da parte dell’ospite.   17    L’INFEZIONE PUÒ AVERE ORIGINE DA DIVERSI FOCOLAI SEPSIGENI:   CAVO ORALE: per stafilococchi e streptococchi che abbondano nel cavo orale, molto raramente batteri anaerobi   APPARATO DIGERENTE per enterobatteri e batteri anerobi.   VIE URINARIE: sono un focolaio per quanto riguarda gli enterobatteri, gli E. Coli, la klebsiella e altre specie.   APPARATO  GENITALE  FEMMINILE:  raramente  diventa  focolaio  sepsigeno,  (≠  tempo  fa,  soprattutto  dopo  il  parto o più frequentemente in caso d’aborto). Gli agenti eziologici sono gli enterobatteri ed i batteri anerobi.   ALTE  VIE  RESPIRATORIE:  soprattutto  in  corso  di  ventilazione  assistita,  gli  agenti  eziologici  incriminati  sono  pseudomonas e, meno frequentemente, legionella.   LA CASCATA INFIAMMATORIA                                      Azione diretta                                       Azione indiretta      tramite  fattori  secondari  come:  l’ossido  nitrico  e  il  radicale libero dell’ossigeno e dell’azoto, gli eicosanoidi  (trombossani,  leucotrieni,  prostaglandine),  il  PAF  e  numerosi  fattori  che  derivano  dal  sistema  del  complemento o dal sistema di coagulazione del sangue                                           Durante la cascata patogenetica nella sepsi, vengono anche rilasciate delle citochine ed altri mediatori ad effetto anti‐ infiammatorio  come  IL‐10,  l’IGF‐β,  l’IL‐1  receptor antagonist,  l’sCD25 e  l’IL‐35; di questi, alcuni  (come  IL‐10) hanno  attività  T‐reg  cioè  inibiscono  i  meccanismi  innescati  dai  linfociti  T,  altri,  come  l’IL‐35,  sono  ad  attività  B‐reg,  cioè  inibiscono la cascata patogenetica innescata e gestita dai linfociti B. Inizialmente riescono a bilanciare l’eccessiva attività  infiammatoria  dei  mediatori  precoci  ma,  dopo  alcuni  giorni,  contribuiscono  all’immunodepressione  che  contraddistingue le fasi più avanzate delle sepsi (dopo il settimo, ottavo o nono giorno).  lisi cellula batterica (GRAM ‐) rilascio LPS che si unisce con LPS binding protei a formare il complesso LPS‐LPB liberazione da parte dei macrofagi o cellule endoteliali dotate di recettori CD14, CD11, CD18 o TLR4 o MD2, dei mediatori dell'infiammazione e di IL‐8 (una chemochine il cui ruolo è quello di attrarre leucociti soprattutto neutrofili. TNF, IL‐1, IL‐12, IL‐6, IFNγ FASE  1:  Ipertono  arteriolare  e  costrizione  degli  sfinteri  precapilalri  con  aumento  della  produzione  di  renina.  L'ischemia  capillare  determina  una  diminuzione  dell'apporto  di  O2  ai  tessuti  e  l'instaurarsi  di  un  metabolismo  anaerobio  con  aumento  di  acido  lattico  e  piruvico,  diminuzione  dei  fosfati e iniziale acidosi metabolica  FASE  2:  l’ipossia,  l’acidosi  e  le  anafilotossine  inducono  la  liberazione di  istamina  (porta a  vasodilatazione  arteriolare)  e  serotonina  (che  provoca  la  vasocostrizione  del  segmento  venoso postcapillare). Ne deriva  una  riduzione  del  ritorno  venoso;  ipotensione  arteriosa  che provoca  la stimolazione dei  barocettori  con  conseguente  liberazione di catecolammine  e  aumento  della  vasocostrizione  periferica  FASE  3:  attivazione  della  cascata di coagulazione a causa  del danno endoteliale (diretto e  indiretto); attivazione del fattore  Hageman,  agglutinazione  e  danno  piastrinico  con  liberazione di tromboplastina.  CID  ARDS DANNO MULTIORGANO  I  GRAM  +  rilasciano  acidi  teicoici  e  acidi  lipoteicoici,  esotossine,  super  antigeni,  l’esotossina  A  pirogenica  streptococcica  (SpeA), le emolisine,  20    INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO  ACCESSO DEI MICRORGANISMI AL SISTEMA NERVOSO   la via ematica è la più comune   per difetti congeniti   a causa di traumi, interventi chirurgici, in seguito all’introduzione di cateteri o sonde   attraverso focolai infettivi contigui (otite, foruncolo nasale, osteomielite vertebrale)   per utilizzo dei macrofagi come veicolo dal sangue al sistema nervoso centrale (meningoencefalite da HIV)   per via nervosa periferica (rabbia, encefalite da VZV)   lungo il nervo olfattivo (rabbia, encefalite da naegleria fowleri)  MENINGITI  = processi infiammatori di natura infettiva di   Dura madre ‐> PACHIMENINGITI (rare) si presentano come:   ascessi epidurali (tra la dura madre e il periostio)    empiemi subdurali (tra la dura madre e l’aracnoide)   Aracnoide e pia madre ‐> LEPTOMENINGITI  (o meningiti) sono infiammazioni delle meningi circoscritte entro  lo spazio subaracnoideo e sono sempre cerebrospinali.   In base all’eziologia, le meningiti possono essere classificate in:   BATTERICHE  ‐ patogenesi –     VIRALI → non esistono meningiti virali: si parla di MENINGOENCEFALITI per il coinvolgimento del parenchima  encefalico!  enterovirus (coxsackie)   Arbovirus   Virus parotitico    Herpes virus (HVZ, CMV, EBV)   HIV   Sedenovirus   Virus del morbillo   Virus della rosolia   Virus (para)influenzali   MICOTICHE   PROTOZOARIE   ELMINTICHE  inoltre, in base al decorso, si possono avere meningiti  → acute ‐> forme batteriche, virali, micotiche e protozoarie  → sub acute e croniche (meno frequenti) ‐> TBC, brucella, Lue, criptococcosi  I VARI TIPI DI MENINGITE:  MENINGITE  MENINGOCOCCICA  Si ha uno stato settico e un rush purpurico‐petecchiale (che, oltre alla cute, si può  trovare  sottoforma  di  emorragie  sottocongiuntivali  =  esordio  di  meningite  sostenuta da N. Meningitidis); quasi sempre si tratta di bambini e ragazzi.     MENINGITE TUBERCOLARE  esordio insidioso, molto più lento di quella meningococcica, con decorso subacuto  e cronico e compromissione dei nervi cranici    MENINGITE LUETICA  Si ha la compromissione dei nervi cranici   penetrazione per via nasofaringea, ematogena o per continuità invasione meningea moltiplicazione batterica nello spazio subaracnoideo e liberazione di componenti batteriche (LPS, peptidoglicano) attivazione delle cellule infiammatorie con liberazione di citochine e molecole di adesione per i neutrofili e loro degranulazione (EDEMA CITOTOSSICO) Infiammazione dello spazio subaracnoideo e aumento della permeabilità della barriera ematoencefalica con captazione albumina circolante (EDEMA VASOGENICO) aumento della resistenza riassorbimento liquorale per la presenza di essudato (EDEMA INTERSTIZIALE) IPERTENSIONE & IPOPERFUSIONE CEREBRALE 21    MENINGE CRITOCOCCICA  In  pz  affetti  da HIV  si  riscontrano febbre  e  cefalea  (decorso  subacuto‐cronico)  e  assenza di altri sintomi peculiari    MENINGITE   POST‐TRAUMATICA  solitamente si ha rino‐otorrea per fuoriuscita di liquor dal naso a causa della rottura  totale o parziale dell'etmoide, sostenuta da S. Pneumoniae    NEL NEONATO  assenza delle contratture muscolari e presenza di flaccidità    NELL’ANZIANO  letargia  e  ottundimento  del  sensorio,  possono  mancare  febbre  ed  altri  segni  meningei in quanto, nell'anziano, il sistema immunitario è depresso a causa dell’età     SEGNI E SINTOMI IN PAZIENTI CON MENINGITE BATTERICA   Cefalea   Febbre   Meningismo   Alterazione del sensorio   Vomito   Convulsioni   Alterazioni focali   Papilledema   Rigor nucalis   Segno di Kernig  (difficoltà a  flettere  le  cosce verso  il  bacino: a pz  seduto  si  impedisce questo movimento con  evocazione di un violento dolore al rachide)   Segno di Brudzinski (flettere energicamente con una mano la nuca del pz supino mentre con l'altra, appoggiata al  petto, gli si impedisce di alzare il busto: il segno è positivo quando il pz flette le ginocchia)    LIQUOR.  Viene prodotto dagli ependimociti (detti "taniciti") dei plessi corioidei nei ventricoli cerebrali per secrezione attiva, poi  circola  attraverso  i  due  forami  interventricolari  destro  e  sinistro  (forami  di Monro)  all'interno  del  terzo  ventricolo  cerebrale e attraverso il dotto mesencefalico (acquedotto di Silvio) nel quarto ventricolo cerebrale, da dove fuoriesce  (nei  pressi  del  cervelletto)  attraverso  due  aperture  laterali,  destra  e  sinistra  (fori  laterali  di  Luschka)  e  un'apertura  mediana (forame di Magendie). In seguito, fluisce attraverso la cisterna cerebro‐medullare fino a circondare tutto la  corda del midollo spinale e a lambire e proteggere gli emisferi cerebrali, per poi scaricarsi nel sistema venoso attraverso  le granulazioni del Pacchioni. Il riassorbimento avviene attraverso le cellule dei villi aracnoidei dei seni venosi.     VOLUME TOTALE DEL LIQUOR = 90 – 150 ml  → Protidorrachia = 15‐45 mg/dl  → Cellule = 0‐10 leucociti/ml (linfociti)  → Glucorrachia = 40‐80 mg/dl (60% della glicemia)    In base alle caratteristiche macroscopiche del liquor, si può capire l’eziologia della meningite:   liquor limpido = meningite asettica causata da virus, da tubercolosi, da leptospira, treponema e Brucella   Il  liquor  torbido  = meningite  settica  causata  da  batteri  (tranne  quelli menzionati  precedentemente),  protozoi  (naegleria o acanthamoebus) e miceti (candida o mucor).   Tra i fattori predisponenti di meningite settica si trova l’età        meningite  batterica  meningite  virale  meningite  tubercolare  encefalite  ascesso ASPETTO  Torbido/lattescente  Limpido Limpido Limpido  Limpido/torbido CELLULE  500 ‐ 10.000  neutrofili  50 – 1000 linfo‐ monociti  50 – 1000  linfo‐monociti  5 – 100   linfo‐monociti  5 ‐ 100  neutrofili  PROTEINE  +++  + ++ ‐/+  +++ GLUCOSIO  ↓↓↓  Normale ↓↓↓ Normale  Normale COLTURA  +  + + ‐  ‐   Per la DIAGNOSI EZIOLOGICA DELLE MENINGITI SETTICHE si procede come nello schema nella pagina successiva.  Per quanto riguarda    LA COLORAZIONE DI GRAM permette una rapida identificazione del germe nel 60/90% dei casi   Esame colturale: positivo nel 70/80% dei pz che non hanno ricevuto terapia antimicrobica (per l’identificazione  sono necessarie 48h)   AGGLUTINAZIONE AL  LATTICE: utilizza anticorpi contro antigeni eventualmente presenti nel liquor. È un test  rapido (pronto in 15min) e ha una sensibilità elevata per niesseriae meningitidis, E. coli, Haemophilus influenza,  Streptococcus pneumoniae o Streptococcus di gruppo B. La negatività del test, però, non esclude la presenza di  meningite batterica ma rimane utile se sia Gram, sia le colture non hanno dato risultati.   PCR utile per escludere diagnosi di meningite batterica      22        DIAGNOSI EZIOLOGICA DELLE MENINGITI ASETTICHE.   MENINGITE  TUBERCOLARE →  l’aspetto del  liquor è  limpido,  talvolta paglierino con proteine che  formano  il  reticolo di Maya, linfomonociti tra 100‐1000, proteine maggiori di 50mg al dl e glucosio minore di 45mg (ridotto  perché è consumato sia dalle cellule che dal micobatterio). Il micobatterio in questione è il m. tubercolosis    MENINGITE DA MOTT (da micobatteri non tubercolari) → Il liquor è limpido, talvolta giallino, linfomonociti da  100 a 1000, proteine maggiori di 50, il glucosio inferiore a 45. L’agente eziologico è M. avium oppure M. kansasii.    MENINGITE DA MYCOBACTERIUM  FORTUITUM →  il  liquor è limpido, talvolta torbido. I neutrofili possono  essere da 200 a 2000, le proteine maggiore di 50, il glucosio inferiore a 45    MENINGITE DA SPIROCHETE (treponema, borrellia, leptospira) → il liquor dall’aspetto sempre limpido, il tipo  cellulare  da  25  a  2000  linfomonociti,  proteine  inferiore  a  50,  glucosio  normale  o  raramente  diminuito. Non  è  possibile  coltivarli  e  si mettono  in  risalto  con  immunofluorescenza o microscopio per  contrasto di  fase  (in  cui  saranno visibili per la presenza di endoflagelli)   studio delle colonie  emolisi & ricerca dell'antigene → STREPTOCOCCHI A, B, C, D, F, G AGAR SANGUE  • test biochimici → STAPHYLOCOCCUS SP MSA  test biochimici → ENTEROBATTERI MACCONKEY AGAR  test di germinazione  se positivi → CANDIDA ALBICANS  se negativi → test biochimico per conferma di presenza di MICETI SABOURAUD AGAR  studio delle colonie &  test biochimici → NEISSERIA MENINGITIDIS → HAEMOPHILUS SP AGAR CIOCCOLATO SUPPLEMENTATO IN CO2 25    MALATTIE SESSUALMENTE TRASMISSIBILI  CLASSIFICAZIONE PER AGENTE EZIOLOGICO:    BATTERI    Treponema pallidum → LUE o sifilide  Neisseria gonorrhoeae → gonorrea   Chlamydia trachomatis → clamidia   Haemophylus ducreyi → ulcera venerea     Mycoplasma hominis;    Mycoplasma genitalium;    Gardnerella vaginalis;    Streptococcus β‐emolitico di gruppo B  VIRUS   Herpes simplex di tipo 1 e 2    HPV   Virus dell’epatite: HAV, HBV, HCV, HDV     Citomegalovirus   virus di Epstein‐Barr   HIV  PROTOZOI   Trichomonas vaginalis,    Entamoeba histolytica      Giardia Lamblia  FUNGHI    Candida albicans    ECTOPARASSITI    Phthirius pubis;      Sarcoptes scabiei, → Scabbia    LUE O SIFILIDE  È  la  terza MST per  diffusione  al mondo.  La  via  di  trasmissione  è prevalentemente  sessuale  (contatto delle mucose  genitali) ma vi può essere anche mediante sangue, saliva e per via transplacentare. La sifilide si divide in tre fasi:   sifilide  primaria  →  a  livello  delle  mucose,  il  treponema  attraversa  le  giunzioni  e  si  moltiplica  nel  punto  di  penetrazione causando, dopo circa 10/20gg una papula (sifiloma primario o chancre) che, dopo pochi giorni, si  trasforma  in  un’ulcera  a  fondo  duro,  indolore,  nel  cui  essudato  si  può  rinvenire  il  batterio;  poi  si  avrà  una  linfoadenopatia regionale e, successivamente, il passaggio dal sistema linfatico al torrente circolatorio. Il sifiloma  primario guarisce spontaneamente in 2 mesi, a volte anche prima.   Se non curata, passati 3 mesi, si avrà la dissipazione del treponema in diversi distretti corporei con:    rush mucocutaneo di  tipo maculo‐papulare o pustolare  sulle mani e sui piedi  (se  il  90% dei  rash cutanei  risparmia il palmo delle mani, in questo caso è colpito preferenzialmente)   faringodinia   cefalea   anoressia   linfoadenopatia  Il rash e i sintomi migliorano e il pz entra nella fase latente o clinicamente inattiva dello stadio di malattia: anche  questa  forma  secondaria  (molto  infettiva  dato  che  le  singole  papule  contengono  molti  treponemi)  spontaneamente guarisce. La fase latente può durare anche molti mesi o, addirittura, anni.   Sifilide terziaria: nei pz non trattati si instaura una malattia cronica diffusa di tipo granulomatoso che può causare  distruzione devastante di organi e tessuti (tra cui arteriti, demenza, cecità). Si ha la formazione di gomme luetiche,  lesione granulomatosa, priva di batteri, con necrosi colliquativa e cellule giganti, presente sulle ossa (in particolare  sui corpi vertebrali), sulla cute ed altri tessuti; queste guariscono spontaneamente lasciando cicatrici deformanti.  Le forme tipiche e più gravi sono la Neurosifilide (con distruzione progressiva delle radici posteriori e sclerosi dei  cordoni posteriori, quindi, disturbi nella coordinazione dei movimenti, paralisi progressiva e dolori agli arti inferiori)  e la Sifilide cardiovascolare (che comporta aneurisma dell’aorta).  TEST DIAGNOSTICI  I test comprendono test sierologici per la sifilide (STS) che consistono in:   test di screening (reaginici)   test di conferma (treponemici)   microscopia in campo oscuro  ‐ alcuni problemi ‐  1. Il T.pallidum non può essere coltivato in vitro. L’unico ceppo coltivabile è quello di Nelson, coltivato nel testicolo  del coniglio e utilizzato per produrre antigeni a loro volta utili per i test sierologici.  2. non è detto che il batterio si veda in microscopia data la sua dimensione assottigliata. Per questo viene preferita  la microscopia in campo oscuro oppure si impregna il campione con una sostanza che lo rende fluorescente.  → I   TEST  NON  TREPONEMICI  (O  REAGINICI)  utilizzano  un  antigene  lipidico  ossia  la  cardiolipina  (o  Aptene  di  Wasserman), estratto dal cuore di un bovino per rilevare la reagina (anticorpo umano che si legano ai lipidi).   I TEST DEL VDRL (reazioni di flocculazione) e il RPR, utilizzati per lo screening, sono esami sensibili, semplici e poco  costosi; tuttavia, non sono completamente specifici per il treponema: la cardiolipina è un antigene rilasciato dai tessuti  danneggiati durante l’infezione e potrebbero verificarsi reazioni crociate: se le reazioni sono positive si procede con la  conferma. Il risultato può essere definito qualitativamente e quantitativamente come titolo (= il reciproco dell’ultima  rilevazione alla quale il test risulta positivo ‐> 1:16, il titolo è 16).   Un vantaggio offerto da questo tipo di test è che è molto fedele per il follow up della malattia: nel giro di 1‐2 anni,  se la terapia è riuscita ad eradicare il batterio, il test reaginico si negativizza.  26    → I  TEST TREPONEMICI: sono test molto specifici che rilevano gli anticorpi anti‐treponemici. Comprendono:    REAZIONE DI ADSORBIMENTO IN FLUORESENZA, FTA‐ABS.  Prima di effettuare la tecnica, il siero viene fatto  adsorbire  con  antigeni  treponemici  aspecifici  (per  eliminare  quelle  Ig  dirette  contro  antigeni  treponemici  aspecifici); dopo si poggiano alcune gocce del siero su un vetrino che contiene sospensione di treponemi uccisi  ottenuti dal testicolo di un coniglio. Si incuba e poi si lava. Dopo si aggiunge un siero immune anti‐globuline umane  marcato con fluorescina, si incuba e si lava nuovamente. Quindi si osserva al microscopio a luce ultravioletta.   REAZIONE DI EMOAGGLUTINAZIONE PASSIVA, TPHA. Gli antigeni treponemici vengono fatti adsorbire sulla  superficie di globuli rossi; dopo si aggiunge il siero. La positività è data dall’emoagglutinazione   REAZIONE DI  IMMOBILIZZAZIONE DEI TREPONEMI, TPI. Si fa reagire il siero del pz con una sospensione di  treponema  pallido  ottenuto  dal  testicolo  di  un  coniglio  infetto.  In  presenza  di  complemento,  gli  anticorpi  si  legheranno alla superficie del treponema e lo immobilizzeranno: ciò si può apprezzare mediante osservazione al  microscopio con campo oscuro.  I test treponemoci possono rimanere positivi anche per tutta la vita    GONORREA O BLENORRAGIA  L’agente patologico è la neisseria gonorrhoeae   Nell’uomo, il gonococco si localizza nell’uretra nella quale causa secrezioni tipiche purulente: al risveglio il pz si  accorge  della  secrezione  di  pus  denso,  cremoso  e  giallastro  dall’orifizio  uretrale.  L’infezione  può  diffondere  causando orchiti, artriti, endocarditi e meningiti   Nella donna, il gonococco si localizza primariamente nelle ghiandole della cervice uterina, nelle ghiandole di Skene  e di Bartolini.  I sintomi non sono ben evidenti.  Il batterio può diffondere causando  infezione delle salpingi con  conseguente  infertilità.  Nelle  bambine  piccole,  dopo  abuso  sessuale,  si  possono  avere  vulvovaginiti,  in  cui  la  colonizzazione avviene a livello vaginale.   Nel 10/20% delle donne venute a contatto con N.gonorrhoeae, si può avere malattia infiammatoria pelvica:  l’essudato purulento si riversa nella cavità peritoneale.    Sindrome di Fitz‐Hugh‐Curtis: periepatite secondaria a salpingite. Nella donna l’apparato genitale è aperto:  in caso di salpingite importante, l’essudato può “cadere” libero nel peritoneo causando tale sindrome.  Oltre a queste manifestazioni si può avere    Proctite acuta ‐> perdite purulente dal retto   Faringite ‐> eritema faringeo   Infezione gonococcica disseminata (nell’1% dei casi)   Setticemia ‐> il gonococco entra in circolo, si moltiplica e da luogo a shock endotossico mediato dal LPS del batterio  (LOS) con febbre, brividi e rash petecchiale.   Artrite settica ‐> disseminazione alle articolazioni con febbre e segni di artrite (tumor, calor, rubor, dolor)   Oftalmia neonatorum ‐> affezione tipica dei neonati con trasmissione attraverso il passaggio dal canale del parto,  colonizza  la congiuntiva dell’occhio provocando congiuntivite purulenta che, se non trattata, si complica  fino a  cecità.  Viene  prevenuta  oggigiorno  con  la  profilassi  alla  Credè,  praticata  per  legge  alla  nascita:  si  applica  alla  congiuntiva del bambino una crema a base di eritromicina, tetraciclina, nitrato di argento.  