Tesi di laurea sul coinvolgimento dell'uniporto mitocondriale per il calcio nel ciclo cellulare, Tesi di Laurea Specialistica di Biologia. Università degli Studi di Ferrara
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Tesi di laurea sul coinvolgimento dell'uniporto mitocondriale per il calcio nel ciclo cellulare, Tesi di Laurea Specialistica di Biologia. Università degli Studi di Ferrara

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Coinvolgimento dell'uniporto mitocondriale per il calcio (MCU) nel ciclo cellulare. In questa tesi magistrale ho parlato del ciclo cellulare in generale e ho descritto l'uniporto mitocondriale per il calcio e successivam...
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FERRARA

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN

SCIENZE BIOMOLECOLARI E CELLULARI

Coinvolgimento dell'uniporto

mitocondriale per il calcio (MCU) nel

ciclo cellulare

Relatore:

Prof. Paolo Pinton

Correlatore:

Dott.ssa Elena De Marchi

Laureanda:

Annarita D’Introno

Anno Accademico 2012/2013

2

3

INDICE

ABBREVIAZIONI 6

INTRODUZIONE 11

IL CICLO CELLULARE

1. Le fasi del ciclo cellulare 12

IL CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE

1. Le cicline 15

2. Interazione tra Cdk e cicline 16

2.1 Regolazione delle Cdk 18

3. Transizione G0/G1 19

4. Transizione G1/S 21

4.1 Le proteine pocket Rb 22

4.2 I fattori di trascrizione E2F 23

4.3. Interazione tra Rb ed E2F 25

5. La fase S 27

5.1. Il controllo della replicazione del DNA 27

6. Transizione G2/M 29

7. La mitosi 29

7.1. Il complesso promotore dell’anafase (APC) 30

8. I checkpoint 32

IL SEGNALE CALCIO

1. I mitocondri 38

2. Produzione di messaggeri che mobilitano ioni Ca 2+

39

3. Attivazione del segnale Ca 2+

40

4. Ruolo del Ca 2+

come secondo messaggero 42

5. Spegnimento del segnale Ca 2+

43

6. Segnale Ca 2+

mitocondriale: meccanismo e regolazione 43

4

7. Il segnale Ca 2+

e apoptosi 45

8. Il segnale Ca 2+

e il ciclo cellulare 49

L’UNIPORTO MITOCONDRIALE PER IL CALCIO (MCU)