TEST DIAGNOSTICI  A  seconda del  caso clinico,  i  campioni biologici possono essere:  tamponi uretrali  (i più  frequenti);  tamponi vaginali;  tamponi cervicali; tamponi rettali; tamponi faringei; liquido sinoviale; sangue   ESAME  MICROSCOPICO:  la mucosa genitale  possiede popolazione  commensale  che non presenta Neisserie,  quindi,  il  reperto  microscopico  di  Gram  ‐,  a  chicci  di  caffè  capsulati  in  un  essudato  purulento  derivante  da  infiammazione acuta delle vie genitali è già indicativo di gonorrea. Tuttavia, alcuni bacilli Gram‐ possono simulare  l’aspetto del gonococco: per questo sono impiegati sieri antigenococcici fluorescenti sul materiale patologico   ESAME COLTURALE: Il gonococco forma colonie S, che perdono facilmente l’antigene K divenendo di tipo R. i  terreni su cui poter coltivare sono tanti e vari,  il più interessate è il Thayer‐Martin: è a base di agar cioccolato,  vancomicina con colistina e nistadina, per cui  i batteri (e  i  funghi visto la presenza di nistadina) sono inibiti e  il  terreno è altamente selettivo e quindi può crescere soltanto Neisseria.   REAZIONI  SIEROLOGICHE: sono utili nel caso in cui non sia reperibile un campione da prelevare, in seguito a  guarigione clinica dell’infezione. Si ricerca la presenza di anticorpi nei confronti di antigeni provenienti da colture  di N.gonorrhoeae in fase S.   IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA ossidasi + e catalasi +; fermentazione degli zuccheri (sistema di riferimento API)   MALDI  ‐  TOF  tecnica  di  ionizzazione  soft  usata  in  spettrometria  di  massa  consente  di  misurare  in  maniera  estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare la loro identità  in base al rapporto massa/carica.    27    LINFOGRANULOMA VENEREO ‐> INFEZIONE DA CHLAMYDIA TRACHOMATIS  È la MST con maggior prevalenza nei paesi industrializzati. I sintomi iniziano 7‐21gg dopo l’esposizione e la trasmissione  avviene, esclusivamente, per via sessuale (ad esclusione di quei ceppi che danno tracoma e congiuntivite) e perinatale.   → Sono colpite di più le donne (nel senso che le manifestazioni cliniche nella donna sono molto più subdole e nascoste)  le manifestazioni in un’età che riflette i comportamenti sessuali, diminuendo drasticamente nelle donne dopo i 25  anni. Comunque, l’80% delle donne risulta asintomatico e, qualora dovessero esserci, i sintomi includono:   cerviciti   endometriti   salpingiti    bartoliniti   il 35% dei casi presenta uretrite non gonococcica con perdite mucopurulente, disuria e piuria.  → Gli uomini presentano, nel 75% dei casi, uretriti con secrezione filante, quasi trasparente e poco densa (≠ blenorragia  da neisseria in cui l’essudato è denso, cremoso e giallastro)  Altri fattori di rischio possono essere il basso livello socioeconomico e scolastico.  Elementi predittivi di infezione clamidiale sono:   giovane età ( < 21 anni)   partner con uretrite non gonococcica   nuovo partner nei due mesi precedenti   ectopia cervicale e/o essudato cervicale   sanguinamento durante il prelievo   contraccettivi non di barriera o nessuna contraccezione  alla colposcopia risultano:   portio congesta   essudato mucopurulento   ectopia  il Linfogranuloma venereo è causato dai sierotipi L1, L2, L3 di Chlamydia trachomatis. Si distinguono 3 fasi:   La prima fase inizia dopo un periodo di incubazione di circa 3gg con una piccola lesione cutanea presso il sito di  ingresso del batterio; questa può causare un’ulcerazione della cute sovrastante. La guarigione è così rapida da farla  passare inosservata.   Il secondo stadio,    nei maschi, inizia generalmente dopo circa 2/4 settimane con ingrandimento bilaterale dei linfonodi inguinali  che tendono a formare masse di grandi dimensioni, soffici e a volte fluttuanti (bubboni); questi aderiscono ai  tessuti profondi e causano infiammazione della cute sovrastante, a volte accompagnata da febbre e malessere.    nelle donne sono comuni il dolore alla schiena o alla pelvi; la lesione iniziale può presentarsi a livello locale o  presso  la porzione vaginale alta, esitando nell'aumento delle dimensioni e nell'infiammazione dei  linfonodi  pelvici e perirettali; possono svilupparsi fistole drenanti multiple da cui fuoriesce materiale purulento o sangue   nel terzo stadio, le lesioni guariscono esitando in cicatrici; tuttavia, le fistole possono persistere o ripresentarsi.  L'infiammazione persistente,  causata da  un'infezione non  trattata  che  ostruisce  vasi  linfatici,  causa  gonfiore  e  piaghe  della  pelle.  I  soggetti  che  hanno  rapporti  sessuali  passivi  anali  possono  avere  grave  proctite  o  grave  proctocolite con scariche rettali purulento‐sanguinolente.   Nelle fasi croniche, la colite simula la malattia di Chron: può causare tenesmo e stenosi del retto o dolore dovuto  ad  infiammazione dei  linfonodi di pelvici. La proctoscopia può  rilevare  infiammazione diffusa, polipi e masse o  essudato muco purulenti, segni che assomigliano alla malattia infiammatoria intestinale  DIAGNOSI    La diagnosi è posta, generalmente, attraverso la ricerca degli anticorpi nei confronti delle endotossine clamidiale  → titolo di fissazione del complemento > 1:64 o titolo della microimmunofluorescenza > 1:256   mediante genotipo usando un test di amplificazione degli acidi nucleici basato su PCR.   test immunologici diretti per gli antigeni (per esempio il test ELISA)    test di immunofluorescenza con anticorpi monoclonali,   ULCERA MOLLE  è una patologia abbastanza  rara nell’Europa centrale ma piuttosto diffusa nei Paesi  tropicali. A 2/6gg dall'infezione  compaiono, nel punto di contagio, ulcerazioni molli, dolorose e irregolari (≠ ulcera dura non dolente della Sifilide)  La  diagnosi  è  posta  tramite  ESAME  MICROSCOPICO  con  cui  si  accerta  la  presenza  dell'agente  eziologico  =  Haemophilus ducreyi → batterio Gram‐, (coccobacillo).                    30    MECCANISMO DI REPLICAZIONE  Caratteristica essenziale per il processo infettivo è la VARIABILITÀ GENOTIPICA E FENOTIPICA DELL’HIV; infatti,  per  l’elevata complessità del processo replicativo del virus, possono verificarsi diversi errori a  livello trascrizionale e  post‐trascrizionale, portando così ad un’ipervariabilità genotipica e fenotipica, che si esprime nei diversi pazienti con  differenze  tra  il  20% ed  il  40%.  Tuttavia,  è da  tener presente  che  anche  isolati  virali  dallo  stesso paziente  avranno  differenze importanti nelle diverse fasi della malattia, così come isolati virali prelevati contemporaneamente in diversi  distretti, avranno notevoli differenze genotipiche e fenotipiche (fenomeno della compartimentalizzazione)  Tali mutazioni determinano delle differenze dal punto di vista della:   Cinetica di replicazione, date da mutazioni dell’apparato trascrizionale.   Tropismo, date da mutazioni degli anti‐recettori virali, determinando particolari tropismi tessutospecifici.   Neutralizzazione anticorpale: più il virus muta, meno gli anticorpi sintetizzati lo riconoscono e neutralizzano.   Sensibilità  ai  farmaci:  essendo  estremamente  specifici,  anche  una  lieve  mutazione  determina  la  perdita  di  interazione tra farmaco e target.  MODALITÀ DI TRASMISSIONE    Comportamenti sessuali promiscui, senza l’uso di contraccettivi (preservativo)   Trasmissione a livello iatrogeno: per la sterilizzazione degli strumenti chirurgici e dentistici    Sacche di sangue ed emoderivati (ridotte al minimo perché testati)   Passaggio di siringe in tossicodipendenti   Mancata sterilizzazione degli aghi per tatuaggi o piercing   Trasmissione verticale, da madre a feto, nel momento del parto  CONCENTRAZIONE DELL’HIV IN DIVERSI LIQUIDI BIOLOGICI   Sangue = 100%   Liquido seminale = 75%   Secreto vaginale = 50%   Saliva, urine, sudore, lacrime = < 1%  la principale via di  ingresso dell’HIV è la penetrazione attraverso una superficie mucosa  1    MICROBIOLOGIA CLINICA  I METODI DELLA MICROBIOLOGIA CLINICA  LA DIAGNOSI BATTERIOLOGICA  La diagnosi batteriologica (come quella virologica o micotica o parassitaria) si prefigge di identificare l’agente patogeno  responsabile di una malattia infettiva, allo scopo di suggerire un appropriato trattamento terapeutico. Nella diagnosi  batteriologica, come nelle altre diagnosi microbiologiche, si hanno a disposizione due possibilità:   DIAGNOSI DIRETTA, volta a isolare l’agente patogeno o un suo prodotto. Le matrici biologiche usate sono:   sangue   feci   urina   biopsia   tamponi  il processamento del campione potrà avvenire attraverso   diagnosi rapida e, quindi, attraverso   → il metodo immunologico, che prevede la ricerca di antigeni dell’agente batterico, caratteristica di   test di agglutinazione,   ELISA   Saggio di immunocromatografia su membrana  → Il metodo molecolare che si identifica con la ricerca di sequenze genomiche dell’agente batterico   PCR   SDA   LCR   Ibridazione di una sonda verso l’agente batterico   Esame colturale che prevede la semina su brodo di arricchimento, terreno solido non selettivo e/o selettivo  e discriminativo. Questo porta all’isolamento del microrganismo in coltura pura che permette  → l’identificazione biochimica, immunologica o molecolare  → l’antibiogramma   DIAGNOSI  INDIRETTA,  atta  alla  rilevazione  della  risposta  immunitaria  dell’ospite.  Normalmente,  questa  si  configura con il movimento anticorpale, anche se non bisogna escludere altre forme responsive.  Il prelievo del  siero del paziente, in particolare, attraverso il metodo immunologico, avviene grazie a saggi   immunoenzimatici (EIA)   radioimmunologici (RIA)   di immunofluorescenza (IFA)    LA FASE PREANALITICA: IL PRELIEVO DEL CAMPIONE  innanzitutto, bisogna che il prelievo del campione biologico sia prelevato da    zone normalmente sterili e, quindi,   sangue e midollo   liquido cefalorachidiano   liquido articolare    liquido pleurico o pericardico   tessuti profondi   vie respiratorie inferiori   urine  (se  il  campione  viene  opportunamente raccolto)   zone con popolazione batterica o microbica residente.   vie respiratorie superiori   Cute   Tratto gastro‐intestinale   Tratto genitale femminile   Uretra  Popolazioni microbiche naturali  Molte differenti specie microbiche popolano contemporaneamente vari distretti del corpo (mucose: orale, intestinale,  cutanea) e, in modo analogo, risiedono nell’ambiente che ci circonda (aria, suolo, acqua).  Per studiare i diversi microorganismi che colonizzano un habitat, bisogna, in primis, isolarlo e coltivarlo in forma pura;  dove, per “COLTURA PURA” si intende una coltura costituita esclusivamente da batteri identici che, in teoria, derivano  da una medesima cellula (si potrebbe definire, tecnicamente, come clone).    ISOLAMENTO PER STRISCIO SU PIASTRA  Prevede l’inoculo di un liquido prelevato da brodocoltura, o di un solido costituito da un’ansa di cellule prelevate da uno  slant  (becco  di  clarino)  o  da  una  colonia.  Questo  viene  strisciato  usando  un’ansa  sulla  superficie  di  un  substrato  appropriato (generalmente è una piastra di coltura) dove le cellule vengono distribuite in modo da far crescere colonie  ben isolate, che probabilmente derivano tutte da una sola cellula.                2     METODO DEI QUATTRO ANGOLI   1. Far asciugare le piastre in stufa. La superficie deve essere priva di umidità per  consentire ai microrganismi di rimanere immobilizzati.  2. Con  un  pennarello  scrivere  sul  fondo  della  piastra,  ai  margini,  la  sigla  di  riconoscimento. Segnare, inoltre, il punto di inizio delle prime strisciate   3. Tenere  le  piastre  col  fondo  verso  l'alto  inserite  nel  coperchio  tranne  nel  momento di eseguire le operazioni di striscio.  4. Prendere un’ansa e prelevare un po’ di patina di cellule microbiche dal campione  voluto (se da piastra, badando a prendere solo le cellule e a non bucare l'agar).  5. Eseguire alcuni strisci paralleli sulla piastra pulita in corrispondenza di un quadrante   6. Cambiare ansa e passarla sugli strisci paralleli eseguiti nella parte di fondo, dove cioè le cellule sono di meno. Da  qui eseguire altri strisci paralleli in corrispondenza del secondo quadrante   7. Ripetere  il  passaggio  6  altre  due  volte  ruotando  ogni  volta  la  piastra  ed  eseguendo  la  serie  di  strisci  paralleli  partendo dalla porzione meno densa del nuovo quadrante strisciato   8. Chiudere la piastra con il coperchio, capovolgerla ed incubarla alla temperatura e per il tempo idonei per la crescita  dei microrganismi.   Questa metodica è usata nei Paesi anglosassoni; in Italia si suole usare il metodo dei tre quadranti: una volta che si fa  la  prima  strisciata,  l’occhiello  dell’ansa  ha,  volta  per  volta,  una  carica microbica  ridotta  tale  che  l’ultima  strisciata  presenterà le cosiddette ‘singole colonie’.  ISOLAMENTO PER DILUIZIONI SERIALI   L’inoculo, solido o liquido, viene diluito all’estinzione ( = fino a raggiungere la diluizione sterile, cioè senza alcuna cellula  batterica).  Di  solito  il  fattore  di  diluizione  è  costante  ogni  passo,  risultante  in  una  progressione  geometrica  della  concentrazione con un andamento logaritmico. L’assenza di cellule batteriche è dimostrabile dall’intorbidimento del  terreno liquido o dalla crescita di altri microorganismi. Dopo aver compiuto le diluizioni seriali, si andrà a piastrare  i  terreni al fine di contare le colonie. Per essere statisticamente valida, il numero di colonie deve variare tra 30 e 300  (anche se si consiglia di contare non più di 100 colonie, altrimenti la conta risulterà molto approssimativa e difficilmente  ripetibile) Il numero di colonie contato verrà moltiplicato per il fattore di diluizione: si potrà, così, contare quante colonie  vitali sono presenti in 1 ml della soluzione di partenza.  TERRENI DI COLTURA  CLASSIFICAZIONE QUALIFICATIVA   TERRENI ELETTIVI: sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o di cavallo, che  consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche. Sono anche detti terreni universali.   TERRENI  SELETTIVI:  sono  terreni  che  favoriscono  la  crescita  solo  di  particolari  specie  batteriche  grazie  alla  presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie (generalmente antibiotici)   TERRENI  DIFFERENZIALI:  sono  terreni  che,  grazie  alla  presenza  di  particolari  componenti,  permettono  di  distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata. I terreni  differenziali contengono spesso dei coloranti che, virano a seconda del metabolismo e, quindi, del pH.     Il terreno al mannitolo‐agar o sale‐mannite o, ancora, TERRENO DI CHAPMAN è   → selettivo perché contiene il 7,5% di NaCl, una concentrazione tale da inibire la crescita di batteri non alofili.   → differenziale perché contiene  il mannitolo:  la  fermentazione del mannitolo, che avviene solamente se è  presente S. aureus, viene palesata per il viraggio dell’indicatore di pH     TERRENI  DI  ARRICCHIMENTO: consentono di aumentare  la carica della specie batterica che si vuole  isolare,  grazie alla presenza di fattori che inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel campione in  esame e sostanze che favoriscono lo sviluppo delle specie esigenti. Tipico esempio di un terreno di arricchimento  è IL TERRENO AL SELENITO per le feci: il selenito inibisce la gran parte dei batteri presenti nelle feci, facendo  crescere Shigella e Salmonella.      TERRENO AL SANGUE CON FENOMENI DI Β‐EMOLISI: il terreno è inizialmente di colore rosso, in quanto  sono presenti emazie; dove è avvenuta la β‐emolisi o emolisi completa il terreno si presenta completamente  modificato di colore e, talvolta, se l’emolisi è molto spinta, sarà addirittura trasparente, a causa della lisi totale  delle emazie. In particolare, questo tipo di terreno consente di differenziare gli streptococchi in base al loro  potere emolitico (gli streptococchi β‐emolitici restituiscono una colonia circondata da una zona di trasparenza  (a differenza di quelli α‐emolitici che sono circondati da un alone di colore verde).    INGREDIENTI DEI TERRENI DI COLTURA  In passato, i terreni di coltura venivano preparati con sostanze naturali, poco standardizzate, come i brodi di carne, il  latte  o  il  sangue.  Oggi,  i  substrati  vengono  formulati  a  partire  da  ingredienti  altamente  standardizzati,  semplici  o  complessi o che possono essere acquistati in forma disidratata, con ingredienti già premiscelati.  5    ESEMPI DI METODI GENOTIPICI PER IL FINGERPRINTING E L’IDENTIFICAZIONE DEI CEPPI:   Randomly Amplified Polymorphic DNA – PCR (RAPD‐PCR):  il DNA totale di un ceppo, estratto e purificato con  metodi rapidi (bollitura, resine, etc.), viene amplificato con un solo primer arbitrario: dopo la separazione su gel di  agarosio si produce un pattern poco complesso, specifico per ceppo.   Amplified  Ribosomal  DNA  Restriction  Analysis  (ARDRA‐PCR):  il  DNA  ribosomiale  (rDNA  16S  o  23S)  viene  amplificato con una coppia di primer altamente conservati e tagliato con uno o più enzimi di restrizione. Il pattern  ottenuto dopo separazione elettroforetica è, in genere, specie‐specifico   INDAGINI SIEROLOGICHE  Le indagini sierologiche servono per:   identificazione e quantificazione di antigeni batterici   valutazione della risposta anticorpale dell’ospite ad agenti infettivi (scopo principale)  LA  RILEVAZIONE  DI  MACROMOLECOLE  MICROBICHE  =  rilevazione  della  presenza  di  strutture  antigeniche  specifiche dei batteri, messe in evidenza mediante impiego di anticorpi. Tecniche utilizzate:   reazione di agglutinazione ‐> reazione immunologica in cui un siero contenente anticorpi voi viene cimentato  con un antigene: si ha, quindi, la formazione di un immunocomplesso visibile come un ammasso voluminoso  → agglutinazione  su  vetrino:  prevede  l’impiego  di  anticorpi,  ottenuti  in  un  animale  immunizzato  (spesso  il  coniglio), messi a contatto con il batterio o con suoi antigeni solubili  → agglutinazione  al  lattice  (AL,  maggiormente  utilizzata):  impiega  dei  reattivi  per  evidenziare  gli  antigeni  polisaccaridici, spesso della capsula batterica, costituiti da sequenze ripetitive di zuccheri in grado di legare  gli anticorpi in più punti. Per il test si utilizzano anticorpi legati a particelle di lattice   reazione di immunofluorescenza  → immunofluorescenza  diretta:  si  utilizza  un  anticorpo  coniugato  con  fluoresceina  isotiocianato,  che  sia  specifico per l’antigene in esame.  → immunofluorescenza indiretta: si utilizza un anticorpo specifico per l’antigene in esame ma non coniugato,  che  viene  riconosciuto  da  un  secondo  anticorpo  coniugato  e  diretto  contro  regioni  costanti  delle  immunoglobuline della specie in cui è stato prodotto il primo anticorpo (specifico per il treponema pallidum)   tecniche immunoenzimatiche (ELISA) ‐> si basa sull’utilizzo di anticorpi marcati con un enzima (generalmente  la perossidasi), in modo che i coniugati risultanti abbiano una attività sia immunologica che enzimatica. Avendo  uno dei componenti (antigene o anticorpo) adeso alla piastra, la reazione antigene‐anticorpo è immobilizzata e,  pertanto, potrà facilmente essere evidenziata con l’addizione del substrato che, reagendo con l’enzima, produrrà  una colorazione osservabile a vista e quantificabile con lo spettrofotometro.   western  blot  ‐>  Utile  nei  casi  in  cui  si  vogliano  cercare  antigeni  di  diverso  peso  molecolare:  le  molecole  antigeniche di un microrganismo patogeno vengono separate su gel di poliacrilammide in base al peso molecolare  e alle caratteristiche (mediante elettroforesi); trasferite su membrana di nitrocellulosa (questo trasferimento si  chiama blot o blottage) e incubate con il siero del pz. Viene aggiunto un anticorpo anti‐immunoglobuline umane  marcato  con  un  enzima  (perossidasi):  la  presenza  di  anticorpi  marcati  viene  evidenziata  dall’aggiunta  di  un  substrato cromogeno specifico sul quale agisce l’enzima, sonde molecolari   Limulus test (rilevazione dell’LPS batterico)   SDS‐PAGE delle proteine cellulari  1. la biomassa cellulare viene raccolta, lavata e lisata (con mezzi chimici o fisici)  2. i residui vengono allontanati e l’estratto proteico viene standardizzato e caricato sul gel di poliacrilammide  3. le proteine vengono separate per elettroforesi  4. il gel viene colorato  5. l’immagine viene analizzata visualmente o utilizzando hardware e software appropriati    RILEVAZIONE DI ANTICORPI (test diagnostici indiretti) –> test diagnostico in cui non si va a misurare direttamente il  patogeno o il suo prodotto ma la reazione immunitaria dell’organismo nei confronti di quel patogeno.    