1. La scoperta di MCU 50

2. La conferma dell’identità di MCU 51

3. L’identikit di MCU 52

MATERIALI E METODI

1. Colture cellulari 54

2. Infezione di cellule MEF con adenovirus 55

3. Protocollo di sincronizzazione di cellule MEF 55

4. Western Blot 56

5. Monitoraggio dei livelli di Ca 2+

58

5.1 Misura della [Ca 2+

] mediante l’uso dell’equorina 58

5.2 Varianti ricombinanti dell’equorina 60

5.3 Ricostituzione 62

5.4 Misura di [Ca 2+

] 62

6. Misure del potenziale mitocondriale 63

7. Il citofluorimetro 64

8. Tali® Image-Based Cytometer 66

OBIETTIVI 67

RISULTATI

1. La sincronizzazione cellulare 68

2. Espressione endogena di MCU nelle diverse fasi del ciclo cellulare 69

3. La fisiologia del segnale Ca 2+

nelle diverse fasi del ciclo cellulare 70

4. Effetto della sovraespressione di MCU nel ciclo cellulare 73

5. Trattamento con MG-132 ed effetti sul ciclo cellulare 75

8. Emivita di MCU: trattamenti con cicloesimide 76

5

DISCUSSIONE 77

BIBLIOGRAFIA 81

6

ABBREVIAZIONI

Ψm Potenziale mitocondriale

[Ca 2+

]c Concentrazione calcio citosolica

[Ca 2+

]m Concentrazione calcio mitocondriale

aa Aminoacidi

ACS Sequenza consenso di ARS

AFU Unità arbitrarie di fluorescenza

Ag T Antigene T

Ap-1 Proteina attivante 1

Apaf-1 Apoptosis- protease activating factor 1

APC Complesso promotore dell’anafase

ARS Sequenze autonome di replicazione

ATM Ataxia-telangectasia mutated

ATP Adenosina trifosfato

ATR ATM and Rad3-related

Bp Paia di basi

BSA Albumina di siero bovino

Bub Budding uninhibited by benzimidazole

BRCA1 Breast cancer susceptibility protein

CaCl2 Calcio cloruro

cADPR ADP ribosio ciclico

CAK Chinasi attivata da Cdk

CaM Calmodulina

CaMK Chinasi calcio-calmodulina dipendenti

CAMKI Inibitore delle CAMK

CAMP Adenosin monofosfato ciclico

CBP cAMP-binding protein

CDK Chinasi ciclina dipendente

CIP Cdk-interacting protein

CKI Inibitori delle CDK

CR Calreticulina

7

C-terminale Carbossiterminale

CUL1 Cullina 1

cytAEQ Equorina citosolica

DAG Diacilglicerolo

DHFR Diidrofolato reduttasi

DHPR Diidropiridina

DMEM Dulbecco modified Eagle’s medium

DNA Acido desossinucleotidico

DP DRTF1 polipeptide

DSB Double strand break

DTT Ditiotreitolo

ECM Matrice extracellulare

EGF Fattore di crescita epidermico

Emi1 Early mitotic inhibitor 1

E1 Enzima attivato dall’ubiquitina

E2 Enzima coniugato all’ubiquitina

E3 Ubiquitin ligasi

ER Reticolo endoplasmatico

Erk Extracellular regulated MAP kinased

Ets Fattore di trascrizione

FAK Chinasi di adesione focale

FBS Siero fetale bovino

FBW7 F-box e WD 40 domain protein 7

FCCP Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone

FGF Fattore di crescita dei fibroblasti

GDP Guanosina difosfato

GFP Green fluorescent protein

GTP Guanosina trifosfato

H2O2 Perossido di idrogeno

HAT Istone acetiltransferasi

HDAC Istone deacetilasi

IMM Inner mitochondrial membrane

INK 4 Inhibitor Cdk4

8

InsP3R Recettore dell’inositolo-1,4,5-trifosfato

IP3 Inositolo trifosfato

IR Radiazioni infrarosse

kDa Chilodalton

Kip Kinase inhibitor protein

Lys Lisina

MAM Membrane associate ai mitocondri

Mapk Mitogen-activated protein kinase

Mapkk Mitogen-activated protein kinase kinase

Mapkkk Mitogen-activated protein kinase kinase kinase

MAt-1 Protein menage-a-trois-1

MCM Minichromosome maintenance protein

MCU Mitochondrial calcium uniporter

MEF Fibroblasti embrionali di topo

MgCl2 Cloruro di magnesio

mHCX Scambiatore H +

/Ca 2+

mNCX Scambiatore Na +

/Ca 2+

MPF Fattore promuovente la fase S

mtAeq Equorina mitocondriale

mV Millivolt

NAADP Acido nicotinico dinucelotidico fosfato

NaCl Cloruro di calcio

NaF Sodio fluoride

Na3VO4 Sodio ortovanadato

NLS Sequenza di localizzazione nucleare

nM Nano molare

nm Nanometro

NPAT Nuclear protein ataxia-telangiectasia locus

N-terminale Amminoterminale

OMM Outer mitochondrial membrane

ORC Complesso di riconoscimento dell’origine

O.N. Overnight

PB1 Phox and Bem 1

9

PCNA Antigene nucleare di proliferazione

PDGF Platelet-derived growth factor

PIKKS Phosphoinositide 3-kinase related kinase

PIP2 Fosfoinositolo 4,5-bifosfato

PKA Protein chinasi A

PKC Protein chinasi C

Plk Polo like kinase

PLC Fosfolipasi C

PMCA Plasma membrane Ca 2+

ATPase

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

Pre-RCs Complessi di pre-replicazione

PTP Permeability transition pore

Rb Retinoblastoma

ROCCs Receptor operated calcium channels

RNA POL II Rna polimerasi tipo II

RNPS1 Rna binding protein S1

RyR Recettore della rianodina

SDS Sodio dodecilfosfato

Ser Serina

SERCA Sarco-endoplasmatic reticulum calcium ATPase

SKP S phase associated protein

SMC Mantenimento strutturale della cromatina

SOCCs Store operated calcium channels

SPCA Secretory-pathway Ca 2+

ATPase

SR Reticolo sarcoplasmatico

SRSF Serine-arginine-rich splicing factor 7

S1P Sfingosina 1-fosfato

Thr Treonina

TFIIE Fattore di inizio della trascrizione

TMRE Tetramethylrhodamine ethyl ester

TMRM Tetramethylrhodamine methyl ester

Tyr Tirosina

TnC Troponina C

10

VDAC Canale anionico voltaggio dipendente

VOCCs Voltage operated calcium channels

wt Wild-type

µm Micrometri

µM Micromolare

11

INTRODUZIONE

La divisione cellulare rappresenta un processo universale per tutti gli organismi viventi e

garantisce la riproduzione, la crescita e lo sviluppo di un intero organismo. Le basi per lo

studio del ciclo cellulare iniziano ad essere sviluppate nel XVII secolo, quando furono

costruiti i primi microscopi e si iniziò ad esaminare più da vicino i microrganismi. Fu nel

1665 che lo scienziato inglese Robert Hooke osservò per la prima volta, al microscopio,

quelle che successivamente sarebbero state chiamate cellule: partirono da qui le osservazioni

future che gettarono le basi per la formulazione della teoria cellulare a metà del XIX secolo.

Questa afferma che tutti gli organismi viventi sono costituiti da cellule e che queste possano

derivare esclusivamente da altre cellule (Wolfe 1984).

Le prime osservazioni erano limitate ai cambiamenti morfologici che interessavano le cellule

durante la divisione come l’aumento delle dimensioni. Con il passare dei decenni e con lo

sviluppo di microscopi più sofisticati, come quelli elettronici, si sono potuti comprendere

anche i meccanismi molecolari del ciclo cellulare. Si è giunti, quindi, alla conclusione che la

regolazione di questo processo è alla base dell’abilità delle cellule di mantenere un’integrità

genetica, vitale per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare (Shackelford, Kaufmann et

al. 1999). Di notevole interesse attualmente sono le alterazioni delle proteine implicate nella

regolazione del ciclo cellulare, poiché sono direttamente coinvolte nello sviluppo di

tumori. Perciò la comprensione di tutti i meccanismi che regolano la proliferazione

cellulare diventa sempre più indispensabile al fine di poter trovare una cura a queste

patologie, così difficili da contrastare.

12

IL CICLO CELLULARE

1. Le fasi del ciclo cellulare

Nei mammiferi, il ciclo cellulare è costituito principalmente da due fasi: interfase e mitosi

(Fig. 1). L’interfase occupa la maggior parte del tempo della divisione cellulare e può

essere ulteriormente suddivisa in:

- fase G1, che prepara la cellula per la divisione del materiale genetico con un

aumento delle dimensioni e la sintesi di numerose proteine e organuli come

mitocondri e ribosomi;

- fase S, in cui avviene la sintesi del DNA;

- fase G2, che va dal completamento della fase S fino alla fase di divisione mitotica.

È caratterizzata da un’elevata attività metabolica e dalla sintesi del fuso mitotico;

- fase G0 o stato “quiescente”, rappresenta la fase in cui le cellule non si

dividono perché sono già differenziate e non proseguiranno nel ciclo di divisione;

oppure può trattarsi di una fase di attesa, per procedere in seguito alla divisione.

Figura 1. Descrizione delle fasi del ciclo cellulare (Rittershaus, Kechichian et al. 2006).

13

La fase mitotica comprende gli eventi più significativi della divisione cellulare e può essere

suddivisa in due fasi: mitosi e citodieresi. Nella prima si ha la distribuzione del materiale

genetico e del contenuto nucleare ai due nuclei figli, mentre la seconda permette la divisione

del citoplasma, al fine di ottenere due cellule indipendenti. Durante l’interfase, i cromosomi

non sono visibili singolarmente ma si trovano condensati sotto forma di cromatina,

un’associazione di DNA e proteine presente nel nucleo; nella fase di divisione la cromatina

spiralizza in singoli cromosomi che in seguito saranno divisi.

La mitosi è un processo continuo, in cui si possono individuare quattro fasi:

profase, metafase, anafase e telofase.

Al momento della profase, il materiale genetico è stato duplicato e la cellula ha aumentato le

sue dimensioni. Inizia la spiralizzazione dei cromosomi che sono costituiti da due cromatidi

identici, uniti in corrispondenza del centromero; nel citoplasma inizia l’assemblaggio del fuso

mitotico, costituito da microtubuli, che successivamente dirigerà il movimento dei

cromosomi. Alla fine si assiste alla frammentazione della membrana nucleare che, dopo la sua

scomparsa, permette ai filamenti del fuso mitotico di raggiungere i cromosomi e di attaccarsi

al cinetocore, di natura proteica. Questo legame porta allo spostamento dei cromosomi verso

il centro della cellula. Nel corso della metafase, il fuso mitotico si è completato ed è situato ai

due poli opposti della cellula mentre i cromosomi si sono disposti lungo il piano equatoriale. I

cinetocori dei due cromatidi di ciascuna coppia di cromosomi sono rivolti verso i poli opposti,

e i cromatidi disposti tutti dalla stessa parte sono legati da microtubuli che provengono tutti

dallo stesso polo della cellula (Harper and Brooks 2005). L’anafase rappresenta la fase più

delicata perché prevede il distaccamento dei due centromeri, in modo da separare i due

cromatidi di ciascun cromosoma, che vengono portati ai poli opposti della cellula. Durante

questa migrazione i microtubuli legati al cinetocore si accorciano, mentre quelli che non lo

sono si allungano; questo permette ai due poli di allontanarsi e alla cellula di allungarsi. La

fase termina quando i cromosomi hanno raggiunto i due poli della cellula. Successivamente,

nella telofase, si prosegue con l’allungamento della cellula iniziato precedentemente. Si

assiste alla formazione di due membrane nucleari distinte attorno a due poli, i cromosomi si

despiralizzano tornando a essere condensati sotto forma di cromatina e il fuso mitotico

scompare. Così si chiude la fase della mitosi vera e propria poiché è stata completata la

suddivisione del DNA in due nuclei completamente identici tra loro. La divisione del

citoplasma, ovvero la citodieresi, avviene contemporaneamente alla telofase, subito dopo la

separazione dei due nuclei. Nelle cellule animali questa divisione avviene quando nel mezzo

della cellula compare un solco di scissione, in corrispondenza del quale si trovano degli anelli

14

costituiti da filamenti di actina. La contrazione dell’anello permette il procedere di questa

strozzatura lungo tutta la cellula, al fine di ottenere due cellule distinte (Walczak, Cai et al.

2010). La durata del susseguirsi di questi eventi, in una cellula eucariotica che si trova in

uno stato di competenza mitotica, dura circa 24 ore. La fase G1 dura pressappoco 12 ore, 6/8

ore la fase S, 3/6 ore la fase G2 e 30 minuti circa la mitosi. Questi numeri sono solo indicativi

poiché la durata di ogni fase dipende dal tipo cellulare e dalle condizioni di crescita

(Shackelford, Kaufmann et al. 1999).

Il meccanismo di divisione di cui abbiamo discusso finora interessa le cellule

somatiche definite diploidi perché presentano un patrimonio genetico doppio (2n); infatti

sono costituite da due coppie di cromosomi omologhi che portano entrambi i geni

che controllano le stesse caratteristiche.

Nella specie umana ogni cellula somatica è costituita da 46 cromosomi totali derivati dalla

fusione di 23 cromosomi materni e altrettanti paterni, al momento della formazione dello

zigote. Il dimezzamento del patrimonio genetico, che permette alle cellule di divenire

aploidi (n), interessa solo quelle germinali, ossia i gameti (ovuli e spermatozoi). Ogni

cellula possiede quindi 22 cromosomi autosomici e uno solo sessuale, che può essere X o

Y. Il meccanismo che permette la generazione dei gameti viene definito meiosi e ha luogo

negli organi riproduttori (ovaie o testicoli) (Wolfe 1984). A differenza della mitosi, la meiosi

prevede due divisioni successive chiamate meiosi I e meiosi II da cui hanno origine quattro

cellule, ciascuna con la metà dei cromosomi della cellula madre. Questo avviene perché due

divisioni si susseguono in seguito ad un’unica duplicazione del materiale genetico.