reazione di fissazione del complemento ‐> utilizzata per documentare la presenza di anticorpi nel siero.   Siero del paziente viene privato del complemento e,  inattivato, viene cimentato con  l’antigene,  in presenza di  complemento fresco di cavia. Se nel siero del paziente sono presenti anticorpi specifici questi si legano all’antigene  ed  il  complemento, a  sua volta,  si  lega all’immunocomplesso:  se  il  siero del paziente è positivo  (cioè contiene  anticorpi contro l’antigene) i globuli rossi di montone rimangono integri; se il siero del paziente è negativo i globuli  rossi di montone vengono lisati. La reazione si evidenzia con liberazione di emoglobina.   ELISA indiretto ‐> si ricerca la presenza di anticorpi (che vengono fissati ed evidenziati da un anticorpo anti – Ig  umane  legato  covalentemente  a  un  enzima  come  la  perossidasi).  La  quantificazione  avviene  con  tecniche  spettrofotometriche,  attraverso  la  valutazione  dell’intensità  del  colore  prodotto  in  risposta  alla  conversione  enzimatica del relativo substrato cromogeno; mentre la reale concentrazione dell’anticorpo viene determinata per  confronto con diluizioni standard dell’anticorpo stesso.    6    INFEZIONI VIE URINARIE  BATTERI SAPROFITI presenti nel terzo inferiore dell’uretra    Uomo  Donna  Staphylococcus auereus  Neisseriae (non patogene) Neisseriae (specie non patogene)  Acinetobacter Acinetobacter  Lactobacilli. Mycobacterium smegmatis. PATOGENESI  La penetrazione di un germe nelle vie urinarie non implica necessariamente un’infezione: tutto dipende, dal numero e  dalla ricorrenza dei microrganismi e dall’efficacia delle difese immunitarie dell’ospite;  Le vie di penetrazione possono essere:   ematogena o discendente;   ascendente, ovvero i germi colonizzano il perineo e risalgono il tratto urinario per via retrograda verso l’uretra  raggiungendo così la vescica  L’adesione alle cellule ospiti avviene ad opera di adesine (soprattutto fimbrie) che si distinguono in:   pili di tipo 1 (mannosio‐sensibili), comuni a quasi tutti i ceppi. Le fimbrie si legano al mannosio presente nelle urine  e non alla superficie della mucosa dell'ospite, non avviene, così, l’infezione   pili di tipo 2 (mannosio‐resistenti)    Fimbrie P, (mannosio – resistenti) importanti fattori di virulenza che favoriscono l’azione dei ceppi uropatogeni  detti UPEC, sia al di fuori che all’interno del loro habitat;   adesine afimbriali (AFA‐1, AFA‐III).  La  colonizzazione  vescicale  evolve  in  infezione  del  tratto  urinario  (UTI)  quando  l’uropatogeno  aderisce  all’epitelio  vescicale provocando una risposta infiammatoria, con conseguente rilascio di citochine (soprattutto IL‐6 e IL‐8) e di altri  mediatori  dell’infiammazione.  Nel  giro  di  un  paio  di  giorni  si  ha  la  comparsa  della  sintomatologia  e  l’inizio  della  migrazione linfocitaria nel sito dell’infiammazione.  chemochina con un’attività diretta di chemo‐attrazione: richiama rapidamente i polimorfonucleati  dai vasi e dall’interstizio che liberano citochine e altri fattori = l’infiammazione delle vie urinarie.    I leucociti migrano attraverso lo strato delle cellule epiteliali. I linfociti B iniziano a produrre le IgA  secretorie nelle urine dopo il legame con i batteri e svolgono il ruolo di tamponare le infezioni     Fattori che giocano un ruolo importante nell’esordio delle infezioni, soprattutto all’interno delle vie urinarie:  • Virulenza del ceppo infettante (il ceppo deve essere intrinsecamente virulento);  • Dose infettante, il numero delle cellule batteriche che hanno un ruolo nell’infezione;  • Suscettibilità dell’ospite  LE TAPPE DEL PROCESSO INFETTIVO   PENETRAZIONE cui si contrappongono   difese idrocinetiche o idrodinamiche basate su fattori meccanici e fisici: il flusso dell'urina fa sì che i batteri che  non sono saldamente ancorati alla mucosa vengono portati via.   caratteristiche chimiche dell’urina   ADESIONE, inibita da   difese antibatteriche aspecifiche, molecole che rappresentano una difesa immediata e aspecifica contro i batteri  che cercano di invadere il nostro corpo come antibiotici endogeni o glicosamminoglicani   difese immunologiche locali (IgA secretorie)  INFEZIONE.    esordio del processo infettivo altamente dinamico nel quale i leucociti, ad attività fagocitaria, svolgono un ruolo  importante  sia nell’uccidere  i batteri  che cercano di penetrare,  sia nel  rilascio di mediatori dell’infiammazione  (citochine,  chemochine)  che  sono  alla  base  dei  meccanismi  cellulo‐umorali  dell’insorgenza  e  mantenimento  dell’infezione.  FATTORI FAVORENTI L’INSORGENZA DELLE INFEZIONI DELLE VIE URINARIE   FATTORI ANATOMICI, come    lunghezza dell’uretra, che nella donna è di 3 cm mentre nell’uomo è estremamente più lunga (12‐13 cm circa);    uropatie  ostruttive,  vi  sono meccanismi  patologici  come  calcoli  o  masse  che  premono  sulle  vie  urinarie  che  possono ostruire il deflusso di urina;    anomalie congenite del rene;    lesioni renali acquisite, sia di carattere infiammatorie che di altro tipo.  7    FATTORI FISICI, come    incompleto svuotamento durante la minzione della vescica. Un caso classico è un individuo di sesso maschile con  adenoma prostatico che determina un progressivo aumento del bassofondo vescicale; questo rappresenta la parte  declive  della  vescica  nella  quale  rimane  urina  anche  dopo  la  minzione:  il  mancato  svuotamento  deriva  dall’occlusione portata dalla compressione tumorale;    aumentata pressione intravescicale;   cateterismo vescicale o altre manovre strumentali invasive.  FATTORI CHIMICO‐UMORALI, come    ridotto  volume  urinario,  fattore  importantissimo  sia  per  la  prevenzione  delle  infezioni  sia  per  coadiuvare  la  terapia. Per incrementare il volume urinario, si consiglia di bere almeno 1.5 L di acqua al giorno;    alcalinità delle urine: quando si alza  la fisiologica acidità delle urine si ha una maggiore possibilità di contrarre  infezioni   ridotto potere battericida della parete vescicale;    malattie metaboliche sistemiche, come il Diabete mellito, la Gotta o Ipokaliemia;  ALTRI FATTORI:    ritenzione urinaria abitudinaria;    stipsi;    vulvo‐vaginiti e balaniti.  BATTERI NELLE URINOCOLTURE DI PAZIENTI CON IVU   S. aureus;   S, epidermidis, commensale del tratto cutaneo vicino all’orifizio uretrale;   Serratia Marcescens(enterobatterio);   Proteus(enterobatterio);   Pseudomonas Aeruginosa(opportunista);   Enterococcus aerogenes, è un cocco Gram+ opportunista;   Klebsiella;   Proteus mirabilis;   Enterococchi, batteri di provenienza intestinale come anche Proteus e Klebsiella;   E.coli, il più frequente nelle infezioni delle vie urinarie.  LA DIAGNOSI DELLE INFEZIONI URINARIE   CLINICA,  sintomi ascrivibili all’interessamento delle basse vie urinarie:   pollachiuria, associata a oliguria,    urgenza minzionale talora con incontinenza diurna    dolore addominale durante la minzione = stranguria (sintomo più raro che indica una forma più grave);   urine maleodoranti e/o torbide;   bruciore alla minzione;  La febbre si correla ad infezione del parenchima renale, quando l’infezione è grave o molto estesa.  ESAME DELLE URINE,   valore negativo di leucociti < 10/mL; valore positivo leucociti > 100/mL   Tracce di nitriti (risultato del metabolismo batterico),   Tracce di globuli rossi oppure significativa presenza di emoglobina;   Proteinuria importante;   Cilindri, sono sempre un dato patologico.  URINOCOLTURA,   Raccolta  Coltura quantitativa (CFU/ml) Specifiche  CATETERISMO  VESCICALE   Nel bambino febbrile ≥ 5x105/ml avviene quasi sempre in ambiente ospedaliero ASPIRAZIONE  SOVRAPUBICA  essendo  l’urina  teoricamente  e  fisiologicamente  sterile,  qualunque  crescita  di  patogeni  urinari  è  un  segno di infezione;  Il metodo più invasivo che si  impone in pochissimi casi,  quando si sospetta che l'agente eziologico sia un batterio  aerobio: le urine vengono a contatto con l'O2 ed eventuali  batteri anaerobi muoiono.  MITTO  INTERMEDIO  Nel bambino sintomatico ≥ 5x105/ml Nel  bambino  asintomatico  ≥  5x105/ml in almeno 2 campioni  Materiale raccolto per la diagnosi microbiologia. La prima  parte viene  tolta e  la  successiva viene  trattenuta  in un  contenitore sterile con tappo a tenuta  SACCHETTO  STERILE  Nel bambino sintomatico ≥ 5x105/ml Nel  bambino  asintomatico  ≥  5x105/ml in almeno 2 campioni  Usato quando un bambino è molto piccolo e deve essere  cambiato ogni  20‐30 min  ! 10    Più raramente le faringo‐tonsilliti possono essere causate da    STREPTOCOCCHI BETA‐EMOLITICI DI GRUPPO C o G: S. dysgalactie, S. consellatus.    alcuni CORYNEBATTERI:    C. hemoliticum,    C. diphteriae (Si manifesta nei soggetti non vaccinati contro la difterite)   Bacillo Gram+;   Pleiomorfo;   Asporigeno;   Immobile;   Tipica distribuzione dei batteri a “lettere cinesi”.   La  patogenicità  del  batterio  è  dovuta  alla  produzione  della  tossina  difterica  che  ha  un  particolare  trofismo per le fibre muscolari striate e cardiache.    La  caratteristica,  quasi  patognomonica,  della  faringite  da  C.  diphteriae  è  la  presenza  di  pseudomembrane grigiastre fortemente aderenti alla mucosa della faringe.   L’isolamento colturale può avvenire in:   terreno di Loffler = siero di vitello coagulato, nel quale i bacilli difterici crescono molto rapidamente   terreno di Hoyle = agar sangue arricchito con tellurio di potassio, scaldato a 60°C ‐> Corinebateri  metabolizzano  il  tellurito  di  potassio  riducendolo  a  metallo  (tellurio),  la  cui  precipitazione  conferisce una colorazione grigia‐nerastra alle colonie.  Le colonie possono avere 3 diversi aspetti:  → gravis: colonie grandi, piatte, grigio‐nerastre;  → mitis: colonie più piccole, lucide e cupoliformi;  → intermedius: colonie molto piccole, più o meno lucide.   NEISSERIA GONNOREAE (in pazienti con infezioni genitali),    STREPTOCOCCHI BETA EMOLITICI DI GRUPPO B (S. agalactiae nei neonati),    LIEVITI (candidosi esofagea, ma anche orale e faringea in immunocompromessi),    TEST MICROBIOLOGICI NELLE INFEZIONI DELLE ALTE VIE RESPIRATORIE  TAMPONE FARINGEO‐TONSILLARE →  faringo‐tonsillite, difterite, angina di vincent, pertosse e infezioni virali   MODALITÀ DI PRELIEVO:  1. Utilizzando un abbassalingua, comprimere delicatamente la lingua sul pavimento della bocca;  2. Inserire il tampone tra le tonsille, al disotto dell’ugola, evitando di toccare la mucosa delle guance, (soprattutto) la  lingua, l’ugola e le labbra poiché fortemente colonizzate dalla flora commensale;  3. Strofinare e ruotare vigorosamente il tampone sul retro‐faringe;  4. Utilizzare tamponi  in dacron, evitando il cotone (tossico per alcune specie microbiche) o l’alginato di calcio (un  inibitore della PCR);  Non eseguire mai il tampone faringeo se vi è un sospetto di epiglottidite acuta perché può indurre una grave ostruzione  delle vie aeree superiori. La diagnosi di tale malattia è su base esclusivamente clinica.    L’ISOLAMENTO COLTURALE è il gold standard, tuttavia è possibile porre diagnosi rapida mediante ricerca antigenica  nel campione (es. agglutinazione al lattice nel campione). Si procede, dunque con:   semina   inoculazione per strisciamento su piastre al sangue (generalmente sangue di montone) non selettive oppure  selettive (come il Columbia CNA agar, contenente colistina ed acido nalidixico, che inibisce i GRAM ‐);   incubazione in atmosfera al 5‐10% di CO2 oppure in anaerobiosi ad una temperatura di 37 °C per 16‐24 h; al  fine  di mettere  in  evidenza  eventuali  agenti  patogeni  francamente  anaerobi.  Lo  Streptococco  è  aerobio‐ anaerobio facoltativo e ciò vuol dire che cresce sia in aerobiosi che in anaerobiosi.   Al termine dell’incubazione si recuperano le piastre e si osservano ad occhio nudo.   aspetto colonie    Piccole colonie (dal diametro di 0.5 mm), cupoliformi, con margine continuo, secche (o raramente mucose).   La β‐emolisi è più evidente in condizioni anaerobie perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno.  Questo fatto vero in modo assoluto per lo Streptococco Pneumonie (per il quale quindi si richiede una doppia  incubazione), mentre non è vera per S.Pyogenes, dove l’emolisi Beta si evidenzia anche in ambiente aerobio.   aspetto microscopico   Colorazione Gram: cocchi Gram+, disposti in corte o lunghe catenelle, talvolta (raramente) a grappolo.   test biochimici   Catalasi ‐ se è Streptococcus Pyogenes (a differenza degli stafilococchi che, invece, sono catalasi +);   La sensibilità alla bacitracina a bassa concentrazione è stata utilizzata fino ad alcuni anni fa come metodo di  screening, ma i risultati talvolta non sono attendibili.    Positività alla prova della PYR, (anche alcuni ceppi dei gruppi C e G possano essere positivi);   Sensibilità alla bile.  11    ESAME MICROSCOPICO PER L’ANGINA DI VINCENT   il  tampone  faringeo  viene  strisciato  su  vetrino  portaoggetti,  colorato  con  colorazione  di  Gram  (o  Ziehl‐Nielsen)  ed  esaminato a massimo ingrandimento (1000 x).  → l’esame negativo = presenza di morfotipi propri della flora commensale (es. cocchi, bastoncelli, miceti);  → l’esame  positivo  =  presenza  di  fusobatteri  che  si  presentano  di  forma  allungata  e  con  le  estremità  appuntite  (Fusobacterium spp.) o spirilli Gram‐ (Borrelia spp.), normalmente assenti nella flora orofaringea.    INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE    Bronchite;   Polmonite;   Ascessi polmonari;   Empiema pleurico.  I PIÙ COMUNI PATOGENI implicati nelle infezioni delle basse vie respiratorie:  BRONCHITI ACUTE   Virus respiratori (nel 90% dei casi)   Bordetella pertussis      Mycoplasma pnemoniae   Chlamydia pneumoniae   POLMONITE DI  COMUNITÀ   Streptococcus pneumoniae   (agente eziologico della polmonite lobare franca)  Mycoplasma pneumoniae   (= polmonite atipica di Eaton),    bacilli Gram‐ enterici (quindi Enterobacteriaceae),  virus influenzali, Hantavirus, Coronavirus…   raramente  Mycobacterium  tuberculosis  e  supercalifragilistichespiralidosoi    Haemophilus influenzae,    Legionella spp.   Klebsiella spp.,    Staphylococcus aureus   Chlamydia spp.     Moraxella catharralis    POLMONITE  NOSOCOMIALE   Pseudomonas aeruginosa,   Enterobacter spp.,    Klebsiella pneumoniae,    Acinetobacter spp.,    Legionella spp.,      Haemophilus influenzae   Staphylococcus aureus    Streptococcus pneumoniae    POLMONITE ACUTA   Nei bambini si hanno, soprattutto  virus respiratorio sinciziale,    i virus parainfluenzali I, II, III;    più rari sono i virus influenzali A e B.     Tra gli adulti è molto frequente   il virus influenzale A o B,    il virus respiratorio sinciziale   Gli  adenovirus  (soprattutto  nelle reclute militari)  POLMONITE   =  infezione  del  parenchima polmonare  distale  ai  bronchioli  terminali,  associata  ad  evidenza  clinica  e  radiologica di  addensamento di aree polmonari  POLMONITE ACUTA  Ha un’insorgenza rapida ed è caratterizzata da    malessere,    febbre elevata ingravescente oppure improvvisa con brividi scuotenti (nella polmonite pneumococcica).    Il  sintomo  principale  è  rappresentato  dalla  tosse.  Negli  adulti  la  tosse  diviene  produttiva  con  la  formazione  dell’escreato costituito da materiale purulento più o meno ricco di polimorfonucleati negli alveoli e nei bronchioli.   Segni di alterazione degli scambi gassosi alveolari dovuti alla presenza dell’essudato: aumento della frequenza  respiratoria, dispnea e, nei casi più gravi, cianosi.    Vi sono diversi tipi di polmonite:    POLMONITE LOBARE: denota un processo alveolare che coinvolge un intero lobo;   POLMONITE LOBULARE: denota un processo che coinvolge una porzione di un lobo (lobulo);   BRONCOPOLMONITE: denota un processo alveolare diffuso in zone diverse, contigue ad un bronco;   POLMONITE  INTERSTIZIALE  O  POLMONITE  ATIPICA:  infezione  sparsa  dell’interstizio  (quindi  vicina  all’ilo  polmonare) che coinvolge zone ricche di fibre elastiche e di fibre collagene.  È sostenuta da microrganismi diversi tra cui:   Mycoplasma pneumoniae (agente eziologico della polmonite atipica primaria di Eaton);  → ha uno spiccato tropismo per le cellule ciliate che attacca e distrugge.  → È il più comune agente di infezioni polmonari nella fascia di età tra i 5 e i 35 anni  → responsabile di epidemie (es.scuole) che si diffondono lentamente, (periodo di incubazione di 10–14 gg)   alcuni  virus  (come  RSV,  Adenovirus).  Nel  2003  è  stata  registrata  un’epidemia  di  polmonite  atipica  da  Coronavirus (SARS‐CoV); nel 2019 quella da SARS‐CoV‐2   Fra i miceti, Cryptococcus neoformans, Aspergillus e Candida spp. possono essere responsabili di polmonite  atipica in pazienti fortemente immunodepressi.  comune  soprattutto  negli  immunodepressi  e  nei soggetti affetti da fibrosi cistica.  12      DIAGNOSI DIFFERENZIALE FRA POLMONITE TIPICA E ATIPICA      TIPICA ATIPICA  ESORDIO  rapido con febbre alta e brividi più subdolo (5 ‐ 7 giorni)  RADIOLOGIA  addensamento intra alveolare addensamento  interstiziale,  diffuso,  ma  con  particolare riferimento alla zona peri‐ ilare.  ESAME  OBIETTIVO  vi è sempre il consolidamento la presenza del consolidamento dipende dalla  diffusione dell’infezione  ESCREATO  purulento e rugginoso (per la rottura di piccoli  capillari  per  l’avanzamento  rapido,  repentino,  del processo infettivo)  mucoide ETÀ  Ogni età  Tipica negli adolescenti   DOLORE  PLEURICO  ‘a pugnalata’ (pleurite consensuale) Raro  CONTA  LEUCOCITARIA  aumentata, 12000 o molto più alti e sono quasi  tutti neutrofili  normali o soltanto leggermente aumentati     POLMONITE BATTERICA  STREPTOCOCCUS  PNEUMONIAE è  l’agente eziologico più  isolato nella “polmonite di comunità” (responsabile del  90% di tutti i casi di polmonite). Il batterio arriva al polmone per via inalatoria, colonizza i piccoli bronchi, si replica e dà  origine al processo infiammatorio a livello degli spazi alveolari, in cui si accumula un fluido ricco di proteine. Può, poi,  diffondere agli alveoli vicini dando luogo alla polmonite lobare.   Si possono avere, spesso, batteriemie e infezioni extrapolmonari come artrite settica, endocardite, meningite e sepsi.      POLMONITE ACQUISITA IN OSPEDALE  Insorge in un tempo compreso o superiore le 48h dal ricovero e si configura essere come la seconda causa più frequente  delle infezioni nocosomiali: si registrano dai 5 ai 10 casi ogni 1000 ricoveri; l’incidenza risulta molto più elevata se il pz  è sottoposto a ventilazione meccanica. È la prima infezione nocosomiale se si considera la mortalità (che è del 70% circa)  e morbilità. La degenza, per questi pz, aumenta di 7‐9 giorni.    IL RUOLO DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA NELLE INFEZIONI DELLE BASSE VIE RESPIRATORIE  L’obiettivo è quello di rilevare l’agente eziologico per permettere la terapia appropriata, mirata o personalizzata.  I test disponibili sono:   L’osservazione  microscopica  di  un  vetrino,  quindi  l’osservazione  dell’escreato  con  opportune  colorazioni  per  mettere in evidenza batteri e funghi;   L’esame sierologico nel caso di alcuni virus o di batteri come M.pneumoniae e C.pneumoniae;   La ricerca dell’antigene, soprattutto nel caso di batteri come L.pneumophila e S.pneumoniae e di virus come il  virus respiratorio sinciziale   La PCR, sempre più frequente oggigiorno, che, attraverso l’utilizzo di cartucce forniscono un risultato nel giro di  poco più di un’ora. È utilizzata per diagnosi dei virus respiratori e dei batteri fastidiosi (che possono crescere con  difficoltà o non crescere proprio nei terreni di coltura);   La coltivazione virale, la quale è però una tecnica molto complicata e ha bisogno di personale molto esperto (tanto  che attualmente non viene utilizzata quasi mai).   Dagli  anni  2000  è  diffusa  l’applicazione  della Multiplex  RT‐PCR,  che  è  provvisto  di  cartucce  che  possiedono  all’interno tutti i reattivi per fare la diagnosi su un unico campione di 10‐20, agenti eziologici diversi di natura sia  virale sia batterica: dopo un tempo di circa 50min, viene fuori il risultato basato sull’amplificazione di un gene o di  una porzione di esso che è caratteristico e conservato per quell’agente virale o batterico.   Biomarker pur non essendo specifici come le PCR, sono molto utili soprattutto in presenza di una negatività dei  test specifici. Si può avere:   hsCRP (proteina C reattiva ad alta sensibilità);   PCT (procalcitonina), importante in tutte le forme di sepsi e nelle forme di polmonite.  Fattore  importantissimo è  IL  TEMPO: nelle polmoniti e,  in generale, nelle  infezioni respiratorie, un ritardo di più di  quattro ore  (dopo  il  ricovero ospedaliero) nel  trattamento antibiotico è associato ad un significativo aumento della  mortalità: è, quindi, necessaria una diagnosi rapida di polmonite ed un’accurata diagnosi differenziale dalle malattie  respiratorie virali e dalle cause non infettive, necessaria al fine di stabilire la terapia più appropriata.        15      DIAGNOSI DI LABORATORIO  vengono prelevati i campioni respiratori: tamponi nasofaringei e orofaringei e, con questi, si può procedere alla   rilevazione del genoma virale (RNA) dei campioni mediante test molecolare (RT‐PCR; qRT‐PCR)  → i geni S, E, M, N vengono sfruttati per allestire i test molecolari:  1° Test screening: gene E  2° Test confermatorio: gene RdRp o N.   isolamento virale in coltura di cellule   test sierologici (rapidi: qualitativi gocce di sangue o semiquantitativi da sangue venoso) tenendo conto che:  → le IgM, prodotte nella fase iniziale dell’infezione, forniscono una protezione a breve termine (5/6 settimane)  → le IgG prodotte durante la prima infezioni sono, generalmente, responsabili della protezione a lungo termine  (nel caso di questa infezione durano, però, 4/5 mesi)  → si è visto come le IgA (immunoglobuline secretorie) si presentavano prima delle altre nelle mucose di naso e  bocca, come prima difesa dell’agente patogeno   test di sieroconversione, ossia il passaggio da una forma di negatività a una forma di positività              16    MICROBIOLOGIA DELL’APPARATO CARDIOVASCOLARE  Il sistema cardiovascolare appartiene al gruppo di distretti anatomici che sono normalmente sterili, quindi le infezioni  intravascolari (le batteriemie, sepsi e shock settico) e le infezioni del cuore (pericarditi, miocarditi ed endocarditi) sono  dovute a batteri che provengono dall’esterno.  LE BATTERIEMIE    TRANSITORIE (a volte intermittenti) si manifestano in seguito ad eventi particolari (per esempio, estrazione di  denti o tecniche invasive di tipo diagnostico‐terapeutico). Sono così definite perché le difese immunitarie sono in  grado di eliminare l’agente responsabile, per cui la batteriemia si esaurisce in un tempo limitato.    PERSISTENTI: oltre a manifestarsi clinicamente con ipertermia associata a brividi, possono preludere la comparsa  della SEPSI.               L’evoluzione della sepsi può essere:    Rapida: si passa rapidamente dalla sepsi acuta allo shock settico;    Lenta:  progressione  lenta  con  esito  in  endocardite  infettiva  caratterizzata da micro‐emboli ed ischemie.    La  sepsi  si  definisce  come  un’infezione  che  deve  presentare  almeno  due  criteri  della  SIRS  (sindrome  da  risposta  infiammatoria sistemica). Sono state individuate diverse forme di sepsi:   SEPSI SEVERA: sepsi con una o più disfunzioni di organo/sistema dovuta a ipoperfusione o ipotensione   cardiovascolare (ipotensione o shock)   respiratoria (ipossiemia)   renale (anuria o oliguria)   SHOCK SETTICO: sepsi grave con ipotensione resistente alla “fluid resuscitation” (tecnica rianimativa che consiste  nel tentativo di ripristino della perfusione dei tessuti vitali mediante somministrazione di fluidi per via intravenosa)  e che richiede intervento farmacologico (agenti vasopressori o inotropici, generalmente sostanze simpatiche come  le catecolammine o ammine biogene con effetto vasocostrittore). ‐> la pressione arteriosa è inferiore a 70mmHg   MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome) – ipotensione e ipoperfusione che risultano in disfunzione a livello  di diversi organi e sistemi.   MOFS – Multiple Organ Failure Sydrome   CID – Coagulazione Intravascolare Disseminata  3 alternative della fase finale, spesso mortale e letale, dello shock settico; sovrapponibili temporalmente     In tutti i casi è presente, dunque, una coesistenza di evidenza di infezione e almeno altri due criteri della SIRS tra:  → temperatura elevata (sopra i 38°C) o ridotta (sotto i 35°C)  → frequenza respiratoria elevata a riposo (più di 20 atti respiratori al minuto),   → variazione delle cellule bianche (> 12000mm2 o < 4000mm2),   → presenza di forme immature delle cellule bianche   → aumento della frequenza cardiaca a riposo (più di 90 battiti al minuto).     sindrome da risposta infiammatoria sistemica, caratterizzata dalla produzione  di citochine come TNF‐α, IL6, IL8 e IL12     I PIÙ COMUNI AGENTI EZIOLOGICI DI SEPSI BATTERICA  BATTERI GRAM –    enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella, P. aeruginosa).    Acinetobacter, (che, insieme a Klebsiella, ultimamente, è responsabile di numerose infezioni ospedaliere, spesso  con elevata resistenza agli antibiotici.   Meno frequentemente si possono riscontrare infezioni da salmonella, haemophilus e nesserie  → Sedi di origine: polmone (sede principale), cavità addominale, torrente ematico, tratto urinario  BATTERI GRAM +   Stafilococchi: S.aureus e stafilococchi coagulasi‐negativi (CoNS)   Streptococchi: S.pyogenes, S. viridans e, soprattutto, lo S.pneumoniae  → Le sedi di origine possono essere cute, tessuti molli, cateteri, apparato respiratorio.          dal greco σήψις, “putrefazione” = è una sindrome clinica costituita da un insieme di  specifiche  alterazioni  emodinamiche,  respiratorie, metaboliche  e  immunologiche,  scatenata  da  un  processo  infettivo  ma  che  ha  come  substrato  patogenetico  un’abnorme risposta infiammatoria sistemica da parte dell’ospite.   17    L’INFEZIONE PUÒ AVERE ORIGINE DA DIVERSI FOCOLAI SEPSIGENI:   CAVO ORALE: per stafilococchi e streptococchi che abbondano nel cavo orale, molto raramente batteri anaerobi   APPARATO DIGERENTE per enterobatteri e batteri anerobi.   VIE URINARIE: sono un focolaio per quanto riguarda gli enterobatteri, gli E. Coli, la klebsiella e altre specie.   APPARATO  GENITALE  FEMMINILE:  raramente  diventa  focolaio  sepsigeno,  (≠  tempo  fa,  soprattutto  dopo  il  parto o più frequentemente in caso d’aborto). Gli agenti eziologici sono gli enterobatteri ed i batteri anerobi.   ALTE  VIE  RESPIRATORIE:  soprattutto  in  corso  di  ventilazione  assistita,  gli  agenti  eziologici  incriminati  sono  pseudomonas e, meno frequentemente, legionella.   LA CASCATA INFIAMMATORIA                                      Azione diretta                                       Azione indiretta      tramite  fattori  secondari  come:  l’ossido  nitrico  e  il  radicale libero dell’ossigeno e dell’azoto, gli eicosanoidi  (trombossani,  leucotrieni,  prostaglandine),  il  PAF  e  numerosi  fattori  che  derivano  dal  sistema  del  complemento o dal sistema di coagulazione del sangue                                           Durante la cascata patogenetica nella sepsi, vengono anche rilasciate delle citochine ed altri mediatori ad effetto anti‐ infiammatorio  come  IL‐10,  l’IGF‐β,  l’IL‐1  receptor antagonist,  l’sCD25 e  l’IL‐35; di questi, alcuni  (come  IL‐10) hanno  attività  T‐reg  cioè  inibiscono  i  meccanismi  innescati  dai  linfociti  T,  altri,  come  l’IL‐35,  sono  ad  attività  B‐reg,  cioè  inibiscono la cascata patogenetica innescata e gestita dai linfociti B. Inizialmente riescono a bilanciare l’eccessiva attività  infiammatoria  dei  mediatori  precoci  ma,  dopo  alcuni  giorni,  contribuiscono  all’immunodepressione  che  contraddistingue le fasi più avanzate delle sepsi (dopo il settimo, ottavo o nono giorno).  lisi cellula batterica (GRAM ‐) rilascio LPS che si unisce con LPS binding protei a formare il complesso LPS‐LPB liberazione da parte dei macrofagi o cellule endoteliali dotate di recettori CD14, CD11, CD18 o TLR4 o MD2, dei mediatori dell'infiammazione e di IL‐8 (una chemochine il cui ruolo è quello di attrarre leucociti soprattutto neutrofili. TNF, IL‐1, IL‐12, IL‐6, IFNγ FASE  1:  Ipertono  arteriolare  e  costrizione  degli  sfinteri  precapilalri  con  aumento  della  produzione  di  renina.  L'ischemia  capillare  determina  una  diminuzione  dell'apporto  di  O2  ai  tessuti  e  l'instaurarsi  di  un  metabolismo  anaerobio  con  aumento  di  acido  lattico  e  piruvico,  diminuzione  dei  fosfati e iniziale acidosi metabolica  FASE  2:  l’ipossia,  l’acidosi  e  le  anafilotossine  inducono  la  liberazione di  istamina  (porta a  vasodilatazione  arteriolare)  e  serotonina  (che  provoca  la  vasocostrizione  del  segmento  venoso postcapillare). Ne deriva  una  riduzione  del  ritorno  venoso;  ipotensione  arteriosa  che provoca  la stimolazione dei  barocettori  con  conseguente  liberazione di catecolammine  e  aumento  della  vasocostrizione  periferica  FASE  3:  attivazione  della  cascata di coagulazione a causa  del danno endoteliale (diretto e  indiretto); attivazione del fattore  Hageman,  agglutinazione  e  danno  piastrinico  con  liberazione di tromboplastina.  CID  ARDS DANNO MULTIORGANO  I  GRAM  +  rilasciano  acidi  teicoici  e  acidi  lipoteicoici,  esotossine,  super  antigeni,  l’esotossina  A  pirogenica  streptococcica  (SpeA), le emolisine,  20    INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO  ACCESSO DEI MICRORGANISMI AL SISTEMA NERVOSO   la via ematica è la più comune   per difetti congeniti   a causa di traumi, interventi chirurgici, in seguito all’introduzione di cateteri o sonde   attraverso focolai infettivi contigui (otite, foruncolo nasale, osteomielite vertebrale)   per utilizzo dei macrofagi come veicolo dal sangue al sistema nervoso centrale (meningoencefalite da HIV)   per via nervosa periferica (rabbia, encefalite da VZV)   lungo il nervo olfattivo (rabbia, encefalite da naegleria fowleri)  MENINGITI  = processi infiammatori di natura infettiva di   Dura madre ‐> PACHIMENINGITI (rare) si presentano come:   ascessi epidurali (tra la dura madre e il periostio)    empiemi subdurali (tra la dura madre e l’aracnoide)   Aracnoide e pia madre ‐> LEPTOMENINGITI  (o meningiti) sono infiammazioni delle meningi circoscritte entro  lo spazio subaracnoideo e sono sempre cerebrospinali.   In base all’eziologia, le meningiti possono essere classificate in:   BATTERICHE  ‐ patogenesi –     VIRALI → non esistono meningiti virali: si parla di MENINGOENCEFALITI per il coinvolgimento del parenchima  encefalico!  enterovirus (coxsackie)   Arbovirus   Virus parotitico    Herpes virus (HVZ, CMV, EBV)   HIV   Sedenovirus   Virus del morbillo   Virus della rosolia   Virus (para)influenzali   MICOTICHE   PROTOZOARIE   ELMINTICHE  inoltre, in base al decorso, si possono avere meningiti  → acute ‐> forme batteriche, virali, micotiche e protozoarie  → sub acute e croniche (meno frequenti) ‐> TBC, brucella, Lue, criptococcosi  I VARI TIPI DI MENINGITE:  MENINGITE  MENINGOCOCCICA  Si ha uno stato settico e un rush purpurico‐petecchiale (che, oltre alla cute, si può  trovare  sottoforma  di  emorragie  sottocongiuntivali  =  esordio  di  meningite  sostenuta da N. Meningitidis); quasi sempre si tratta di bambini e ragazzi.     MENINGITE TUBERCOLARE  esordio insidioso, molto più lento di quella meningococcica, con decorso subacuto  e cronico e compromissione dei nervi cranici    MENINGITE LUETICA  Si ha la compromissione dei nervi cranici   penetrazione per via nasofaringea, ematogena o per continuità invasione meningea moltiplicazione batterica nello spazio subaracnoideo e liberazione di componenti batteriche (LPS, peptidoglicano) attivazione delle cellule infiammatorie con liberazione di citochine e molecole di adesione per i neutrofili e loro degranulazione (EDEMA CITOTOSSICO) Infiammazione dello spazio subaracnoideo e aumento della permeabilità della barriera ematoencefalica con captazione albumina circolante (EDEMA VASOGENICO) aumento della resistenza riassorbimento liquorale per la presenza di essudato (EDEMA INTERSTIZIALE) IPERTENSIONE & IPOPERFUSIONE CEREBRALE 21    MENINGE CRITOCOCCICA  In  pz  affetti  da HIV  si  riscontrano febbre  e  cefalea  (decorso  subacuto‐cronico)  e  assenza di altri sintomi peculiari    MENINGITE   POST‐TRAUMATICA  solitamente si ha rino‐otorrea per fuoriuscita di liquor dal naso a causa della rottura  totale o parziale dell'etmoide, sostenuta da S. Pneumoniae    NEL NEONATO  assenza delle contratture muscolari e presenza di flaccidità    NELL’ANZIANO  letargia  e  ottundimento  del  sensorio,  possono  mancare  febbre  ed  altri  segni  meningei in quanto, nell'anziano, il sistema immunitario è depresso a causa dell’età     SEGNI E SINTOMI IN PAZIENTI CON MENINGITE BATTERICA   Cefalea   Febbre   Meningismo   Alterazione del sensorio   Vomito   Convulsioni   Alterazioni focali   Papilledema   Rigor nucalis   Segno di Kernig  (difficoltà a  flettere  le  cosce verso  il  bacino: a pz  seduto  si  impedisce questo movimento con  evocazione di un violento dolore al rachide)   Segno di Brudzinski (flettere energicamente con una mano la nuca del pz supino mentre con l'altra, appoggiata al  petto, gli si impedisce di alzare il busto: il segno è positivo quando il pz flette le ginocchia)    LIQUOR.  Viene prodotto dagli ependimociti (detti "taniciti") dei plessi corioidei nei ventricoli cerebrali per secrezione attiva, poi  circola  attraverso  i  due  forami  interventricolari  destro  e  sinistro  (forami  di Monro)  all'interno  del  terzo  ventricolo  cerebrale e attraverso il dotto mesencefalico (acquedotto di Silvio) nel quarto ventricolo cerebrale, da dove fuoriesce  (nei  pressi  del  cervelletto)  attraverso  due  aperture  laterali,  destra  e  sinistra  (fori  laterali  di  Luschka)  e  un'apertura  mediana (forame di Magendie). In seguito, fluisce attraverso la cisterna cerebro‐medullare fino a circondare tutto la  corda del midollo spinale e a lambire e proteggere gli emisferi cerebrali, per poi scaricarsi nel sistema venoso attraverso  le granulazioni del Pacchioni. Il riassorbimento avviene attraverso le cellule dei villi aracnoidei dei seni venosi.     VOLUME TOTALE DEL LIQUOR = 90 – 150 ml  → Protidorrachia = 15‐45 mg/dl  → Cellule = 0‐10 leucociti/ml (linfociti)  → Glucorrachia = 40‐80 mg/dl (60% della glicemia)    In base alle caratteristiche macroscopiche del liquor, si può capire l’eziologia della meningite:   liquor limpido = meningite asettica causata da virus, da tubercolosi, da leptospira, treponema e Brucella   Il  liquor  torbido  = meningite  settica  causata  da  batteri  (tranne  quelli menzionati  precedentemente),  protozoi  (naegleria o acanthamoebus) e miceti (candida o mucor).   Tra i fattori predisponenti di meningite settica si trova l’età        meningite  batterica  meningite  virale  meningite  tubercolare  encefalite  ascesso ASPETTO  Torbido/lattescente  Limpido Limpido Limpido  Limpido/torbido CELLULE  500 ‐ 10.000  neutrofili  50 – 1000 linfo‐ monociti  50 – 1000  linfo‐monociti  5 – 100   linfo‐monociti  5 ‐ 100  neutrofili  PROTEINE  +++  + ++ ‐/+  +++ GLUCOSIO  ↓↓↓  Normale ↓↓↓ Normale  Normale COLTURA  +  + + ‐  ‐   Per la DIAGNOSI EZIOLOGICA DELLE MENINGITI SETTICHE si procede come nello schema nella pagina successiva.  Per quanto riguarda    LA COLORAZIONE DI GRAM permette una rapida identificazione del germe nel 60/90% dei casi   Esame colturale: positivo nel 70/80% dei pz che non hanno ricevuto terapia antimicrobica (per l’identificazione  sono necessarie 48h)   AGGLUTINAZIONE AL  LATTICE: utilizza anticorpi contro antigeni eventualmente presenti nel liquor. È un test  rapido (pronto in 15min) e ha una sensibilità elevata per niesseriae meningitidis, E. coli, Haemophilus influenza,  Streptococcus pneumoniae o Streptococcus di gruppo B. La negatività del test, però, non esclude la presenza di  meningite batterica ma rimane utile se sia Gram, sia le colture non hanno dato risultati.   PCR utile per escludere diagnosi di meningite batterica      22        DIAGNOSI EZIOLOGICA DELLE MENINGITI ASETTICHE.   MENINGITE  TUBERCOLARE →  l’aspetto del  liquor è  limpido,  talvolta paglierino con proteine che  formano  il  reticolo di Maya, linfomonociti tra 100‐1000, proteine maggiori di 50mg al dl e glucosio minore di 45mg (ridotto  perché è consumato sia dalle cellule che dal micobatterio). Il micobatterio in questione è il m. tubercolosis    MENINGITE DA MOTT (da micobatteri non tubercolari) → Il liquor è limpido, talvolta giallino, linfomonociti da  100 a 1000, proteine maggiori di 50, il glucosio inferiore a 45. L’agente eziologico è M. avium oppure M. kansasii.    MENINGITE DA MYCOBACTERIUM  FORTUITUM →  il  liquor è limpido, talvolta torbido. I neutrofili possono  essere da 200 a 2000, le proteine maggiore di 50, il glucosio inferiore a 45    MENINGITE DA SPIROCHETE (treponema, borrellia, leptospira) → il liquor dall’aspetto sempre limpido, il tipo  cellulare  da  25  a  2000  linfomonociti,  proteine  inferiore  a  50,  glucosio  normale  o  raramente  diminuito. Non  è  possibile  coltivarli  e  si mettono  in  risalto  con  immunofluorescenza o microscopio per  contrasto di  fase  (in  cui  saranno visibili per la presenza di endoflagelli)   studio delle colonie  emolisi & ricerca dell'antigene → STREPTOCOCCHI A, B, C, D, F, G AGAR SANGUE  • test biochimici → STAPHYLOCOCCUS SP MSA  test biochimici → ENTEROBATTERI MACCONKEY AGAR  test di germinazione  se positivi → CANDIDA ALBICANS  se negativi → test biochimico per conferma di presenza di MICETI SABOURAUD AGAR  studio delle colonie &  test biochimici → NEISSERIA MENINGITIDIS → HAEMOPHILUS SP AGAR CIOCCOLATO SUPPLEMENTATO IN CO2 25    MALATTIE SESSUALMENTE TRASMISSIBILI  CLASSIFICAZIONE PER AGENTE EZIOLOGICO:    BATTERI    Treponema pallidum → LUE o sifilide  Neisseria gonorrhoeae → gonorrea   Chlamydia trachomatis → clamidia   Haemophylus ducreyi → ulcera venerea     Mycoplasma hominis;    Mycoplasma genitalium;    Gardnerella vaginalis;    Streptococcus β‐emolitico di gruppo B  VIRUS   Herpes simplex di tipo 1 e 2    HPV   Virus dell’epatite: HAV, HBV, HCV, HDV     Citomegalovirus   virus di Epstein‐Barr   HIV  PROTOZOI   Trichomonas vaginalis,    Entamoeba histolytica      Giardia Lamblia  FUNGHI    Candida albicans    ECTOPARASSITI    Phthirius pubis;      Sarcoptes scabiei, → Scabbia    LUE O SIFILIDE  È  la  terza MST per  diffusione  al mondo.  La  via  di  trasmissione  è prevalentemente  sessuale  (contatto delle mucose  genitali) ma vi può essere anche mediante sangue, saliva e per via transplacentare. La sifilide si divide in tre fasi:   sifilide  primaria  →  a  livello  delle  mucose,  il  treponema  attraversa  le  giunzioni  e  si  moltiplica  nel  punto  di  penetrazione causando, dopo circa 10/20gg una papula (sifiloma primario o chancre) che, dopo pochi giorni, si  trasforma  in  un’ulcera  a  fondo  duro,  indolore,  nel  cui  essudato  si  può  rinvenire  il  batterio;  poi  si  avrà  una  linfoadenopatia regionale e, successivamente, il passaggio dal sistema linfatico al torrente circolatorio. Il sifiloma  primario guarisce spontaneamente in 2 mesi, a volte anche prima.   