La meiosi I ricalca un po’ le fasi della mitosi ad eccezione della profase I: mediante

un meccanismo chiamato sinapsi, i cromosomi omologhi si appaiano tra loro formando

le tetradi; grazie al crossing-over, i cromatidi omologhi si scambiano dei frammenti di DNA.

Ciò determina una ridistribuzione del materiale genetico e un aumento della variabilità

genetica; si spiega così il perché non siamo identici ai nostri genitori, ma solamente

simili. Alla fine della prima divisione, i cromatidi che costituiscono ciascun

cromosoma duplicato restano uniti ai loro centromeri, ma ogni tetrade migra verso un polo

della cellula. In seguito a telofase e citodieresi, ogni cellula è costituita da un patrimonio

aploide. Spesso c’è la possibilità che tra le due divisioni ci sia una pausa: i cromosomi

si spiralizzano di nuovo e si ricostituisce la membrana nucleare. La meiosi II è simile alla

mitosi, ad eccezione del fatto che si parte da una cellula aploide per ottenere quattro cellule

anch’esse aploidi; se nell’uomo si ottengono 4 gameti, nella donna solo una cellula diverrà

ovulo. (Campbell 1998).

15

IL CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE

1. Le cicline

Le cicline sono una classe di proteine scoperte nel 1983 da Tim Hunt e dai suoi colleghi che,

analizzando la loro espressione fluttuante, pensarono subito che potessero essere collegate a

processi fondamentali per il ciclo cellulare (Murray 2004). I livelli delle cicline variano

drasticamente attraverso le fasi del ciclo cellulare come conseguenza di cambiamenti

trascrizionali e di degradazioni mediate da proteasoma, infatti la loro sintesi e distruzione

avviene durante ogni fase del ciclo cellulare.

Di tutte quelle descritte finora, solo otto sono coinvolte nella progressione del ciclo cellulare:

ciclina A1 e A2, B1-B2-B3, C, D1-D2-D3, E1-E2, F, G1-G2, H. Tutte queste mostrano una

regione di 150 residui amminoacidici acidi chiamata cyclin box; questo dominio, costituito da

cinque eliche (Malumbres and Barbacid 2005) è responsabile del legame della parte N-

terminale di specifiche chinasi ciclina-dipendenti (Cdk) descritte più avanti (Harper and

Brooks 2005).

La fluttuazione dei livelli di espressione di queste proteine è stata dimostrata dal fatto che le

cicline A e B si accumulano all’inizio della fase S e in tarda G2 rispettivamente, mentre in G1

aumentano i livelli della ciclina D1 e rimangono elevati fino alla mitosi. Mentre le cicline A e

B contengono un “destruction box”, le cicline D ed E contengono una sequenza PEST, ovvero

un segmento ricco in residui amminoacidici di prolina (P), acido glutammico (E), serina (S) e

treonina (T); queste sequenze sono necessarie per una efficace proteolisi mediata

dall’ubiquitinizzazione alla fine di ogni fase del ciclo cellulare (Vermeulen, Van Bockstaele et

al. 2003). La ciclina H forma dei complessi con Cdk7 per costituire un enzima noto come

CAK, (chinasi attivata da Cdk); CAK è coinvolta nell’attivazione di CDC2 e

Cdk2 rispettivamente, mediante la fosforilazione dei residui di Thr 160 e Thr 161.

Assieme alla Cdk 7 e a MAt-1 (protein mènage-à-trois-1), la ciclina H forma un

complesso terziario che modula la trascrizione, agendo sull’attività della RNA polimerasi II

(RNA pol II). La ciclina T sembra non essere coinvolta direttamente nella regolazione del

ciclo cellulare, ma il suo legame con la Cdk9 la rende attiva in vari processi come

trascrizione, trasduzione del segnale e differenziazione (Harper and Brooks 2005).

Delle 29 cicline individuate perché contenenti la cyclin box, restano alcune sprovviste di una

proteina-partner in grado di legarle:

16

- ciclina F, presenta delle somiglianze con le cicline A e B. Sembra che possa

interagire con la ciclina B e Cdk1 per formare un complesso trimerico;

- cicline di tipo G (G1-G2), sono il target di p53 e sembrano essere

coinvolte nell’arresto del ciclo in G2/M, in seguito a danneggiamento del DNA;

- ciclina I, forse non collegata al ciclo cellulare;

- ciclina di tipo M e ciclina O, forse trasportano ioni e riparano il DNA,

rispettivamente.

L’analisi del genoma umano ha portato alla scoperta di altri loci che potrebbero codificare per

altre cicline sulla base di omologie con la cyclin box ma le loro funzioni restano ancora

sconosciute (Malumbres and Barbacid 2005).

2. Interazione tra Cdk e cicline

Le Cdks (Chinasi ciclina-dipendenti) sono una famiglia di Serina/Treonina protein chinasi,

che vengono attivate da specifiche cicline (Harper and Brooks 2005) e in determinati punti del

ciclo cellulare (Vermeulen, Van Bockstaele et al. 2003).

La scoperta dei primi membri di questa famiglia (Cdk1), avvenne attraverso

screening genetici di mutanti (Schizzosaccharomyces pombe e Saccaromyces

cerevisiae), presentanti difetti nel ciclo cellulare. Il termine Cdk fu stabilito durante il Cold

Spring Harbor Symposium del 1991 (Malumbres and Barbacid 2005).

La formazione di specifici complessi cicline/Cdk assicura la progressione del ciclo cellulare;

le cicline presentano dei picchi di espressione in particolari momenti e poi vengono degradate,

assicurando l’attivazione periodica delle Cdk, che al contrario presentano dei livelli di

espressione costanti (Fig. 2).