Se non curata, passati 3 mesi, si avrà la dissipazione del treponema in diversi distretti corporei con:    rush mucocutaneo di  tipo maculo‐papulare o pustolare  sulle mani e sui piedi  (se  il  90% dei  rash cutanei  risparmia il palmo delle mani, in questo caso è colpito preferenzialmente)   faringodinia   cefalea   anoressia   linfoadenopatia  Il rash e i sintomi migliorano e il pz entra nella fase latente o clinicamente inattiva dello stadio di malattia: anche  questa  forma  secondaria  (molto  infettiva  dato  che  le  singole  papule  contengono  molti  treponemi)  spontaneamente guarisce. La fase latente può durare anche molti mesi o, addirittura, anni.   Sifilide terziaria: nei pz non trattati si instaura una malattia cronica diffusa di tipo granulomatoso che può causare  distruzione devastante di organi e tessuti (tra cui arteriti, demenza, cecità). Si ha la formazione di gomme luetiche,  lesione granulomatosa, priva di batteri, con necrosi colliquativa e cellule giganti, presente sulle ossa (in particolare  sui corpi vertebrali), sulla cute ed altri tessuti; queste guariscono spontaneamente lasciando cicatrici deformanti.  Le forme tipiche e più gravi sono la Neurosifilide (con distruzione progressiva delle radici posteriori e sclerosi dei  cordoni posteriori, quindi, disturbi nella coordinazione dei movimenti, paralisi progressiva e dolori agli arti inferiori)  e la Sifilide cardiovascolare (che comporta aneurisma dell’aorta).  TEST DIAGNOSTICI  I test comprendono test sierologici per la sifilide (STS) che consistono in:   test di screening (reaginici)   test di conferma (treponemici)   microscopia in campo oscuro  ‐ alcuni problemi ‐  1. Il T.pallidum non può essere coltivato in vitro. L’unico ceppo coltivabile è quello di Nelson, coltivato nel testicolo  del coniglio e utilizzato per produrre antigeni a loro volta utili per i test sierologici.  2. non è detto che il batterio si veda in microscopia data la sua dimensione assottigliata. Per questo viene preferita  la microscopia in campo oscuro oppure si impregna il campione con una sostanza che lo rende fluorescente.  → I   TEST  NON  TREPONEMICI  (O  REAGINICI)  utilizzano  un  antigene  lipidico  ossia  la  cardiolipina  (o  Aptene  di  Wasserman), estratto dal cuore di un bovino per rilevare la reagina (anticorpo umano che si legano ai lipidi).   I TEST DEL VDRL (reazioni di flocculazione) e il RPR, utilizzati per lo screening, sono esami sensibili, semplici e poco  costosi; tuttavia, non sono completamente specifici per il treponema: la cardiolipina è un antigene rilasciato dai tessuti  danneggiati durante l’infezione e potrebbero verificarsi reazioni crociate: se le reazioni sono positive si procede con la  conferma. Il risultato può essere definito qualitativamente e quantitativamente come titolo (= il reciproco dell’ultima  rilevazione alla quale il test risulta positivo ‐> 1:16, il titolo è 16).   Un vantaggio offerto da questo tipo di test è che è molto fedele per il follow up della malattia: nel giro di 1‐2 anni,  se la terapia è riuscita ad eradicare il batterio, il test reaginico si negativizza.  26    → I  TEST TREPONEMICI: sono test molto specifici che rilevano gli anticorpi anti‐treponemici. Comprendono:    REAZIONE DI ADSORBIMENTO IN FLUORESENZA, FTA‐ABS.  Prima di effettuare la tecnica, il siero viene fatto  adsorbire  con  antigeni  treponemici  aspecifici  (per  eliminare  quelle  Ig  dirette  contro  antigeni  treponemici  aspecifici); dopo si poggiano alcune gocce del siero su un vetrino che contiene sospensione di treponemi uccisi  ottenuti dal testicolo di un coniglio. Si incuba e poi si lava. Dopo si aggiunge un siero immune anti‐globuline umane  marcato con fluorescina, si incuba e si lava nuovamente. Quindi si osserva al microscopio a luce ultravioletta.   REAZIONE DI EMOAGGLUTINAZIONE PASSIVA, TPHA. Gli antigeni treponemici vengono fatti adsorbire sulla  superficie di globuli rossi; dopo si aggiunge il siero. La positività è data dall’emoagglutinazione   REAZIONE DI  IMMOBILIZZAZIONE DEI TREPONEMI, TPI. Si fa reagire il siero del pz con una sospensione di  treponema  pallido  ottenuto  dal  testicolo  di  un  coniglio  infetto.  In  presenza  di  complemento,  gli  anticorpi  si  legheranno alla superficie del treponema e lo immobilizzeranno: ciò si può apprezzare mediante osservazione al  microscopio con campo oscuro.  I test treponemoci possono rimanere positivi anche per tutta la vita    GONORREA O BLENORRAGIA  L’agente patologico è la neisseria gonorrhoeae   Nell’uomo, il gonococco si localizza nell’uretra nella quale causa secrezioni tipiche purulente: al risveglio il pz si  accorge  della  secrezione  di  pus  denso,  cremoso  e  giallastro  dall’orifizio  uretrale.  L’infezione  può  diffondere  causando orchiti, artriti, endocarditi e meningiti   Nella donna, il gonococco si localizza primariamente nelle ghiandole della cervice uterina, nelle ghiandole di Skene  e di Bartolini.  I sintomi non sono ben evidenti.  Il batterio può diffondere causando  infezione delle salpingi con  conseguente  infertilità.  Nelle  bambine  piccole,  dopo  abuso  sessuale,  si  possono  avere  vulvovaginiti,  in  cui  la  colonizzazione avviene a livello vaginale.   Nel 10/20% delle donne venute a contatto con N.gonorrhoeae, si può avere malattia infiammatoria pelvica:  l’essudato purulento si riversa nella cavità peritoneale.    Sindrome di Fitz‐Hugh‐Curtis: periepatite secondaria a salpingite. Nella donna l’apparato genitale è aperto:  in caso di salpingite importante, l’essudato può “cadere” libero nel peritoneo causando tale sindrome.  Oltre a queste manifestazioni si può avere    Proctite acuta ‐> perdite purulente dal retto   Faringite ‐> eritema faringeo   Infezione gonococcica disseminata (nell’1% dei casi)   Setticemia ‐> il gonococco entra in circolo, si moltiplica e da luogo a shock endotossico mediato dal LPS del batterio  (LOS) con febbre, brividi e rash petecchiale.   Artrite settica ‐> disseminazione alle articolazioni con febbre e segni di artrite (tumor, calor, rubor, dolor)   Oftalmia neonatorum ‐> affezione tipica dei neonati con trasmissione attraverso il passaggio dal canale del parto,  colonizza  la congiuntiva dell’occhio provocando congiuntivite purulenta che, se non trattata, si complica  fino a  cecità.  Viene  prevenuta  oggigiorno  con  la  profilassi  alla  Credè,  praticata  per  legge  alla  nascita:  si  applica  alla  congiuntiva del bambino una crema a base di eritromicina, tetraciclina, nitrato di argento.  TEST DIAGNOSTICI  A  seconda del  caso clinico,  i  campioni biologici possono essere:  tamponi uretrali  (i più  frequenti);  tamponi vaginali;  tamponi cervicali; tamponi rettali; tamponi faringei; liquido sinoviale; sangue   ESAME  MICROSCOPICO:  la mucosa genitale  possiede popolazione  commensale  che non presenta Neisserie,  quindi,  il  reperto  microscopico  di  Gram  ‐,  a  chicci  di  caffè  capsulati  in  un  essudato  purulento  derivante  da  infiammazione acuta delle vie genitali è già indicativo di gonorrea. Tuttavia, alcuni bacilli Gram‐ possono simulare  l’aspetto del gonococco: per questo sono impiegati sieri antigenococcici fluorescenti sul materiale patologico   ESAME COLTURALE: Il gonococco forma colonie S, che perdono facilmente l’antigene K divenendo di tipo R. i  terreni su cui poter coltivare sono tanti e vari,  il più interessate è il Thayer‐Martin: è a base di agar cioccolato,  vancomicina con colistina e nistadina, per cui  i batteri (e  i  funghi visto la presenza di nistadina) sono inibiti e  il  terreno è altamente selettivo e quindi può crescere soltanto Neisseria.   REAZIONI  SIEROLOGICHE: sono utili nel caso in cui non sia reperibile un campione da prelevare, in seguito a  guarigione clinica dell’infezione. Si ricerca la presenza di anticorpi nei confronti di antigeni provenienti da colture  di N.gonorrhoeae in fase S.   IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA ossidasi + e catalasi +; fermentazione degli zuccheri (sistema di riferimento API)   MALDI  ‐  TOF  tecnica  di  ionizzazione  soft  usata  in  spettrometria  di  massa  consente  di  misurare  in  maniera  estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare la loro identità  in base al rapporto massa/carica.    27    LINFOGRANULOMA VENEREO ‐> INFEZIONE DA CHLAMYDIA TRACHOMATIS  È la MST con maggior prevalenza nei paesi industrializzati. I sintomi iniziano 7‐21gg dopo l’esposizione e la trasmissione  avviene, esclusivamente, per via sessuale (ad esclusione di quei ceppi che danno tracoma e congiuntivite) e perinatale.   → Sono colpite di più le donne (nel senso che le manifestazioni cliniche nella donna sono molto più subdole e nascoste)  le manifestazioni in un’età che riflette i comportamenti sessuali, diminuendo drasticamente nelle donne dopo i 25  anni. Comunque, l’80% delle donne risulta asintomatico e, qualora dovessero esserci, i sintomi includono:   cerviciti   endometriti   salpingiti    bartoliniti   il 35% dei casi presenta uretrite non gonococcica con perdite mucopurulente, disuria e piuria.  → Gli uomini presentano, nel 75% dei casi, uretriti con secrezione filante, quasi trasparente e poco densa (≠ blenorragia  da neisseria in cui l’essudato è denso, cremoso e giallastro)  Altri fattori di rischio possono essere il basso livello socioeconomico e scolastico.  Elementi predittivi di infezione clamidiale sono:   giovane età ( < 21 anni)   partner con uretrite non gonococcica   nuovo partner nei due mesi precedenti   ectopia cervicale e/o essudato cervicale   sanguinamento durante il prelievo   contraccettivi non di barriera o nessuna contraccezione  alla colposcopia risultano:   portio congesta   essudato mucopurulento   ectopia  il Linfogranuloma venereo è causato dai sierotipi L1, L2, L3 di Chlamydia trachomatis. Si distinguono 3 fasi:   La prima fase inizia dopo un periodo di incubazione di circa 3gg con una piccola lesione cutanea presso il sito di  ingresso del batterio; questa può causare un’ulcerazione della cute sovrastante. La guarigione è così rapida da farla  passare inosservata.   Il secondo stadio,    nei maschi, inizia generalmente dopo circa 2/4 settimane con ingrandimento bilaterale dei linfonodi inguinali  che tendono a formare masse di grandi dimensioni, soffici e a volte fluttuanti (bubboni); questi aderiscono ai  tessuti profondi e causano infiammazione della cute sovrastante, a volte accompagnata da febbre e malessere.    nelle donne sono comuni il dolore alla schiena o alla pelvi; la lesione iniziale può presentarsi a livello locale o  presso  la porzione vaginale alta, esitando nell'aumento delle dimensioni e nell'infiammazione dei  linfonodi  pelvici e perirettali; possono svilupparsi fistole drenanti multiple da cui fuoriesce materiale purulento o sangue   nel terzo stadio, le lesioni guariscono esitando in cicatrici; tuttavia, le fistole possono persistere o ripresentarsi.  L'infiammazione persistente,  causata da  un'infezione non  trattata  che  ostruisce  vasi  linfatici,  causa  gonfiore  e  piaghe  della  pelle.  I  soggetti  che  hanno  rapporti  sessuali  passivi  anali  possono  avere  grave  proctite  o  grave  proctocolite con scariche rettali purulento‐sanguinolente.   Nelle fasi croniche, la colite simula la malattia di Chron: può causare tenesmo e stenosi del retto o dolore dovuto  ad  infiammazione dei  linfonodi di pelvici. La proctoscopia può  rilevare  infiammazione diffusa, polipi e masse o  essudato muco purulenti, segni che assomigliano alla malattia infiammatoria intestinale  DIAGNOSI    La diagnosi è posta, generalmente, attraverso la ricerca degli anticorpi nei confronti delle endotossine clamidiale  → titolo di fissazione del complemento > 1:64 o titolo della microimmunofluorescenza > 1:256   mediante genotipo usando un test di amplificazione degli acidi nucleici basato su PCR.   test immunologici diretti per gli antigeni (per esempio il test ELISA)    test di immunofluorescenza con anticorpi monoclonali,   ULCERA MOLLE  è una patologia abbastanza  rara nell’Europa centrale ma piuttosto diffusa nei Paesi  tropicali. A 2/6gg dall'infezione  compaiono, nel punto di contagio, ulcerazioni molli, dolorose e irregolari (≠ ulcera dura non dolente della Sifilide)  La  diagnosi  è  posta  tramite  ESAME  MICROSCOPICO  con  cui  si  accerta  la  presenza  dell'agente  eziologico  =  Haemophilus ducreyi → batterio Gram‐, (coccobacillo).                    30    MECCANISMO DI REPLICAZIONE  Caratteristica essenziale per il processo infettivo è la VARIABILITÀ GENOTIPICA E FENOTIPICA DELL’HIV; infatti,  per  l’elevata complessità del processo replicativo del virus, possono verificarsi diversi errori a  livello trascrizionale e  post‐trascrizionale, portando così ad un’ipervariabilità genotipica e fenotipica, che si esprime nei diversi pazienti con  differenze  tra  il  20% ed  il  40%.  Tuttavia,  è da  tener presente  che  anche  isolati  virali  dallo  stesso paziente  avranno  differenze importanti nelle diverse fasi della malattia, così come isolati virali prelevati contemporaneamente in diversi  distretti, avranno notevoli differenze genotipiche e fenotipiche (fenomeno della compartimentalizzazione)  Tali mutazioni determinano delle differenze dal punto di vista della:   Cinetica di replicazione, date da mutazioni dell’apparato trascrizionale.   Tropismo, date da mutazioni degli anti‐recettori virali, determinando particolari tropismi tessutospecifici.   Neutralizzazione anticorpale: più il virus muta, meno gli anticorpi sintetizzati lo riconoscono e neutralizzano.   Sensibilità  ai  farmaci:  essendo  estremamente  specifici,  anche  una  lieve  mutazione  determina  la  perdita  di  interazione tra farmaco e target.  MODALITÀ DI TRASMISSIONE    Comportamenti sessuali promiscui, senza l’uso di contraccettivi (preservativo)   Trasmissione a livello iatrogeno: per la sterilizzazione degli strumenti chirurgici e dentistici    Sacche di sangue ed emoderivati (ridotte al minimo perché testati)   Passaggio di siringe in tossicodipendenti   Mancata sterilizzazione degli aghi per tatuaggi o piercing   Trasmissione verticale, da madre a feto, nel momento del parto  CONCENTRAZIONE DELL’HIV IN DIVERSI LIQUIDI BIOLOGICI   Sangue = 100%   Liquido seminale = 75%   Secreto vaginale = 50%   Saliva, urine, sudore, lacrime = < 1%  la principale via di  ingresso dell’HIV è la penetrazione attraverso una superficie mucosa  31    FATTORI DETERMINANTI O PREDISPONENTI L’IMPIANTO DEL VIRUS NELL’ORGANISMO   carica virale infettante: 1ml di sangue contiene approssimativamente 1x105 particelle infettanti   inoculazioni multiple del virus   deve essere presente una immunodepressione anche transitoria   iperstimolazione immunitaria gioca, altresì, un ruolo molto importante   il rischio risulta aumentato in presenza di malattie veneree, malattie non veneree dell’apparato genitale, epatite in  oppure una fase avanzata di malattia.   PATOGENESI DELL’AIDS   INFEZIONE PRIMARIA: il periodo che intercorre tra il contagio e lo sviluppo della reazione anticorpale. Durante  questa fase la viremia si fa elevata ma viene contrastata dai CD8 (a dimostrazione del fatto che la risposta immune  riesce a bloccare l’infezione). Sono presenti sintomi generici come    febbre    perdita di peso,    malessere,    cefalea    neuropatia    faringite,    ulcere    linfoadenopatia in vari distretti,    rush cutaneo,   problemi esofagei,    mialgia,    epatomegalia     splenomegalia   nausea e vomito.   afte della mucosa orale,   SINDROME RETROVIRALE ACUTA: si ha dopo 3‐6 settimane nell’80% dei pazienti ed è caratterizzata da sintomi  generali  simili  alla  mononucleosi  infettiva  (febbre,  linfoadenopatie,  esantema  maculo‐papulare).  Si  esaurisce  spontaneamente nel giro di qualche settimana e si instaura un equilibrio tra virus e SI   FASE DI LATENZA: può durare anni o decenni grazie alle terapie. Nonostante la latenza clinica il virus si replica nei  distretti  linfoidi:  vi  sarà una  cronica  stimolazione del  SI  con progressiva distruzione dell’architettura del  sistema  linfoide e riduzione dei CD4+, < 500 cell/mm3. Questo comporta  l’abbassamento dei  linfociti T CD4 circolanti con  l’instaurarsi di infezioni opportunistiche: candidosi, febbri persistenti, dermatiti, infezioni batteriche ricorrenti   AIDS CONCLAMATO: stadio di linfoadenopatia persistente, con   astenia,    anemia,    emocitopenie periferiche,    ipergammaglobulinemia    infezioni opportunistiche   demenza da HIV   neoplasie come sarcoma di Kaposi, linfomi…    candidosi a livello oro‐esofageo (mughetto)   I linfociti CD4+ calano al di sotto dei 200/microlitro  TROPISMO NELLE VARIE FASI DELL’INFEZIONE                              VIRUS M‐TROPICO  Presente al momento della trasmissione e  nelle fasi di latenza clinica  VIRUS T‐TROPICO  Presente nelle  fasi  tardive della malattia,  altamente citopatico  VIRUS DUAL‐TROPICO  Macrofagi  CD4+  CCR5  Linea cellulare T CD4+  CXCR4  Cellule T primarie CD4+  CCR5 e CXCR4  32    ITER DIAGNOSTICO HIV  1. TEST DI SCREENING:    Test  combinati  (o  test  per  antigene  e  anticorpi  IgG/IgM)  su  siero  o  plasma  da  prelievo  di  sangue  venoso,  effettuati dal Laboratorio clinico in automazione mediante metodo immunoenzimatico o chemiluminescente  (EIA, ELISA). Tali test sono detti anche di 4° o di 5° generazione (rispetto ai test di 1° generazione del 1985 che  rilevavano  solo  IgG)  e  permettono  la  ricerca  contemporanea  di  anticorpi  anti  HIV‐1  e  2  (IgG  e  IgM) e  di  antigene p24 HIV‐1, che compare in circolo prima degli anticorpi. Utilizzano come substrato per la reazione di  ricerca degli anticorpi  IgG e  IgM antigeni purificati,  ricombinanti o sintetici e, come substrato per  la ricerca  dell’antigene p24, anticorpi monoclonali anti HIV.   → I  test  di  4°  generazione,  in  commercio  dall’inizio  degli  anni  2000  (e  raccomandati  fin  dal  2008  in  sostituzione dei test di 3° generazione), in caso di positività non sono in grado di distinguere gli anticorpi  dall’antigene p24 e quindi non distinguono  fra  infezione  recente  e  infezione  tardiva.  La  sensibilità  è  superiore al 99,5% e la specificità è 99,8%. L’aggiunta dell’antigene p24 riduce il periodo finestra a 15‐45  giorni dal contagio.   → I test di 5° generazione possono riportare separatamente i tre risultati per:   antigene p24 (con aumentata sensibilità rispetto ai test di 4°),    anticorpo anti HIV‐1 (gruppo M e O),    anticorpo anti HIV‐2.   Sono disponibili dalla fine del 2015, con sensibilità 100% e specificità 99,8%. Anche con questo tipo di test,  il  periodo  finestra per  la positivizzazione è di  15‐45 giorni, ma  la  capacità di  rilevare  l’antigene p24 è  maggiore, quindi la diagnosi può essere più precoce.  Non esistono falsi negativi e c’è una possibilità del 2 per mille di falsi positivi.    TEST RAPIDI eseguiti su sangue capillare (ottenuto tramite puntura del dito), su apposito dispositivo monouso  (strisce di nitrocellulosa o card) su cui viene deposta una goccia di sangue. Il metodo è immunocromatografico  e il risultato a lettura visuale è disponibile in 15‐20 minuti. Questi test, nella maggior parte dei casi, sono ancora  di 3° generazione; quindi, in grado di rilevare solo gli anticorpi IgG e IgM e non l’antigene p24: pertanto hanno  un periodo finestra di circa 30‐90 giorni (mediana 22 giorni). La sensibilità è > 99,5% e la specificità > 99,5%,  pari a 5 per mille falsi negativi e 5 per mille falsi positivi.   In  caso  di  positività,  non  permettono  una  diagnosi  definitiva  ed  è  sempre  necessario  eseguire  un  test  di  conferma di 4° o 5° generazione presso i Laboratori. I test rapidi rimangono utili per escludere il contagio in  rapporti sessuali a basso rischio, che si sono realizzati almeno 90 giorni prima o nello screening di popolazioni  a basso rischio.  Recentemente sono disponibili  in USA e in Europa test rapidi combinati, approvati FDA. Esistono anche test  rapidi che rilevano anticorpi nella saliva con performance lievemente inferiori, in quanto gli anticorpi presenti  nella saliva sono più scarsi rispetto al sangue.    TEST  PER  LA  RICERCA  DELLA  CONCENTRAZIONE  DELL'ANTIGENE  P24  che  permette  di  rilevare  le  infezioni entro pochi giorni dal contagio (12‐15), prima che vengano prodotti gli anticorpi anti‐HIV. Il test può  essere effettuato in laboratorio singolarmente (dopo un test combinato di 4° generazione) o all’interno di un  test di 5° generazione. Il ritrovamento della p24 in assenza di anticorpi anti‐HIV 1 e 2 è un marcatore di infezione  recente.  2. TEST DI CONFERMA   WESTERN BLOT (WB): si tratta di un test di conferma che si basa sul riconoscimento delle principali proteine  di HIV (p24, gp41, gp120) attraverso il loro frazionamento secondo il peso molecolare, mediante elettroforesi  e successiva visualizzazione del loro legame a specifici anticorpi su fogli di nitrocellulosa. un risultato positivo è  indicato dalla presenza di una qualsiasi combinazione di due delle bande. è stato utilizzato per molti anni per  confermare  i  test  di  3°  generazione,  nonostante  si  ottenessero  spesso  risultati  inconclusivi  (cosiddetti  indeterminati),  che  non  permettevano  una  diagnosi  definitiva.  Fin  dal  2014  i  CDC  di  Atlanta  hanno  raccomandato di non utilizzarlo più per la conferma, bensì di sostituirlo con test combinati in automazione più  affidabili ed in grado di differenziare fra HIV1 e 2, raccomandazione successivamente confermata da WHO; ciò  in quanto il WB è molto costoso, è eseguito solo in laboratori di riferimento, ha tempi di reazioni lunghi, richiede  la lettura da parte di personale di laboratorio addestrato e i risultati indeterminati costringono alla ripetizione  di un test combinato dopo altri 14 giorni, ritardando quindi la diagnosi di positività. Inoltre, un test negativo,  se il prelievo è stato effettuato pochi giorni dopo l’evento a rischio, non rilevando l’antigene p24, non garantisce  in modo assoluto che una persona non sia stata infettata.   I test combinati sopra indicati hanno periodi finestra più brevi, sono molto più rapidi, meno costosi ed usati in  sequenza  sono  più  efficaci  per  confermare  la  positività  del  primo  test  positivo.  In  Italia  vengono  ancora  effettuati da Centri di Riferimento, soprattutto in caso di positività inattesa (senza fattori di rischio riportati),  per valutare se l’infezione è recente.       35    ESOFAGO  ESOFAGITI  I microorganismi possono raggiungere l’esofago per    ingestione di secrezioni respiratorie    estensione di focolai infettivi contigui    via ematica.  AGENTI EZIOLOGICI   più comuni:    Candida albicans     Herpesvirus,    Citomegalovirus.  Agenti meno comuni:   Hiv‐1,    Mycobacterium tuberculosis,    Aspergillus,    Criptoccoccus neoformans,    Histoplasma capsulatum,    Pneumocystis carini,    C. parvum    ESOFAGITE  DA  CANDIDA  ALBICANS  è  molto  diffusa  nei  pz  immunodepressi;  si  manifesta  in  soggetti  che  presentano numerose condizioni predisponenti, locali o generali e, più comunemente, nei soggetti con AIDS (spesso  l’esordio clinico, o almeno il sospetto diagnostico, si presenta quando c’è il mughetto o l’esofagite da C. albicans).  ESOFAGITE DA CITOMEGALOVIRUS, presenta grandi cellule con inclusioni sia citoplasmatiche che intranucleari.  DIAGNOSTICA ETIOLOGICA delle esofagiti  → Se si ha il sospetto di infezione batterica o micotica: esame microscopico, coltura ed antibiogramma  → Sospetto di infezione virale:   esame colturale su linee cellulari sulle quali si dovrebbe notare, dopo 2‐3 gg, un effetto citopatico.   Si  tratta di  test  tradizionali/convenzionali  che  sono estremamente difficili  da eseguire  in  laboratori meno  specializzati,  in  quanto  bisogna  avere  linee  cellulari  per  ogni  agente  eziologico:  l’esborso  di  denaro  e  la  preparazione del personale deve essere molto elevata. Successivamente si può procedere con  il  fare una  identificazione più accurata con anticorpi fluorescenti.   Oggigiorno si preferisce la PCR e altri metodi molecolari che forniscono, in un tempo relativamente breve, il  risultato dell’agente eziologico responsabile dell’infezione.  LO STOMACO  GASTRITE / ULCERA  il primo agente eziologico sospetto deve essere Helicobacter pylori, batterio Gram‐, che può causare:   Gastrite cronica attiva    Ulcera gastrica   Ulcera duodenale   Se non curate l’ulcera gastrica e ulcera duodenale possono progredire nell’adenocarcinoma gastrico   Linfoma gastrico (più raro)  La trasmissione avviene per via oro‐fecale.  DIAGNOSI MICROBIOLOGICA delle infezioni gastriche.  Mediante esofago‐gastro‐duodenoscopia, un test invasivo, si può eseguire:   istologia del tessuto bioptico   un test rapido all’ureasi per la ricerca dell’Helicobacter   esame colturale   biologia molecolare della biopsia  All’introduzione dell’endoscopio, in presenza di Helicobacter, la mucosa si presenta irregolare e non sempre il colorito  rimane roseo: l’occhio più allenato può cogliere le caratteristiche tipiche dell’infiammazione.  → test rapido all’ureasi: Si inserisce un frammento bioptico in un mezzo liquido e l’attività ureasica si registra dopo  15 min per il viraggio di un indicatore: il colore giallo indica la negatività del test ≠ dal colore rosso  → esame  colturale  per  Helicobacter  =  può  essere  isolato  dalla  cavità  orale  o  dalle  feci.  Si  tratta  di  un  batterio  microaerofilo, quindi gradisce il 10% di CO2 e il 10% di O2, 35/37° temperatura e richiede almeno 6/7 gg di tempo  per crescere.  I  terreni  sono abbastanza ricchi, per esempio Helicobacter pylori Selective Agar contiene sangue,  emina, carbone.  I test non invasivi, quindi non endoscopici sono:   Urea breath test si raccoglie di un primo campione di aria espirata; poi viene somministrata al pz una bevanda a  base di urea‐C13 e, dopo circa 30 minuti, viene raccolto un secondo campione di aria espirata. Poiché Helicobacter  pylori scinde l’urea in bicarbonato (e quindi anche CO2) e ammoniaca, nel pz con infezione da Helicobacter pylori  la CO2 marcata espirata dopo mezz’ora sarà superiore a quella espirata da una persona senza infezione.   Ricerca dell’antigene fecale avviene mediante test ELISA   ricerca degli Anticorpi specifici su siero   ricerca Anticorpi specifici su urine    Anticorpi specifici su saliva    esame sierologico per la ricerca degli anticorpi (IgG) verso antigeni  Cag‐A e Vac‐A, con test ELISA  Gli anticorpi persistono per molti anni, non sono proteggenti ma  servono per documentare  l’esposizione al batterio, sia per studi  epidemiologici sia per la valutazione iniziale di un pz sintomatico.  36    INTESTINO   A livello intestinale si possono osservare 3 quadri sintomatici principali:   DIARREA: è quello più diffuso. È interessato il tratto prossimale dell’intestino tenue: è determinata da patologie  che  comportano  un’aumentata  perdita  di  fluidi,  questi  vanno  nel  lume  intestinale  e  rendono  più  morbido  il  contenuto fecale che si arricchisce di acqua e di elettroliti.   DISSENTERIA = frequenti evacuazioni intestinali di volume ridotto. È interessato il colon: presenza di sangue e pus  nelle feci, con dolore, febbre, crampi addominali.   FEBBRE  ENTERICA:  è  un’entità  nosologica  più  specifica:  è  una  malattia  acuta  sistemica  che  si  instaura  gradualmente, l’agente infettante è quasi sempre la Salmonella.     le SPECIE BATTERICHE che causano forme diarroiche acute acquose, non di tipo propriamente infiammatorio.   il principale è Vibrio cholerae   Alcuni ceppi di E. coli (ETEC)   Clostridium perfringens   alcuni ceppi di Shigella   meno S.aureus e B. cereus  le SPECIE BATTERICHE causa di forme dissenteriche di forme tipo francamente infiammatorio    Shigella (shigellosi)   Salmonella (salmonellosi)   Campylobacter   Yersinia enterocolitica   Vibrio parahaemolytucus   C.difficile   Alcuni ceppi di E.coli,   ENTERITOPATOGENI: agenti etiologici di infezioni esogene dell’apparato enterico, cioè dovute a patogeni che  attraversano il circuito oro‐fecale entrando in intestino.   EAEC – E. COLI ENTEROAGGREGATIVI ‐> scariche diarroiche durante la prima infanzia. Caratteristica di  questo ceppo è la produzione della tossina EAST   EPEC  –  E.  COLI  ENTEROPATOGENI  ‐>  diarrea  abbondante  con  muco  e  poco  sangue  per  un  tempo  maggiore ai 14 gg; febbre, malessere, vomito. È un’infezione caratteristica della prima infanzia    EIEC –  E.  COLI  ENTEROINVASIVI ‐> scariche diarroiche prima acquose, poi mucosanguinolente e ricche  di elementi polimorfo‐nucleati, accompagnate da febbre e crampi addominali   ETEC  –  E.  COLI  ENTEROTOSSIGENI  ‐>  diarrea  acquosa  (definita  dei  viaggiatori),  con  nausea,  dolori  addominali  e  febbre. Caratteristica è  la produzione di  tossine:  LT  (che  fa aumentare  la  concentrazione di  cAMP, che si traduce con fuoriuscita di ioni e acqua) e ST (che aumenta la concentrazione di cGMP)    EHEC O STEC – E. COLI ENTEREMORRAGICI ‐> sintomi dissenterici, che possono essere accompagnati  da emorragie coliche. Caratteristica è la produzione di due tossine: SLT1 e SLT2 (shiga like tossin = modificano  la sequenza del rRNA, in modo che non possa più legare il tRNA, bloccando di conseguenza la sinesi proteica)  tendono a diffondere nel circolo causando sintomi intestinali e sistemici: hanno specificità per gli endoteli  vascolari  della  parete  intestinali;  questo  danno  favorisce  la  liberazione  di  citochine  pro‐infiammatorie  e  fenomeni coagulativi, che portano a colite emorragica.    DIAGNOSI MICROBIOLOGICA: LA COPROCOLTURA  = esame colturale per la ricerca dei batteri e/o miceti nel campione fecale.   L’esame colturale si svolge su terreni di arricchimento, selettivi, differenziali ed è volta a   → Isolare di specie più comuni e importanti nella microbiologica dell’apparato gastrointestinale:   Salmonella    Shigella spp   Yersinia enterocolitica   Campylobacter yejuni  → Tipizzare degli stipiti isolati di E. coli al fine di individuare le tossine caratteristiche   → Dimostrare in modo diretto la presenza di batteri nel materiale fecale nel caso della colite da C.difficile   L’esame microscopico a fresco serve, soprattutto, ad evidenziare l’eventuale presenza di leucociti e/o emazie mediante  esame microscopico  diretto,  con  o  senza  colorazione:  essendo  le  feci  un  campione  polimicrobico,  è  praticamente  impossibile stabilire l’agente patogeno tra i vari commensali presenti (sono presenti 1011 batteri per grammo di feci!).     Appena arriva il campione di feci nel laboratorio bisogna aver cura di evitare di tenerlo in un ambiente caldo; quindi, si  procede  con  l’allestimento  in  terreni di  arricchimento:  il  più  utilizzato è  il BRODO  AL  SELENITO:  il  selenito  va  ad  “arricchire” il numero patogeni al fine di avere un quantitativo cospicuo rispetto ai commensali. In genere, dopo 24h, il  campione viene trasferito in altri terreni di coltura selettivi e differenziali:   BRODO DI HEKTOEN procedendo, quindi, all’identificazione di:   Salmonella: Colonie blu‐verdi con centro nero per produzione di idrogeno solforato;   Shigella: Colonie verdi con un leggero alone circostante che si sbiadisce verso l’esterno della colonia;   Escherichia coli: Colonie rosse – arancioni;   Proteus: Colonie piccole e leggermente trasparenti.   TERRENO MCCONKEY per i batteri Gram‐ (= enterobatteri)   SABOURAT sul quale si effettuano test di germinazione che se risultano   Positivi = presenza di candida albicans   Negativi, si procede con test biochimici per rilevare l’eventuale presenza di miceti   CIN AGAR YERSINIA per l'isolamento selettivo e differenziazione della Yersinia enterocolitica (casi sospetti)    37    NB: i test biochimici sono in grado di identificare il genere, ma NON la SPECIE per la quale si usa il test SIEROLOGICO.    DIAGNOSI DI FEBBRE ENTERICA (SALMONELLA)  Le manifestazioni gastroenteriche fanno parte di un quadro clinico molto più complesso in cui sono predominanti segni  e sintomi sistemici. L’andamento del tifo addominale è descritto dalla CURVA DI WUNDERLICH: dopo un'incubazione  di 7‐14 gg si ha la risalita della febbre in modo a sega per circa una settimana, con sintomi che comprendono astenia,  dolori  muscolari,  cefalea;  poi,  si  ha  una  settimana  di  febbre  di  stato  (durante  la  quale  si  può  avere  perforazione  intestinale o emorragia e del SNC sotto forma di torpore), seguita da una settimana di decremento della febbre.  Per quanto riguarda GLI APPROCCI DIAGNOSTICI del laboratorio di microbiologia clinica si ha che  → Durante la prima fase è si usa l’emocoltura perché la salmonella è presente abbondantemente in circolo.  → Successivamente, passati 14 giorni,  si deve utilizzare  la coprocoltura. Questa avviene per semina diretta o per  semina in terreni di arricchimento, soprattutto    terreno al selenito selettivo per salmonella o shigella, in cui la maggioranza dei batteri Gram ‐ commensali  non patogeni viene inibita.   Hektoen enteric agar dove Salmonella e Proteus formano colonie a centro nero (per la precipitazione di Sali  di ferro) che rimangono colorate di verde‐blu perché lattosio non fermentanti (≠ e.coli ‐lattosio fermentante‐  che  si  tinge  di  giallo‐rosso).  Per  differenziare  le  due  famiglie,  si  procede,  poi,  con  l’esecuzione  del  test  all’ureasi (negativo in caso di Salmonella e positivo per Proteus).    Nel caso di SOSPETTO CLINICO DI SALMONELLOSI è indicato associare un test sierologico.      LA REAZIONE DI WIDAL di solito associata a reazione di Wright (brucellosi), è una reazione di precipitazione in  fase liquida tra salmonelle inattivate (antigeni O e H) e anticorpi nel siero del paziente.   → un aumento del titolo Ab anti‐O è indice di infezione in atto,  → un elevato titolo Ab anti‐H è indice di un’infezione pregressa   Dopo 2 settimane dall’infezione (si consiglia di aspettare questo lasso di tempo) ci sarà un titolo anticorpale elevato  di anticorpi anti‐O. Dopo la terza‐quarta settimana comincia a montare il titolo degli anticorpi contro l’antigene H.    INFEZIONI ENTERICHE DA SHIGELLA SPP.  La S. DYSENTERIAE è la più frequente e la più patogena ed è l’agente ezilogico della dissenteria bacillare caratterizzata  da sintomi quali:   Scariche diarroiche muco‐sanguinolente   febbre,   dolori addominali,   tenesmo,   la trasmissione avviene per via oro‐fecale, per ingestione di materiale contaminato (scarsa igiene delle mani o di oggetti  come le stoviglie) oppure tramite mosche (vettori passivi); è la forma più contagiosa di dissenteria batterica: è sufficiente  una bassa dose per garantire la trasmissione ed è altamente contagiosità.   I meccanismi patogenetici consistono nella iniziale moltiplicazione nel tenue e successiva localizzazione al colon.  Il protagonista della patogenesi è la tossina di Shiga (un globoside GB3 che causa un blocco della sintesi proteica).    SHIGELLA DYSENTERIAE  SALMONELLA THYPHI dopo l’arrivo sulla superficie della  mucosa,  diffondono  alle  cellule  contigue  e,  successivamente  la  produzione di ascessi mucosali.  dopo l’introduzione del batterio all’interno della cellula della mucosa, avviene la  moltiplicazione  all’interno  della  cellula  che  viene  mantenuta  integra  per  un  certo periodo di tempo e, dopo, dal polo basale vengono emesse le salmonelle  che  vanno  ad  invadere,  spesso,  i  linfonodi  mesenterici  e  successivamente  il  circolo ematico.      CLOSTRIDIUM DIFFICILE  Il clostridium è un batterio sporigeno, che può sopravvivere per mesi nell’ambiente esterno (soprattutto ospedaliero).  I SOGGETTI  A  RISCHIO sono pz ospedalizzati (o meno) in cui  la somministrazione di antibiotici provoca alterazione  della popolazione microbica gastrointestinale con conseguente abbondante moltiplicazione di C.difficile   FORME CLINICHE   Colonizzazione asintomatica, in cui il soggetto è portatore    Diarrea autolimitante, che non progredisce   Colite pseudomembranosa, un’infezione che progredisce a fasi più avanzate e severe   La DIAGNOSI viene posta su campioni di feci su cui deve essere dimostrata la presenza di    Enterotossina A con test immunologici (come il test Elisa)   Citotossina B su colture cellulari in vitro, (saggio di citotossicità)      40    ESAME DOPO COLORAZIONE PERMANENTE  Per  osservare  i  dettagli  delle  cisti  nei  campioni  fecali,  possono  essere  eseguite  delle  colorazioni  permanenti  dopo  fissazione e decolorazione.   Colorazione tricromica: mostra i dettagli nucleari e citoplasmatici   Colorazione di Ziehl‐Neelsen: utilizza il principio dell’alcool‐acido resistenza;   attraverso questo metodo, si possono ricercare cisti di protozoi di   cryptosporidium (colorata di rosso quando viene applicata la colorazione di Ziehl‐ Neelsen) presenta un involucro  molto robusto, ed ha caratteristiche simili ai micobatteri    giardia si presenta ovalare, allungata e con l’assostile che divide in due la cisti in senso longitudinale    entamoeba è una cisti molto giovane dove c’è un solo nucleo    DIAGNOSI ENTAMBA HISTOLYTICA (importante protozoo patogeno dell’apparato digerente)   DIAGNOSI DIRETTA: esame parassitologico delle feci (gold standard).   si può procedere con un ESAME RADIOLOGICO (TC) e/o ESAME ENDOSCOPICO nelle amebiasi extraintestinali:  ameba histolytica presenta la formazione, non obbligatoria ma abbastanza frequente, di cisti di ameba soprattutto  nel fegato e in altri organi parenchimatosi.   DIAGNOSI  INDIRETTA:  avviene attraverso  test  sierologici  ed  immulogici  (ELISA)  che permettono  la messa  in  evidenza gli anticorpi nei confronti di questo protozoo.   ESAME COLTURALE su terreno di Robinson (terreno molto ricco che contiene diverse vitamine ecc)   TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE (PCR)    DIAGNOSI DI LABORATORIO PER LA RICERCA DI GIARDIA LAMBLIA, protozoo intestinale molto frequente  CAMPIONI:   Feci conservate a 4°C fino a una settimana   Se  l’esame  delle  feci  risultasse  essere  negativo  nonostante  il  forte  sospetto  clinico,  si  può  usare  una biopsia  duodenale allestita in soluzione fisiologica a temperatura ambiente, per circa 2‐3h   Succo duodenale o entero‐test (test ormai obsoleto),     Per la ricerca di Giardia lamblia si può procedere con:   OSSERVAZIONE MICROSCOPICA a fresco in soluzione fisiologica:  → Feci per la ricerca di cisti, raramente trofozoiti (si ritrovano nelle feci solo in corso di diarrea grave).  → Biopsie duodenali (trofozoiti mobili a foglia cadente).  → Succo duodenale (trofozoiti mobili a foglia cadente).   OSSERVAZIONE MICROSCOPICA dopo arricchimento delle feci in formalina/etere e colorazione di Lugol che  fissa il preparato e uccide le forme viventi:  → Utilizzato quasi esclusivamente sulle feci (cisti, raramente trofozoiti).   OSSERVAZIONE MICROSCOPICA dopo fissazione e colorazione con Giemsa, tricromica, ematossilina ferrica.  → Biopsie duodenali (trofozoiti a mascherone africano).  → Succo duodenale (trofozoiti a mascherone africano).   STUDIO DEGLI ANTIGENI DI GIARDIA (approccio diretto):   ELISA o mediante CARD IMMUNOGRAFICHE    COLTIVAZIONE IN TYI‐S‐33 (terreno specifico), un derivato del terreno di Robinson per le amebe.   BIOLOGIA MOLECOLARE:   PCR   GENOTIPIZZAZIONE, i genotipi umani (o meglio assemblaggi) di Giardia conosciuti sono 2    Le nuove applicazioni che riguardano la diagnostica coproparassitologica riguardano:   Metodiche sierologiche per la ricerca di Ac o Ag (IFA, ELISA...).   Programmi in grado di identificare le uova in base al loro pattern e alla loro struttura.   Metodiche di biologia molecolare per l’individuazione e/o la tipizzazione di parassiti (sia elminti che protozoi) nei  campioni fecali.   Nuove tecniche diagnostiche colturali               41    VIRUS EPATICI   I virus epatitici principali (per sensibilità e permissività delle cellule epatiche) sono virus epatotropi responsabili di epatiti  primarie. Si possono distinguere, in base la via di trasmissione, in    virus a trasmissione enterale o verticale: HAV (epatite A) e HEV (epatite E)    virus a trasmissione parenterale: HBV (epatite B), HCV (epatite C), HDV (epatite D).  