Essenziale per l’entrata in G1 è il legame della famiglia delle cicline D (D1, D2, D3)

alle Cdk4 o Cdk6; le cicline D vengono legate anche dalla Cdk2 ma

preferenzialmente quest’ultima lega le cicline E durante la transizione G1/S e la ciclina A

durante la fase S. La transizione G2/M vede la formazione del complesso ciclina A/Cdk1

mentre il complesso mitotico è rappresentato dalla ciclina B e dalla Cdk1 (Vermeulen, Van

Bockstaele et al. 2003). Sono state scoperte altre Cdk non coinvolte nella regolazione del

17

ciclo cellulare, ma con altri ruoli biologici. La Cdk8 unita alla ciclina C è stata trovata in

multicomplessi con RNA pol II, controllandone la funzione, mentre la ciclina T, assieme alla

Cdk9, non partecipa direttamente al controllo del ciclo cellulare in quanto coinvolta in

processi di differenziazione e regolazione trascrizionale. La ciclina H in associazione con la

Cdk7 è in grado di fosforilare CDC2 (nota come Cdk1) e Cdk2, l’estremità C-terminale

della RNA pol II e il TFIIE (fattore di inizio della trascrizione) (Harper and Brooks

2005). Cdk5 è attivata da due proteine, p35 e p39, espresse nel cervello; i due complessi che

si formano (Cdk5/p35 e Cdk5/p39) sono in grado di fosforilare numerosi substrati coinvolti

nella trascrizione (p53), nelle funzioni neuronali, nella migrazione e nella trasmissione

sinaptica. La chinasi è in grado di legare anche le cicline D ed E, ma il complesso non è

dotato di attività chinasica. Cdk10 forse è in grado di regolare il passaggio G2/M mentre

Cdk11, legandosi alla ciclina L, interagisce con i precursori dei fattori di splicing dell’mRNA,

come RNPS1 (RNA binding protein S1) e SRSF7 (serine/arginine-rich splicing factor 7);

sempre questo complesso, interagendo con l’RNA pol II, controlla la maturazione

dell’mRNA (Malumbres and Barbacid 2005).

Figura 2. Rappresentazione schematica dei complessi cicline/Cdk attivi durante le fasi del ciclo cellulare (Malumbres and

Barbacid 2005).

18

2.1. Regolazione delle Cdk

L’attività delle chinasi coinvolte nel ciclo cellulare è regolata su molti livelli: il legame con le

cicline, con proteine inibitrici (CKI), fosforilazioni e defosforilazioni e la localizzazione

subcellulare.

Il legame con le cicline forma dei complessi attivi che integrano segnali

extracellulari, promuovendo l’avanzare del ciclo cellulare. Il legame si attua in due step

consecutivi: appena la ciclina si lega, conferisce alla Cdk una parziale attività chinasica e

un cambiamento conformazionale; successivamente la fosforilazione del complesso è mediata

da CAK: l’enzima è capace di fosforilare residui specifici di tirosina (Thr 160 in CDC2 e Thr

161 in altre Cdk). La ciclina legata è in grado di avvicinare questi residui alla regione T-loop

delle Cdk, permettendo una piena attivazione (Harper and Brooks 2005).

Una volta che il complesso è stato attivato, sarà in grado di agire su specifici

substrati, promuovendo la progressione del ciclo cellulare. Sembra che siano forse le cicline

a determinare una specificità di substrato, come descritto in seguito.

I complessi ciclina/Cdk possono essere regolati negativamente mediante fosforilazioni in

adiacenti residui di Thr e Tyr presenti nella subunità delle Cdk, da chinasi come Wee1 e

Myt1; il risultato è l’inattivazione del complesso. Queste fosforilazioni possono essere

revertite da fosfatasi della famiglia CDC25; questi enzimi agiscono come regolatori positivi

defosforilando gli stessi residui di Thr e Tyr, attivando il complesso (16236519). La famiglia

è formata da diversi tipi di fosfatasi: CDC25 A è coinvolta nella transizione G1/S, CDC25 B

interviene nella fase S, mentre CDC25 C attiva il complesso ciclina B/Cdk1 per permettere

l’ingresso in fase M. La deregolazione di questi enzimi è associata con la formazione di

tumori umani: CDC25 A e B sono considerati dei potenziali oncogeni e CDC25 B viene

sovraespresso nel 32% dei tumori al seno. Il coinvolgimento di queste fosfatasi

nell’insorgenza di tumori è dovuto anche al fatto che la trascrizione di questi geni è attivata da

c-Myc, uno dei più frequenti oncogeni mutati in tumori umani. Sembra che questi opposti

regolatori siano localizzati anche in compartimenti differenti: Wee1 e Myt1 sono

presenti, rispettivamente, nel nucleo e nel Golgi e proteggono la cellula da una prematura

mitosi; le fosfatasi, invece, sono mantenute nel citosol grazie alle proteine del gruppo 14-3-3

e queste ultime sono in grado di sequestrare il complesso ciclina B/Cdk1 nel citosol in seguito

ad un danno del DNA (Vermeulen, Van Bockstaele et al. 2003).