La patogenesi è più meno uniforme e consiste in un’infiammazione diffusa del parenchima epatico caratterizzata da:   Necrosi degli epatociti: morte cellulare con conseguente rilascio di transaminasi in circolo;   Infiltrato flogistico con afflusso di cellule infiammatorie.    I VIRUS EPATICI A PRIMA VISTA    HAV  HBV  HCV  HDV  famiglia  Picornavirus  Hepandavirus  Flavivirus  Deltavirus  genoma  RNA  a  polarità  positiva  DNA parzialmente  bicatenario, circolare  RNA  a  polarità  positiva  RNA a polarità positiva  trasmissione   Oro‐fecale  Trasfusioni,  rapporti sessuali  via transplacentare    Trasfusioni Percutanea  Sessuale  È  difettivo:  richiede  una  coinfezione con HBV   incubazione  15‐50gg  6 mesi  5/10 settimane  30/45gg  cosa causa  Epatite acuta   Epatite cronica.   Cirrosi   carcinoma epatico   Epatite cronica.  Può portare anche a  carcinoma epatico  Aggravamento dell’epatite  con maggiori probabilità che  cronicizzi    DECORSO CLINICO DELL’EPATITE ACUTA (epatite autolimitante con restitutio ad integrum)   Periodo pre‐itterico caratterizzato da   → sintomi aspecifici (astenia, anoressia, nausea, vomito, febbricola o febbre)  → patologie da immunocomplessi (artralgie e mialgie)   periodo itterico in cui si ha   → comparsa di subittero e ittero  → epatomegalia  → aumento delle transaminasi (indice di citonecrosi epatica)   convalescenza = risoluzione dell’epatite con riduzione progressiva dei valori delle transaminasi    Per quanto riguarda i QUADRI CLINICI DI EPATITE ACUTA si hanno le fasi:   asintomatica (80/90% dei casi);   anitterica (sintomi aspecifici);   itterica.  Le epatiti A ed E non cronicizzano   Una complicanza dell’epatite è l’epatite  fulminante  (molto rara) che consiste nella necrosi massiva del fegato con  grave insufficienza epatica e richiede un immediato trapianto.  Per quanto riguarda i QUADRI CLINICI DI EPATITI CRONICHE si hanno quando epatiti B, D, C persistono per oltre 6  mesi in concomitanza con fattori favorenti quali età e risposta immunitaria dell’ospite, quindi, immunodepressione.  L’epatite cronica è spesso asintomatica e, per questa ragione, si devono valutare:   Transaminasi elevate per più di 6 mesi;   Ricerca di marker virologici;   Diagnosi definitiva con agobiopsia del fegato (che indica il quadro anato‐istologico del fegato).  Può evolvere in cirrosi (forma più avanzata dell’epatite cronica) e frequentemente in carcinoma primitivo del fegato.    ISTOPATOLOGIA DELLE EPATITI:   EPATITE  CRONICA  PERSISTENTE  è  caratterizzata  da  spazi  portali  allargati  con  infiltrato  infiammatorio  monoclueato e lamina limitante intatta. Si tratta di un danno epatico non progressivo.   EPATITE CRONICA ATTIVA è caratterizzata da spazi portali allargati con infiltrato infiammatorio e necrosi estese  oltre  la  lamina  limitante.  Nelle  forme  severe  vi  è  la  presenza  di  setti  fibrosi.  Si  tratta  di  un  danno  epatico  progressivo.   CIRROSI caratterizzata da fibrosi diffusa e necrosi portale confluente. Si perde, quindi, la caratteristica architettura  citologica ed  istologica del  fegato. Si assiste ad una  rigenerazione parenchimale disordinata con  formazione di  noduli epatici: a mano a mano  il  tessuto epatico  si  riduce e viene  rimpiazzato dal  tessuto  fibrotico.  Il danno è  irreversibile.    42    VIRUS DELL’EPATITE A  STRUTTURA:    virione sferico    RNA a polarità positiva   privo di rivestimento lipidico   circondato da un capside icosaedrico costituito da 60 copie multiple di 4 proteine: VPI1, VP2, VP3, VP4    LA MALATTIA  La classe di età più colpita risulta quella dei giovani adulti (15‐24anni).   → Nei bambini < 6 anni, il 70% delle infezioni da epatite A è asintomatico e, in bambini con sintomi, l'ittero è raro.   → la maggior parte dei bambini più grandi e gli adulti hanno, invece, le manifestazioni tipiche di un'epatite virale, tra  cui inappetenza, malessere, febbre, nausea e vomito; l'ittero si manifesta in oltre il 70%.  Le manifestazioni cliniche in genere si risolvono dopo circa 2 mesi ma in alcuni pz i sintomi persistono o si ripresentano  per un massimo di 6 mesi; altri hanno una colestasi prolungata (epatite colestatica) caratterizzata da marcato ittero con  prurito, febbre continua, perdita di peso, diarrea e malessere.  La guarigione dall'epatite A acuta è di solito completa. Raramente si verifica un'epatite fulminante.    FASI  incubazione ‐> 10/50gg. Dati clinici e di laboratorio assenti.  fase prodromica ‐> 2/10gg. Si ha   Malessere generale   Anoressia   Febbre ( < 39°C)   Nausea   Vomito   Mialgia   ↑ dei valori delle transaminasi   ↑ valore della bilirubina  fase sintomatica o di stato ‐> 3/4 settimane con   Ittero sclerale, poi diffuso   Urine scure   Feci ipocoliche   Epato‐splenomagalia   Transaminasi (500‐2000 UI/L)   bilirubina (10‐15mg/dl) guarigione ‐> si ha quando si registra   calo di transaminasi   calo di bilirubina   scomparsa di ittero   feci e urine normali    DIAGNOSI   TEST SIEROLOGICI.  Durante la fase diagnostica iniziale, l'epatite virale deve essere differenziata dalle altre patologie che provocano ittero.  Se si sospetta un'epatite virale acuta da HAV si procede con la ricerca degli anticorpi IgM anti‐epatite A.  La ricerca degli anticorpi IgG anti‐epatite A viene eseguita per distinguere un'infezione acuta da un'infezione pregressa:  la positività delle IgG anti‐epatite A suggerisce una precedente infezione da virus dell'epatite A o la presenza di immunità  acquisita. Non esistono ulteriori esami per l'epatite A.  → Gli Ac IgM tipicamente sono prodotti nelle fasi precoci dell'infezione e raggiungono il picco circa 1‐2 settimane  dopo la comparsa dell'ittero. Diminuiscono nel corso di alcune settimane, seguiti dalla produzione di anticorpi IgG  protettivi, che di solito persistono per tutta la vita.   ALTRI ESAMI.  Gli esami epatici sono necessari e comprendono    alanina aminotransferasi (ALT) sierica,    aspartato aminotransferasi (AST),    fosfatasi alcalina.  Altri test devono essere effettuati per valutare la funzionalità epatica:    albumina sierica,    bilirubina     I VACCINI ANTI‐EPATITE A sono preparati a partire da colture cellulari derivate dal virus inattivato con formalina. Ci  sono 2 vaccini antiepatite A entrambi disponibili in formulazione sia pediatrica che da adulti.  Il vaccino contro l'epatite A è una vaccinazione di routine dell'infanzia (programma di vaccinazione raccomandato per  le età 0‐6 anni) ed è anche indicato per   Operatori sanitari di pediatria e malattie infettive;   Operatori di istituzioni per malati mentali specialmente se bambini;   Viaggiatori che si recano in paesi a medio‐alta endemia;   Operatori ecologici;   Addetti alla preparazione degli alimenti;   Addetti alla manutenzione fognaria.   Il sesso tra uomini   L'uso di droghe illegali (iniettabili in vena e non), come le metanfetamine   Senzatetto    Una  buona  igiene  personale  aiuta  a  prevenire  la  trasmissione  oro‐fecale  dell'epatite  A.  Un’altra  tecnica  di  PREVENZIONE  è  la  somministrazione  di  immunoglobuline  con  un  elevato  titolo  anticorpale  avviata  prima  dell’esposizione dei casi secondari: un caso tipico è la somministrazione a familiari e contatti stretti di pz infetti. I limiti  di questa tecnica è che l’immunità passiva conferita dalle immunoglobuline è limitata a pochi mesi.  45    VIRUS DELL’EPATITE C   famiglia dei FLAVIVIRUS.   Genoma: una molecola di RNA a polarità positiva. genoma formato da una regione struttura ed una non strutturale  → Nella regione non strutturale si hanno i geni che codificano per gli enzimi che intervengono nella replicazione  (NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (quest’ultima è l’RNApolimerasi)   → Nella regione strutturale si hanno i geni che codificano per le proteine del core e dell’envelope. In particolare:   RNA‐binding protein: va a comporre il capside   E1 ed E2: compongono le glicoproteine di superficie  → Tra E1 ed E2 c’è la regione ipervariabile: una volta avvenuta l’infezione, tale regione muta, motivo per cui non  esiste un vaccino e ci si riferisce a questo virus con l’appellativo di quasi‐specie. Questa variabilità genomica è  una caratteristica molto importante perché fa sì che il virus non venga riconosciuto (e attaccato) dal SI.   Capside: composto dall’RNA‐binding protein, complessato con l’RNA   Peplos:  composto  dalle  glicoproteine  E1  ed  E2  che  interagiscono  con  il  recettore  cellulare  CD81,  con  coinvolgimento di altre molecole di membrana come lo scavenger receptor, la claudina e l’occludina.   Replica prevalentemente nelle cellule epatiche ma non è direttamente citopatico    Poiché l’RNApolimerasi virale non è in grado di correggere gli errori di inserimento di basi (non ha attività di proof‐ reading), il genoma muta frequentemente: esistono, infatti, 8 genotipi e 3 sottotipi (a,b,c)  → In Europa occidentale sono prevalenti i genotipi 1a, 1b, 2a, 2b, 3.  → Nell’Europa orientale e meridionale il genotipo 1 sottotipo b (1b). Questo è associato ad un’evoluzione più severa  della malattia    TRASMISSIONE    Parenterale classica   Inoculazione di sangue o emoderivati infetti   Trapianto di organi infetti   Parenterale inapparente   Tossicodipendenti  ed  esposizione  professionale  per  uso  di  siringhe  e  strumenti  taglienti  contaminati  (tatuaggi, piercing, attrezzatura dentistica e dall’estetista)   Sessuale   Verticale   Via transplacentare (la percentuale di trasmissione è del 5/6%. Aumenta se c’è una coinfezione da HIV)    PATOGENESI                                     Il danno del virus HCV è principalmente immuno‐mediato: esso, infatti, prima di giungere al suo sito d’elezione, ossia  il  fegato,  infetta  i  linfociti  T e B.  La velocità di  replicazione del  virus è molto alta.  La  risposta  immunitaria  innata  si  manifesta inizialmente con la produzione di citochine ma, alcune proteine codificate da HCV come NS3A, NS4A, NS4B  permettono al virus di eludere le difese immunitarie innate ed iniziare così una attiva replicazione virale: ciò comporta,  nella maggioranza dei casi, la persistenza e la cronicizzazione dell’infezione, con lesioni citopatiche ben evidenti. Tale  fenomeno trova riscontro in due principali manifestazioni cliniche:   cirrosi epatica, con perdita del tessuto epatico sano e successiva sostituzione con tessuto fibrotico, che comporta  una perdita progressiva delle funzioni epatiche con comparsa di ittero, ipertensione portale, ascite, varici esofagee,  encefalopatia epatica e, nei casi più gravi, se non è presente un intervento imminente, coma epatico;   epatocarcinoma, conseguente alla cirrosi, prima causa di trapianto di fegato.    Quando entra in circolo si lega al recettore CD81 (tetraspanina), espresso da epatociti e linfociti B oltre che ai recettori delle lipoproteine a bassa densità (LDL): spesso si ricopre di LDL o VLDL. Una volta endocitato nella cellula, HCV esce dagli endosomi, rilascia il proprio RNA a polarità positiva che, funzionando come un mRNA, tramite un'ansa si lega ai ribosomi cominciando la traduzione. Si ottiene un polipeptide di 3.011 amminoacidi che viene poi scisso proteoliticamente da NS2, NS3, NS4A e da proteasi cellulari. Il genoma viene replicato a partire dall'RNA a polarità positiva tramite NS5B, una RNA‐polimerasi RNA‐dipendente virale, si trascrive prima uno stampo di RNA a polarità negativa e successivamente a partire da questo si ottiene il genoma a polarità positiva. Il virione completo viene rilasciato per esocitosi. 46    STORIA NATURALE               DIAGNOSI  HCV non può essere riprodotto in coltura e la sua presenza non può essere dimostrabile tramite microscopia elettronica.  È stato il primo virus dell’epatite ad essere identificato usando approcci molecolari.      TEST ELISA TEST RIBA HCV‐RNA AST‐ALT  EPATITE CRONICA  + + + Alterate  INFEZIONE ASINTOMATICA  + + + Normali   INFEZIONE PREGRESSA LATENTE  +  + o ‐  ‐  normali    algoritmo diagnostico:  test  di  screening  →  reazione  immunoenzimatica  (TEST  ELISA)  per  la  ricerca  dell’antigene  HCV.  È  un  test  estremamente sensibile che consente di eliminare i veri negativi anche se è possibile ottenere falsi positivi, quindi  → Se negativo = effettuare nuovamente il test perché potrebbe essere nella fase di incubazione  → Se positivo = effettuare test di conferma    IMMUNOBLOT (TEST RIBA) è un test ad elevata specificità e sensibilità che offre la possibilità di conoscere anche  il  genotipo  del  virus.  attraverso  il  frazionamento  delle  proteine  virali  secondo  il  peso  molecolare,  mediante  elettroforesi e successiva visualizzazione del loro legame a specifici anticorpi su fogli di nitrocellulosa   → Se negativo: il paziente non è affetto da HCV  → Se positivo (almeno due anticorpi sono rivolti contro due diversi tipi di antigeni): il paziente è affetto   → Se il risultato è incerto si può andare a cercare un altro marcatore     HCV‐RNA è un test quantitativo e qualitativo. Si effettua tramite PCR e RT‐PCR:  l’RNA è l’unico marcatore  di stadiazione, guarigione e decorso della malattia, per cui si procede con l’amplificazione del filamento e con  la retrotrascrizione (mediante RT‐PCR)  → Se negativo:  il paziente sta guarendo. Controllo dei marcatori ogni 3 mesi  (particolare attenzione va  posta a pazienti cronici con transaminasi negative)  → Se positivo: valutare le transaminasi:   Se alte: agobiopsia   Se normali: controllo delle transaminasi ogni 3 mesi    Genotipizzazione mediante ibridazione inversa su fase solida (LIPA), così chiamata perché sulla strip di nitrocellulosa  sono presenti delle sonde che risconoscono un bersaglio e, in particolare, si procede in questo modo:  1. Estrarre il genoma virale dal siero del paziente  2. Amplificare il genoma virale  3. L’amplicone è biotinilato  4. Porre a contatto con una striscia di nitrocellulosa l’amplicone  5. Formazione dell’ibrido  6. Evidenza: la biotina è legata alla streptovidina che a sua volta è legata alla fosfatasi alcalina  7. Aggiunta del cromogeno che produrrà un colorante per le bande  8. Osservazione delle bande colorate    Epatite cronica C: TERAPIA = PEG‐IFNα + RIBAVIRINA                    47    INFEZIONI OSTEOARTICOLARI  OSTEOMIELITE  = infezione acuta o cronica del tessuto osseo  PATOGENESI  .                         negli adulti  (e  in piccola parte anche negli adolescenti)  il midollo osseo è costituito da  lipidi e S. aureus ha  un’attività  lipolitica  e  di  metabolismo  dei  grassi  altamente  spiccati  (anche  per  questo,  infatti,  è  uno  dei  principali agenti patogeni per quanto riguarda le infezioni trasmesse a livello oro‐fecale e tramite gli alimenti).   S. aureus rilascia anche tossine altamente osteolitiche. Queste caratteristiche lo rendono prevalente in tutte  le forme di osteomielite e in tutte le fasce di età.  → Nelle osteomieliti acute ematogene del bambino è responsabile di circa il 50% dei casi.  → Nelle  osteomieliti  del  diabetico  (sono  molto  frequenti)  S.  aureus  e  Staphylococcus  epidermidis  sono  presenti nel 50‐55% dei casi.    Altri MICRORGANISMI GRAM‐POSITIVI coinvolti sono    gli streptococchi (soprattutto di gruppo B)    i peptococchi anaerobi che possono raggiungere una prevalenza del 25‐30%.     I BATTERI GRAM‐NEGATIVI che possono provocare ostomieliti sono di maggiore riscontro nelle infezioni acquisite in  ambiente nosocomiale:    Enterobacteriaceae (come Klebsiella, portatore di numerosi geni di antibiotico resistenza)   Pseudomonas aeruginosa e le altre pseudomonadaceae, come Stenotrophomonas e soprattutto Acinetobacter.     Le osteomieliti fungine, infine, costituiscono un reperto molto infrequente e possono considerarsi rare.    L’osteomielite si caratterizza per l’inizio acuto. La SINTOMATOLOGIA include:   Dolore localizzato   Febbre (generalmente elevata)   Dolore alla palpazione   tumefazione,    eritema    Una forma particolare ma che deve essere attenzionata è l’ASCESSO DI BRODIE.  = ascesso cronico o subacuto nella metafisi dell’osso, formato da una cavità ripiena di pus circondato da tessuto fibroso.   È formato da detriti necrotici e cellule infiammatorie, a volte è sterile, ma molto spesso, si va a costituire un serbatoio  di batteri.  Inizialmente è asintomatico  (potrebbe esserlo anche per anni) poi  si manifesta dolore  intermittente e,  in  genere, febbre. Infine, deve essere sottolineata la tipicità dell’infezione in età giovanile.     Per quanto riguarda l’ITER DIAGNOSTICO:              Gli ESAMI CLINICI prevedono   l’isolamento    l’identificazione,   in campioni come l’agoaspirato dalla zona infetta dell’osso o dal periosto.   Se presente batteriemia associata, l’emocoltura può risultare positiva: se c’è un focolaio osteomielitico molto esteso,  abbastanza  frequentemente  c’è  batteriemia  e,  quindi,  una  sepsi  secondaria;  ciò  accade  spesso  a  livello  del  corpo  vertebrale, dove molti batteri possono portare sia forme acute ma soprattutto forme subacute o croniche (come nel  caso della Brucella)      STAPHYLOCOCCUS  AUREUS  ha  numerosi  recettori  per  il  collagene,  il  fibrinogeno,  la  fibronectina, le sialoproteine e l’eparansolfato. → ADESIONE  S. Aureus sintetizza polisaccaride capsulare (un glicocalice), producendo un biofilm all’interno del  quale i batteri formano colonie che sono protette dalla fagocitosi e dall’azione degli antibiotici  La  risposta  infiammatoria del  tessuto osseo porta  ad un aumento della pressione  intramidollare  con  alterazione del flusso ematico causando microinfarti: aree prive di circolazione sono un pabulum ideale  per i batteri facoltativi ma, soprattutto, anaerobi, provocando una osteomielite cronica.  sospetto clinico basato sui 2/3 sintomi e segni caratteristici. Si raccoglie l’anamnesi (particolare attenzione per traumi e fattori di rischio come presenza di una diatesi o di una malattia diabetica) si esegue un Rx diretto. 50    MALATTIE TRASMESSE DA VETTORI    organismo vivente che trasmette (trasmissione indiretta) un agente infettivo; può essere un organismo  superiore come un cane oppure inferiore come un insetto o un’aracnoide o un ectoparassita.                            Vettore biologico            vettore meccanico  Animale in cui l’agente replica oppure                  animale che veicola fisicamente un agente  compie una parte essenziale del ciclo di vita               che non replica né compie alcuno sviluppo  prima di essere trasmesso all’ospite                 nel vettore    MALARIA – LEISHMANIOSI – MALATTIA DI LYME (BORELLIOSI) – RICKETTSIOSI  LA MALARIA  = malattia  infettiva  causata  da  un  protozoo,  un microrganismo parassita  del  genere plasmodium,  che  si  trasmette  all'uomo attraverso la puntura di zanzare del genere anopheles.  Le specie di plasmodium che infettano l'uomo sono   P. Falciparum   P. Vivax   P. Ovale   P. Malariae    CICLO BIOLOGICO                                                       Il ciclo vitale del Plasmodium è caratterizzato da due fasi riproduttive:    RIPRODUZIONE ASESSUATA: avviene nelle cellule del fegato e nei globuli rossi del sangue dell’essere umano e  consiste in una scissione binaria dalla quale si ottengono sporozoi figli identici ai genitori. La riproduzione termina  sempre con la distruzione delle cellule parassitate. È durante questa fase che si manifestano i sintomi della malattia   RIPRODUZIONE SESSUATA: avviene nella zanzara a seguito della suzione di sangue infetto di un essere umano  nel  quale  erano  presenti  i  gameti  maschili  e  femminili  generatisi  durante  il  ciclo  nei  globuli  rossi  dell’ospite  definitivo. Durante la riproduzione asessuata, infatti, può accadere che, occasionalmente, alcuni sporozoi escano  dal ciclo e maturino in macrogametociti (gamete femminile) e microgametociti (gamete maschile), necessarie per  la riproduzione sessuale. Quando una nuova zanzara succhierà sangue dall’essere umano infetto assumerà anche  questi gameti, che troveranno nel suo intestino l’ambiente ideale per la fecondazione, dalla quale verrà generato  un oocinete e, dopo, un oociste che risalgono verso le ghiandole salivari per un nuovo ciclo, in seguito a lisi    51    CLINICA DELLA MALARIA  MALARIA TERZANA MALIGNA NON RECIDIVANTE – P. Falciparum  → Prepatenza (comparsa dei primi plasmodi nelle emoscopie, senza sintomi) = 9gg  → periodo di incubazione (comparsa dei primi sintomi) = 7‐14 gg (generalmente 2gg dopo la prepatenza)  → parassitemia (numero delle emazie parassitate per μL) = 200.00/2.000.000  → la fase acuta è caratterizzata da    febbre (terzana) si ha durante la fase ematica, cioè con la lisi dei globuli rossi e al riversamento dei cataboliti  tossici in circolo; il parossismo febbrile (accesso febbrile) è di 16‐36h con periodicità di 48h.   