Una delle classi di regolatori negativi è rappresentata dagli inibitori delle Cdk (CDKIs). Sono

state individuate due tipologie distinte: la famiglia dell’INK4 (inhibitor of Cdk4) e CIP (Cdk-

19

interacting protein)/KIP (kinase ihnibitor protein). La famiglia INK4 comprende p14, p15

(INK4B), p16 (INK4A), p18 (INK4C) e p19 (INK4D); nello specifico inibiscono i complessi

ciclina/Cdk della fase G1 (ciclina D/Cdk4 e ciclina D/Cdk6). Questi inibitori formano dei

complessi stabili con le Cdk prima del legame con le cicline, prevenendo l’associazione con

la ciclina D (12814430). Gli inibitori CIP/KIP includono invece p21 (CIP1/WAF1/SDI1),

p27 (KIP1) e p57 (KIP2), che sono simili nei primi 70 aa presenti nella regione N-

terminale; questa regione è coinvolta nel legame con le cicline e nell’inibizione della

funzione chinasica. Ogni famiglia agisce mediante due meccanismi differenti: mentre i

membri della famiglia CIP/KIP legano e inibiscono interi complessi ciclina/Cdk, quelli

della famiglia INK4 bloccano il legame delle cicline mediante cambiamenti allosterici

nelle CdK che alterano il sito di legame delle cicline (Harper and Brooks 2005).

3. Transizione Go/G1

La transizione da G0 a G1 è l’unica fase che non è sotto il controllo dei complessi ciclina/Cdk,

ma viene regolata da altri fattori.

Il ciclo cellulare è fortemente influenzato da segnali esterni e soprattutto da fattori di crescita

come EGF (fattore di crescita epidermico), FGF (fattore di crescita dei fibroblasti), elementi

necessari per permettere alle cellule di rientrare nel ciclo cellulare. Questi fattori sono in

grado di legarsi a recettori tirosin-chinasici presenti sulla membrana; dopo il legame, questi

recettori dimerizzano e si autofosforilano in residui di tirosina, presenti nei domini

intracellulari. La fosforilazione avvia il reclutamento di numerose proteine che, interagendo

tra loro, attivano delle cascate di trasduzione del segnale che portano al reclutamento di fattori

nucleari trascrizionali, i quali, a loro volta, attivano l’espressione di geni.

Una delle più conosciute vie di trasduzione del segnale attivate da fattori di crescita

è rappresentata dalla via delle MAPK (mitogen-activated protein kinase); le MAP

chinasi sono attivate da fosforilazioni in residui di Tyr promosse dalle MAPKK

(mitogenactivated kinase kinase), che a loro volta vengono attivate dalle MAPKKK

(mitogenactivated protein kinase kinase kinase).

Sembra che la via MAP/RAS controlli direttamente l’espressione dei geni della ciclina D.

MAPK controlla l’attivazione di AP-1 (proteina attivante 1) e il fattore di trascrizione ETS,

che transattiva il promotore del gene della ciclina D che contiene specifici siti di legame per

20

AP-1 ed ETS. La via MAP/RAS è coinvolta anche nella sintesi degli inibitori CIP/KIP:

stimolando cellule in fase G0 con fattori di crescita, queste mostrano un rientro nel

ciclo cellulare (Harper and Brooks 2005).

Figura 3. Segnali mitotici redox-dipendenti convergono sul cuore della regolazione del ciclo cellulare (Burhans and Heintz

2009).

L’attivazione dei recettori tirosin-chinasici (Fig. 3) avvia due cascate di chinasi fondamentali

per la proliferazione: SOS-Ras-Raf-Erk e PI3K/AKT.

La produzione di H2O2 è richiesta per la proliferazione in risposta a EGF, FGF,

PDGF, insulina e altri fattori di crescita. Circa l’1-4% di ossigeno è convertito in H2O2,

questa diffonde nel citosol e, assieme al superossido, influenza lo stato di ossidazione

e l’attività di chinasi e fosfatasi; si promuove così la progressione del ciclo cellulare, agendo

su regolatori in grado di promuovere la trascrizione della ciclina D1 (Burhans and Heintz

2009). Le interazioni tra le cellule e i componenti della matrice extracellulare (ECM)

influenzano la crescita e la differenziazione. La matrice è composta da un network di proteine

e proteoglicani che ne costituiscono l’impalcatura e trasmettono le informazioni tra cellule; le

interazioni tra cellule e matrice extracellulare sono realizzate da proteine ponte come

laminina, fibronectina e vitronectina. Queste ultime legano specifiche proteine transmembrana

21

come le integrine, il cui lato citosolico interagisce con il citoscheletro; sono coinvolte nella

migrazione e nella morfologia cellulare. Le interazioni tra integrine e ECM avviano la

fosforilazione di Tyr che attiva le chinasi di adesione focale (FAK); la fosforilazione e

l’attivazione delle FAK dipende dalle integrine che mediano segnali di adesione cellulare.

Questi possono innescare alcune vie di trasduzione del segnale che possono avere

conseguenze sulla progressione del ciclo cellulare. L’adesione delle cellule avvia un’efficiente

attivazione dei complessi ciclina D/Cdk4 e 6, ciclina E/Cdk2 e la soppressione degli inibitori

delle Cdk; al contrario, nelle cellule non adese, i bassi livelli di ciclina D e gli elevati di Cdk

arrestano la cellula in G1 (Boonstra 2003).

4. Transizione G1/S

L’attivazione dei complessi ciclina D/Cdk2, ciclina D/Cdk4 e ciclina D/Cdk6 è fondamentale

per la progressione in fase G1. L’attivazione della ciclina D, proteina nucleare, in seguito alla

stimolazione di fattori di crescita, avviene in quattro fasi:

- induzione trascrizionale: il promotore risponde a diversi stimoli mitotici e

la trascrizione dipende dalla via Ras/Raf-1/Mek/Erk;

- stabilizzazione della proteina: la ciclina D1 ha un’emivita molto limitata che

dipende dalla degradazione secondo ubiquitinizzazione, che viene stimolata dalla

fosforilazione sulla Thr 286, da parte della glicogeno sintasi chinasi 3β;

- localizzazione a livello nucleare;

- assemblaggio con i complessi prima descritti.

La ciclina D è una proteina regolatoria, la cui sintesi è dipendente dai fattori di crescita e si

accumula in momenti critici del ciclo cellulare, prima che la cellula passi i checkpoint

(paragrafo discusso successivamente, vedi capitolo 8) e prosegua nella sintesi del DNA

(Blagosklonny and Pardee 2002). Una volta attivati, i complessi esercitano la loro regolazione

cellulare mediante la fosforilazione delle proteine pocket della famiglia del Retinoblastoma

(Rb); queste agiscono reprimendo l’attività del fattore di trascrizione E2F, essenziale per la

trascrizione di geni che dirigono l’ingresso in fase S. Diversi sono i meccanismi che

intervengono nella regolazione di questa transizione, dovuti alla via Ras/MAPK:

22

- l’attivazione della ciclina D e la sintesi della famiglia CIP/KIB, in particolare p21;

- l’espressione della ciclina D porta al rilascio di E2F, seguito dalla fosforilazione

di pRb;

- l’assemblaggio dei complessi ciclina A/Cdk2 e ciclina E/Cdk2, che incrementano

i livelli dei CDKs (Harper and Brooks 2005).

4.1. Le proteine pocket Rb

Questa famiglia è costituita da un gruppo di tre oncosopressori: pRb, p107 e p130.

L’espressione di questi membri cambia durante l’avanzare delle fasi del ciclo cellulare: pRb è

iperfosforilato e poi inattivato alla fine della G1; p130 è fortemente espresso in G0 e

diminuisce in fase S, mentre p107 mostra dei livelli contrari a p130 (Harper and Brooks

2005).

Il gene del retinoblastoma (Rb) fu identificato negli anni ’90 come il primo oncosoppressore,

mutato frequentemente in un tumore oculare pediatrico, il retinoblastoma, da cui prende il

nome la proteina. Il gene codifica per una fosfoproteina di 928 aa che arresta il ciclo cellulare

in fase G1; Rb subisce fosforilazioni e defosforilazioni: sembra che la forma iperfosforilata sia

maggiormente presente nelle cellule proliferanti, mentre quella ipofosforilata (attiva) è

riscontrata di solito in cellule quiescenti o in fase di differenziazione. La proteina è costituita

da diversi domini funzionali: i domini A e B sono altamente conservati dalle piante agli

umani e interagiscono con degli estesi interdomini per formarne un altro definito “pocket”,

il quale è fondamentale nella funzione di oncosopressore della proteina.

Numerose oncoproteine virali sono in grado di legare Rb: E1A (adenovirus), SV40, AgT,

E7 (papillomano umano 16); questo sottolinea come i tumori virali siano capaci di interferire

con il ciclo cellulare. Queste proteine e altre endogene capaci di legare Rb, lo fanno attraverso

un motif LXCXE: la struttura cristallografica rivela la sua presenza nel dominio B. Il legame

del dominio A con quello B sembra indispensabile per una conformazione pienamente attiva

del dominio B. Tra le proteine endogene troviamo l’istone deacetilasi (HDAC 1 e 2) e i

complessi rimodellanti la cromatina SWI/SNF. Al contrario, E2F non contiene il motivo

LXCXE e perciò si lega in un altro sito che è in contatto sia con il “pocket” che con la regione

C-terminale. Nella regione C-terminale troviamo un altro dominio che contiene un sito di

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legame per la tirosin-chinasi c-abl e MDM2, diverso da quello che lega E2F. L’attività della

chinasi è bloccata quando è legata a Rb: l’interazione sembra essere importante durante la

soppressione della crescita mediata da Rb. Quando Rb è iperfosforilato, la chinasi attiva viene

rilasciata. Nella regione N-terminale troviamo i siti consenso di fosforilazione delle Cdk,

che regolano l’attività di queste ultime quando sono fosforilate durante il ciclo

cellulare. Questa regione terminale interagisce con diverse proteine come MCM7 (fattore

di replicazione), nuove chinasi che regolano la transizione G2/M e altre, di cui non si conosce

bene la funzione (Harbour and Dean 2000). La perdita di questi tre fattori porta ad un

incremento della trascrizione operata da E2F.

Dall’analisi della sequenza amminoacidica, si è dedotto che pRb presenta diversi siti

di fosforilazione su Ser e Thr: sembra che siano proprio le cicline D (forse anche le cicline E)

ad essere implicate nella fosforilazione e nella formazione di complessi con pRb, ma

la funzione di quest’ultimo rimane ancora sconosciuta. Un modello proposto per

questa interazione vede il complesso ciclina D/Cdk4-6 inizialmente fosforilare pRb e

poi questo si mantiene fino a quando anche il complesso ciclina E/Cdk2 viene attivato; oppure

il primo complesso può modificare pRb affinchè possa essere utile anche per il secondo

(Weinberg 1995).

4.2 I fattori di trascrizione E2F

La famiglia è composta da sette membri (E2F1-E2F7), che si trovano in forma eterodimerica

in associazione con le proteine DP (DRTF1 polipepetide), per aumentare l’affinità di legame

con altre molecole; nei mammiferi sono stati individuati due geni DP (DP1 e DP2) che

codificano per questi fattori.