Disorientamento,    Convulsioni,    Segni focali,    Coma,    Rari segni meningei sempre associati a liquor normale.   Iperbilirubinemia fino all’ittero, (per la presenza di una gran quantità di emoglobina, proveniente dalla lisi  degli eritrociti, in circolo che viene tramutata dal fegato in bilirubina. L’emoglobinuria (l’emoglobina che non  fa  in  tempo  ad  essere  trasformata  in  bilirubina)  resta  in  circolo  e  viene  eliminata  attraverso  i  reni  →  insufficienza renale, necrosi tubulare e sindrome nefrosica.    Dispnea e tosse fino all’edema polmonare acuto, questo perché i merozoiti e altre forme del plasmodio della  malaria si intrufolano e bloccano i capillari polmonari.   Splenomegalia, coliche addominali  fino all’infarto  intestinale; per  invasione del parassita nei capillari della  milza e/o nei capillari intestinali   Piastrinopenia ma mai alterazione dei bianchi e dei rossi,    MALARIA TERZANA BENIGNA – P.vivax   → Prepatenza = 11 gg  → periodo di incubazione (comparsa dei primi sintomi) = 14 gg   → parassitemia (numero delle emazie parassitate per μL) = 20.00/50.000  → la fase acuta è caratterizzata da    febbre (terzana) in cui il parossismo febbrile (accesso febbrile) è di 8/12h con periodicità di 48h.   disorientamento e convulsioni,    iperbilirubinemia fino all’ittero,    dispnea e tosse,   splenomegalia,    piastrinopenia,   → le caratteristiche cliniche sono simili alla malaria terzana maligna, ma meno gravi. Non si hanno mai complicanze  come l’attacco pernicioso.  → È possibile che si abbiano   Recrudescenze (È la ricaduta causata dalla persistenza in circolo di forme intra‐eritrocitarie) dopo settimane  o, addirittura, 2‐3 mesi dall’episodio iniziale.   Recidive  (ricaduta causata dalla persistenza di merozoiti nel  fegato  (ipnozoiti)  che ricominciano un nuovo  ciclo eso‐eritrocitario) dopo 6 mesi dall’esordio dei sintomi.    MALARIA TERZANA BENIGNA RECIDIVANTE – P. ovale.  → prepatenza è molto lunga, con comparsa dei primi plasmodi dopo 15 gg.  → Incubazione = 17 gg  → La parassitemia pari a 9.000 – 30.000 emazie parassitate per μL di sangue.   Parossismo febbrile di 8‐12h con periodicità di 48h.   i sintomi sono gli stessi  → Recidive dopo 6 mesi dall’esordio dei sintomi.    MALARIA QUARTANA – P. Malariae  → Prepatenza = 16 gg  → periodo di incubazione (comparsa dei primi sintomi) = 28 gg   → parassitemia (numero delle emazie parassitate per μL) = 6.00/20.000  → la fase acuta è caratterizzata da    febbre (quartana) con parossismo febbrile di 8‐10h con periodicità di 72h.   disorientamento e convulsioni,    iperbilirubinemia fino all’ittero,    nefriti,    dispnea e tosse,   splenomegalia   piastrinopenia,  →  Recidive anche dopo 10anni dall’esordio dei sintomi (anche se in presenza di recidive è più probabile sia P.vivax)                52    DIAGNOSTICA   Il gold standard della diagnosi di malaria è l’emoscopia che si compone di due preparati microscopici:   LO STRISCIO SOTTILE → consente l'identificazione morfologica dei parassiti ematici. Per preparare uno striscio  sottile basta pungere, con un aghetto sterile, un polpastrello od un lobo auricolare, dopo averli disinfettati, e porre  una goccia di sangue ad un'estremità d'un vetrino. Si utilizza, poi, un secondo vetrino il cui bordo più piccolo viene  messo a contatto della goccia in maniera tale che strisciando sul primo, tutti i globuli rossi si dispongano a formare  un  singolo  strato. A questo punto  il  vetrino  viene asciugato all'aria,  fissato  in metanolo e  colorato  in maniera  opportuna. La metodica dello striscio sottile permette anche una quantificazione della carica parassitaria  il che  rappresenta un elemento utile nella valutazione della risposta terapeutica.  Parassitemia n° globuli rossi parassitati in 25 campi n° globuli rossi in 25 campi x 10   LA GOCCIA SPESSA → perme e d'esaminare una quan tà di sangue molto maggiore rispetto allo striscio sottile  determinando,  così,  un  aumento  della  sensibilità  soprattutto  in  caso  di  parassitemia  bassa.  L'identificazione  morfologica, invece, risulta essere molto più difficoltosa in quanto, con la rottura dei globuli rossi che si determina,  vari elementi utili per la diagnosi di specie, vengono persi. È per ovviare a tale problema che nella prassi vengono  effettuate entrambe le metodiche. Per preparare una goccia spessa si depongono su un vetrino 2 o 3 gocce di  sangue, prelevate con le stesse modalità dello striscio sottile. Con un oggetto appuntito si eseguono movimenti  circolari  che miscelano  le  gocce e  le  spianano.  Tale operazione  risulta necessaria  al  fine d'eliminare  la  fibrina.  Successivamente il vetrino viene lasciato all'aria per circa 12 ore e dopo si procede direttamente alla colorazione  (che permette la lisi degli eritrociti). Il vetrino non va asciugato al calore né fissato. Ciò è dovuto al fatto che i globuli  rossi durante la fase di colorazione si lisano ed un precedente fissaggio impedisce che tale fenomeno si verifichi.    Con  la  colorazione di Giemsa, effettuata al giusto pH  (7,2)  l’emazia  si  colora omogeneamente  in  rosa o  rosa grigio,  mentre il parassita presenta il citoplasma azzurro‐grigio e la cromatina del nucleo assume varie sfumature di rosso;      P. VIVAX  P. FALCIPARUM  P. MALARIAE  aumento di volume dei globuli rossi  Sì  No  No  granulazioni di Schuffner   (minuti e abbondanti)  Sì  No  No  granulazioni o incisure di Maurer  (pochi e grossolani)  No  Sì  No  globuli rossi con infestazioni multiple  Rara  Sì  No  anelli con 2 granuli di cromatina  Rara  Frequenti  No  presenza di gametociti   Sì   A semiluna  No  trafozoiti a banda  No  No  Sì  numero  di  merozoiti  per  schizonte  (range)  12‐24  gli  schizonti  sono  intrappolati  nei visceri e, in genere, non si  osservano  nel  sangue  periferico  8‐24  Lo  schizonte  presenta  da  8  a  10  merozoiti,  con  una  forma  a  margherita    P.OVALE è per l’80% la fotocopia del P.Vivax, caratteristica è la forma a cometa delle emazie (non del trofozoita); gli  schizonti maturi hanno forma a margherita e non più di 8‐10 merozoiti, (come in p. Malarie, ma sono più grandi e di  forma irregolare).    TEST IMMUNOCROMATOGRAFICI per la diagnosi di laboratorio (DIPSTICK TESTS)   Un anticorpo marcato reagisce con gli antigeni del plasmodio: il plasmodium‐LDH oppure la proteina ricca in istidina. A  tal proposito bisogna menzionare un limite:   → La proteina ricca di  istidina è  in grado di avere una reazione crociata con il fattore reumatoide; quindi, bisogna  contemporaneamente  fare  il  dosaggio  di  questo  fattore  e,  se  questo  ultimo  è  positivo,  il  test  non  ha  alcun  significato.   → Nel pLDH non c’è questo limite di cross reazione con il fattore reumatoide.  Gli immunocomplessi sono catturati da anticorpi immobilizzati durante la migrazione lungo la striscia cromatografica.    P. Falciparum o infezioni miste ‐> 3 bande   Campioni non‐falciparum positivi ‐> 2 bande   Campioni negativi ‐> 1 banda di controllo    55    LEISHMANIOSI  Il genere leishmania contiene diverse specie, che possono causare vari tipi di leishmaniosi; questi sono impossibili da  distinguerli tramite esami microscopici e colturali, pertanto, la differenziazione si basa su   diverse caratteristiche cliniche della malattia   Classificazione in specie e sottospecie basata su criteri di carattere eco‐biologico su base   geografica   della trasmissione operata da specie diverse di flebotomi (sebbene non esista una rigida regola per cui una  specie di flebotomo sia associata a una specie di Leishmania, sono presenti delle specie di flebotomi che più  frequentemente sono vettori di una determinata specie di Leishmania);   del diverso tropismo di organi profondi oppure tessuto cutaneo, o più raramente forme muco‐cutanee;   della diversa patogenicità:    FORME VISCERALI, più aggressive e mortali se non curate. Ne esistono 4 forme principali:  → La forma infantile mediterranea è quella più conosciuta, l'agente eziologico è L. INFANTUM   → La forma indiana/Kala‐Azar in cui l'agente eziologico è L. DONOVANI, il nome Kala‐Azar significa  urine nere o febbre nera per i fenomeni di metabolismo e di emolisi del sangue periferico   → La forma Africana/Arabica, la meno conosciuta, in cui l'agente eziologico è sempre L. DONOVANI  → La  forma Viscerale  Sudamericana,  in  cui  l’agente eziologico è  L.  CHAGASI  (dal  punto di  vista  genetico, non ha nessuna differenza con L. infantum, portato dai conquistadores)   FORME CUTANEE, che si risolvono da sole nel giro di 1‐2 anni   Classificazione in specie e sottospecie su criteri di carattere intrinseco:   Alcune caratteristiche immunologiche, quindi il panorama degli antigeni;   Peculiarità a livello degli isoenzimi (zimodemi) e del DNA mitocondriale,    Studio dei pattern di polimorfismo e DNA chinetoplastico    PATOGENESI  La Leishmania è una ZOONOSI → l'uomo può infettarsi tramite il morso di flebotomi portatori o vettori. Il ciclo della  Leishmaniosi vede normalmente il cane (o altri canidi selvatici o, più raramente, roditori) quali serbatoi dell'infezione;  mentre i flebotomi, in Italia soprattutto il PHLEBOTOMUS PERNICIOSUS, svolgono il ruolo di vettore.  I flebotomi sono attivi con temperature dai 20‐22°, però non sopportano temperature inferiori a 5° o superiori a 30°: si  spiega  in  questo modo  la  stagionalità  dell’infezione,  inoltre  le  punture  del  flebotomo,  a  differenza  di  quelle  della  zanzara, sono sempre all'imbrunire, intorno alle 7 nelle serate estive.                                            La  differenza  tra  il  ciclo  biologico  del  parassita  della  Leishmania  e  il  parassita  della malaria  è  che  nel  flebotomo  i  promastigoti  si  moltiplicano  nella  parte  prossimale  dell’intestino  (non  vengono  digeriti  e  non  vanno  incontro  a  replicazione  sessuale) per  la presenza di una valvola  stomodeale  che costringe  il  pasto ematico a non andare nella  seconda parte dell’intestino.          Le leishmanie, in forma di PROMASTIGOTE, vengono iniettate nell'ospite definitivo dal pappatacio femmina durante il pasto ematico. Il promastigote (forma flagellata) entra dalla ferita prodotta dalla puntura, nel circolo sanguigno periferico, viene ricoperto dalle proteine del complemento che richiamano i macrofagi che lo fagocitano. Il basso pH e l’elevata temperatura fanno sì che, dentro il vacuolo, il promastigote si trasforma in AMASTIGOTE (forma senza flagello); senza essere distrutto, si moltiplica fino a dare la lisi della cellula che lo ha fagocitato, liberandosi in circolo in grandi quantità per infettare altre cellule del sistema reticolo‐endoteliale. I pappataci si infettano con gli amastigoti durante il pasto ematico quando pungono un ospite infetto; nell'intestino dell'insetto gli amastigoti si trasformano in PROMASTIGOTI e cominciano a moltiplicarsi per scissione binaria, migrando verso le ghiandole salivari. I promastigoti diventano PROMASTIGOTI METACICLICI, forme infettanti pronte per essere iniettate in un nuovo ospite. 56    CLINICA DELLA LEISHMANIOSI VISCERALE  L’incubazione è relativamente breve, 4 settimane o massimo 9 (a volte più anni ma sono casi rari).  può rimanere latente e slatentizzarsi in seguito a immunodepressione.                    TIPIZZAZIONE   ANALISI ELETTROFORETICA DEGLI ISOENZIMI  Fino a 15‐20 anni fa, non essendo disponibile una tecnica per la caratterizzazione delle varie specie, le leishmanie  si  identificavano col solo esame microscopico;  il problema è che con questo esame non si può fare diagnosi di  specie; ciò rappresenta un problema, dato che ci sono   → alcune specie francamente viscerotrope (L. DONOVANI)   → alcune possono essere sia viscerotrope che con tropismo cutaneo (L INFANTUM)   → alcune possono essere in grado di provocare la forma mucocutanea (L.BRAZILIENSIS) molto aggressiva.  Un  metodo  di  elezione,  raccomandato  dalla  WHO,  per  identificare  i  parassiti,  utilizzando  ceppi  standard  di  riferimento – indispensabili – definiti biochimicamente e molecolarmente è l’analisi elettroforetica degli isoenzimi  utile  nel  definire  il  cosiddetto  ZIMODEMA.  La  coltura  dei  parassiti  è  un  preliminare  obbligatorio  per  l’identificazione mediante analisi degli isoenzimi.      TECNICHE MOLECOLARE  Con gli anni sono state messe a punto tecniche molecolari basate sull’amplificazione del DNA mediante PCR seguita  da sequenziamento o dall’analisi del polimorfismo dei frammenti dopo digestione con enzimi di restrizione.    DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLA LEISHMANIOSI VISCERALE   I REPERTI EMATOCHIMICI sono   → Pancitopenia (la più caratteristica, soprattutto in un soggetto in buono stato di salute) ≠ malaria in cui vi è  solo una piastrinopenia  → ipergammaglobulinemia    → VES elevata.   DIAGNOSI DIRETTA   Esame microscopico di strisci sottili di aspirato midollare/epatico/linfonodale, previa colorazione di Giemsa  prima  e  colorazione  Diff  Quick,  poi  (si  immerge  il  preparato  10  volte  nel  metanolo  (fissativo),  10  volte  nell’eosina (colorante di contrasto) e 5 volte nel Giemsa. si lascia asciugare e si mette per 1min circa nell'acqua  distillata pulita, lo si lascia asciugare e si osserva)   Esame colturale  in terreno NNN oppure EMTM (terreno di Evans modificato secondo Tobie) o nel terreno  brodo cuore‐cervello. È un esame poco usato per  la difficoltà nel coltivare  i protozoi: ha  lo  svantaggio di  richiedere tempi lunghi d’esecuzione e i terreni si conservano per poco tempo.   PCR   DIAGNOSI INDIRETTA  = Ricerca di anticorpi anti‐leishmania con    Immunocromatografia,    Test ELISA    Immunofluorescenza.   Test  di  Montenegro  (valenza  puramente  storica)  =  intradermoreazione  di  50‐100μl  di  un  estratto  di  promastigoti → test positivo se compariva una papula dura, indolore, di oltre 5mm entro 48‐72h.                      Sintomi:   febbre a gobba di cammello   sudorazioni notturne perché il pz sfebbra   calo ponderale dopo settimane o mesi   astenia   anoressia  Segni:  splenomegalia ed epatomegalia   alla palpazione la milza risulta “come di pietra”   ingrossamento dei linfonodi   talvolta iperpigmentazione della cute   presenza di macule ipopigmentate   papule e noduli diffusi al viso, tronco e arti APPENDICE MICROBIOLOGIA  REAZIONI SIEROLOGICHE  = reazioni antigene‐anticorpo che avvengono in vitro    SI ESEGUONO QUANDO    si vuole ricercare la presenza di anticorpi nel siero di un paziente per diagnosticare la malattia infettiva.    si vuole identificare un organismo in base agli antigeni che possiede    Alla base di ogni reazione sierologica c’è la FORMAZIONE DELL’IMMUNOCOMPLESSO, che è spiegata dalla teoria  del  reticolo →  solo  quando  la  concentrazione  degli  antigeni  e  degli  anticorpi  è  ottimale  si  creano  dei  ponti  tra  immunocomplessi formando, appunto, un reticolo.    AGGLUTINAZIONE: è una reazione molto sensibile, anche a piccole quantità di anticorpi ed è molto usata, ad esempio,  per la tipizzazione sierologica (tecnica di identificazione che fa uso di antisieri noti, che reagiscono con i vari antigeni  batterici ‐ non noti ‐ permettendone il riconoscimento).   DIRETTA → l'antigene corpuscolato (globuli rossi o batteri) viene posto a contatto (viene cimentato) con il siero  contenente anticorpi specifici. La presenza dell’immunocomplesso è visibile sul fondo di una provetta/del pozzetto   INDIRETTA → antigeni o anticorpi vengono fatti aderire artificialmente alla superficie di particelle corpuscolate  come il lattice di polistirolo, di colore biancastro; la reazione viene fatta correre su un substrato di colore nero.  La reazione di agglutinazione viene usata anche  in ematologia per  la determinazione dei gruppi sanguigni (sangue =  antisiero, viene messo a contatto con una goccia di antisiero conente l’anticorpo)   Nel 1901 il medico viennese Karl Landsteiner scoprì che    sulla superficie dei globuli rossi dell'uomo sono presenti delle sostanze chiamate agglutinogeni (antigeni)    nel plasma ci sono degli anticorpi chiamati agglutinine. Questi anticorpi sono capaci di distruggere, in vitro e in  vivo, i globuli rossi contenenti antigeni di gruppo diverso, tramite una reazione di agglutinazione. Per questo,  bisogna aver cura, prima di un’eventuale trasfusione o trapianto, che il ricevente non abbia anticorpi contro i  globuli rossi del donatore per scongiurare rischi di rigetto e formazione di coaguli (immuncomplessi)  Sulla base di queste scoperte, vennero classificati tre gruppi sanguigni. Nel 1902 venne scoperto il quarto gruppo.  1. Nel gruppo 0 non sono presenti gli antigeni (donatore universale)  2. Nel gruppo A vi è la presenza di un antigene indicato con una V.  3. Nel gruppo B si ha un antigene indicato con T.  4. Nel gruppo AB ci sono entrambi gli antigeni, V e T.  Nel 1941, Landsteiner e Wiener misero  in evidenza nei globuli rossi di una scimmia e, successivamente,  in quelli  umani, un nuovo antigene che chiamarono fattore Rh, capace di determinare la comparsa di agglutinine specifiche  nel sangue di altri individui. Per verificare la compatibilità del gruppo sanguigno della madre con quello del feto, per  valutare la compatibilità prima di eseguire una trasfusione di sangue o per accertare (diagnosticare) alcune forme di  anemia, si esegue il TEST DI COOMB; nel caso della gravidanza, il test si dice diretto, se la ricerca degli anticorpi  avviene nel sangue del neonato o indiretto, qualora la ricerca venga fatta nel siero materno    PRECIPITAZIONE: quando l'antigene è solubile (come nel caso di macromolecole o tossine) viene messo cimentato  con un siero contenente anticorpi specifici: all'inizio la miscela di reazione è perfettamente limpida, nel momento in cui  vi  è  la  giusta  concentrazione  di  anticorpi  e  antigeni,  con  formazione  di  immunocomplessi  e  di  reticoli  (punto  di  equivalenza), si riuscirà a notare, ad occhio nudo, il precipitato nella sua massima quantità.    IMMUNODIFFUSIONE → pozzetti scavati nell’agar nei quali si introducono antigene o anticorpo che diffondono,  in senso radiale e danno origine ad una banda di precipitazione dal punto di incontro.   IMMUNOELETTROFORESI → dopo elettroforesi delle proteine del siero sul gel di agar stratificato, ai lati, su dei  solchi, viene introdotto l’antisiero che contiene anticorpi: nel punto d'unione tra proteine del siero separate e i  rispettivi anticorpi, si formano degli archi caratteristici.   WESTERN  BLOT → permette di  identificare una determinata proteina  in una miscela di proteine, mediante  il  riconoscimento da parte di anticorpi specifici; per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima  separata utilizzando un gel di poliacrilammide (SDS‐PAGE); successivamente le proteine vengono trasferite su un  supporto, (una membrana di nitrocellulosa) e si procede al riconoscimento della proteina mediante l'utilizzo di un  anticorpo specifico: l’unione tra i due darà luogo ad un immunocomplesso che verrà segnalato per la presenza di  bande color ocra. Pur essendo meno sensibile (serve una concentrazione di anticorpi elevata), il western blot è  altamente specifico.