La struttura dei fattori E2F (Fig. 4), mostra la presenza di domini altamente conservati per il

legame con il DNA (DB), per la dimerizzazione e per legare le Cdk (Harper and Brooks

2005). È possibile dividere i membri di questa famiglia in vari sottogruppi, basandosi

sulla struttura, l’affinità ai membri della famiglia Rb e la funzione:

- E2F1, E2F2, E2F3 svolgono un ruolo chiave nella progressione G1/S e possiedono

il sito di legame per Rb nel dominio di transattivazione;

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- E2F4-E2F5 legano entrambi Rb, ma anche p107 o p130 e sono incapaci di indurre

la fase S in cellule quiescenti, seppure siano espresse durante il ciclo cellulare;

- E2F6 perde il dominio transattivante e anche il sito di legame per Rb; la funzione

di questo fattore è sconosciuta, ma stando alla sua struttura, si può dedurre che agisca

come repressore della trascrizione di questi fattori;

- E2F7a e E2F7b presentano due domini di omologia per legare il DNA, definiti DB1 e

DB2 (Muller, Bracken et al. 2001).

Figura 4. Rappresentazione dei domini costituenti i fattori E2F. NLS: sequenza di localizzazione nucleare; DBD: dominio di

legame al DNA (Chen, Tsai et al. 2009).

La deregolazione di questi fattori è una delle cause che portano allo sviluppo di tumori, perciò

l’attività di E2F è finemente regolata. I livelli di espressione sono scanditi dalle fasi del ciclo

cellulare: la trascrizione di E2F1, E2F2 ed E2F3 è indotta alla fine della fase G1, mentre

sembra che E2F4 e E2F5 siano presenti in tutte le fasi. L’attività di questi fattori è inoltre

regolata dall’associazione con i membri della famiglia pRb. E2F1-2-3 sono legati in modo

specifico da pRb, mentre con poca affinità si legano a p107 e p130; sembra che la stessa cosa

accada anche con E2F4-5. Questi complessi si formano in fasi specifiche del ciclo cellulare:

p130-E2F sono presenti principalmente in cellule quiescenti o differenziate, p107-E2F in fase

S e pRb-E2F vengono espressi principalmente in fase G1 e poco in fase S.

Le proteine target che vengono legate da E2F sono essenziali nella riproduzione del DNA

(DHFR dihydrofolate reductase, DNA pol α, timidina chinasi, CDC6), nel controllo del ciclo

cellulare (ciclina E, ciclina A, CDC2, p107, pRb, c-Myc) e anche nell’apoptosi, nella

differenziazione e nelle prime fasi dello sviluppo. E2F rappresenta l’ultimo target richiesto

per una regolazione negativa da parte di pRb, inserito in una via che è frequentemente mutata

in tumori umani e che include anche le cicline D, Cdk4/Cdk6 e la classe INK4 degli inibitori

(Muller, Bracken et al. 2001).

25

Il meccanismo con cui E2F viene attivato non è conosciuto, anche se il dominio

di transattivazione di E2F1 può interagire con cAMP. CBP (c-AMP binding protein) è un co-

attivatore trascrizionale che possiede un’attività istonica acetil-transferasica che può modulare

la struttura della cromatina e di conseguenza la trascrizione genica. Ciò è dovuto al fatto che

la presenza delle acetilazioni porta ad un indebolimento dell’interazione tra DNA e

nucleosoma, rendendo il DNA più accessibile ai fattori di trascrizione.

Il meccanismo opposto, quello di inattivazione, è anch’esso importante nella regolazione del

ciclo cellulare. L’espressione costitutiva di mutanti E2F1 e DP1 causa l’accumulo delle

cellule in fase S e alla fine avvia i meccanismi apoptotici. L’inattivazione sembra mediata

dalla fosforilazione di E2F e DP, che inibiscono la capacità di legare il DNA. Sembra che la

degradazione di E2F1-4 sia mediata dall’ubiquitinizzazione, che permette una regolazione del

legame con il DNA (Harper and Brooks 2005).

L’attivazione trascrizionale di E2F è fondamentale per la progressione del ciclo cellulare

poiché l’arresto delle cellule in G1 è dovuta all’inibizione di E2F da parte di Rb; è probabile

che le proteine “pocket” siano capaci di legare e inattivare E2F in G0 e all’inizio della fase G1,

ma, a metà di questa fase, vengono fosforilate dalle Cdk, così, una volta rilasciato E2F, il

ciclo prosegue verso la fase S (Harbour and Dean 2000).

4.3. Interazione tra Rb ed E2F

Il legame di Rb e di altre proteine pocket a E2F non inibisce semplicemente l’attività di E2F:

il complesso così formato si lega a promotori di geni e ne reprime l’attivazione trascrizionale,

bloccando l’azione degli enhancer (potenziatori capaci di legare i promotori).

Le modificazioni che intervengono sulla cromatina sono uno dei più importanti meccanismi di

regolazione della trascrizione genica; possono esserci fosforilazioni, acetilazioni, metilazioni,

ecc., che si riscontrano su aa ben specifici. In questo caso, l’acetilazione fa da protagonista:

HAT (istone acetil transferasi) agisce come coattivatore trascrizionale e, interagendo con E2F,

promuove il legame di quest’ultimo al promotore, inibendo la formazione del nucleosoma; al

contrario, HDAC (istone deacetilasi) è associato con l’inibizione trascrizionale, in quanto

recluta il complesso Rb/E2F promuovente la formazione del nucleosoma sul promotore,

negando l’accesso ai fattori di trascrizione (Fig. 5). Sette HDACs sono conosciuti, ma solo tre

(HDAC1, HDAC2, HDAC3) interagiscono con Rb: quest’ultimo può legare

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