Utilizzo di E. Coli per lo svolgimento delle metodologie di base di biologia molecolare, Guide, Progetti e Ricerche di Microbiologia E Batteriologia

Scarica Utilizzo di E. Coli per lo svolgimento delle metodologie di base di biologia molecolare e più Guide, Progetti e Ricerche in PDF di Microbiologia E Batteriologia solo su Docsity! 1 Nicolas Galli – 737871 AA. 2022 – 2023 Relazione di laboratorio Università degli Studi di Brescia Facoltà di Medicina e Chirurgia-Corso di Laurea in Biotecnologie A.A. 2022-2023 C.I. di Microbiologia e Virologia Utilizzo di E. Coli per lo svolgimento delle metodologie di base di biologia molecolare ed ingegneria genetica. 2 L’attività di laboratorio del C.I. di Microbiologia e Virologia si è svolta dal 28/11/2022 al 02/12/2022, nel Laboratorio di Biotecnologie del terzo piano nell’edificio centrale dell’Università degli Studi di Brescia, sotto la supervisione delle professoresse F. Caccuri, A. Bugatti e del personale tecnico. Il mio gruppo di lavoro (gruppo 16 – 5FG) era composto dai seguenti membri: Fiorio Elia; Galli Nicolas. Lezione N.1: Nella prima giornata di laboratorio il gruppo, seguendo il protocollo, ha preparato, dopo gli opportuni calcoli stechiometrici, le soluzioni necessarie allo svolgimento di tutte le attività settimanali, ossia: • Terreno liquido LB Medium (100ml di LB Medium e 500ml di LB Medium + AGAR); • TBE 10x (250ml da diluire poi in una soluzione 1x da 1l al momento dell’utilizzo dopo essere stato autoclavato); • CaCl2 (100ml 0.1M sterilizzato per filtrazione); • Ampicillina (300mg in 3ml di H2O sterilizzata per filtrazione). In seguito, le due soluzioni LB Medium e la soluzione TBE 10x sono state sterilizzate in autoclave. Al termine della sterilizzazione si è proceduto con la preparazione di: • TBE 1X (1l); • Piastre con ampicillina (colatura di LB + AGAR, circa 25ml, in piastre Petri da 85mm). In seguito alla solidificazione dei terreni solidi LB + AGAR + ampicillina, si è proceduto con la semina dei batteri (da coltura liquida precedentemente allestita dal personale del laboratorio) su piastra. Un’aliquota di terreno liquido viene depositata vicino al bordo della piastra e, seguendo lo schema B riportato sul protocollo, si è proceduto, con l’utilizzo di un’ansa sterile, ad eseguire lo striscio. Questa tecnica consente una semina batterica non omogenea: più ci si allontana dal punto di partenza e più la concentrazione batterica cala. Personalmente ho avuto difficoltà nel mantenere l’ansa adesa al terreno solido in quanto lo schema da seguire prevedeva l’utilizzo attivo di entrambe le mani e la consistenza del terreno obbligava a mantenere una pressione costante per evitare di lacerarlo; a tal proposito il risultato atteso dalla mia semina sarà uno striscio irregolare e poco utile all’osservazione finale. È stata utilizzata una piastra per membro del gruppo. Schema rappresentativo dello striscio eseguito: 5 Le bande dei campioni di purificato sono linee nette e senza sbavature, sulle colonne non sono presenti altri DNA di peso molecolare differente (non ci sono altre bande), dunque, la purificazione ha avuto esito totalmente positivo. Dopo aver verificato la bontà della purificazione si passa quindi alla ligazione, attingendo dal campione di DNA di qualità migliore. Il processo di ligazione consiste nell’inserimento del gene per la produzione di ferritina murina (572bp) nel vettore commerciale pGEM-T Easy tramite l’attività enzimatica della DNA ligasi del batteriofago T4 in grado di saldare sia estremità piatte che estremità coesive di frammenti di DNA a doppio filamento catalizzando la formazione di legami fosfodiesterici. L’allestimento della reazione di ligazione è stato impostato seguendo le indicazioni, le quantità e le concentrazioni di reagenti forniti direttamente dall’azienda Promega. Come ultima attività della giornata di laboratorio è stato eseguito l’inoculo per la preparazione dei batteri competenti JM109: dal terreno solido si preleva una colonia batterica e si stempera in 5ml di terreno liquido LB. Il terreno è stato poi messo in incubazione una notte a 37°C. Lezione N.3: Nel corso della terza lezione sono state preparate le cellule per conferire loro una competenza artificiale (per competenza si intende la capacità di ricevere il plasmide, cosa non possibile per questo batterio senza l’intervento umano). La preparazione consiste nel metodo del calcio cloruro (CaCl2), che permette di rendere porosa la membrana batterica esterna permettendo il passaggio del DNA (si ipotizza che gli ioni Ca2+ possano mascherare la carica negativa del DNA che, altrimenti, verrebbe respinto dalla membrana carica negativamente). Le cellule batteriche utilizzate sono quelle messe in coltura il giorno precedente, inoculate in 100ml di terreno liquido, incubate e mantenute in agitazione fino al raggiungimento di un valore OD600 (densità ottica di un campione alla lunghezza d’onda di 600nm) compreso tra 0,4 e 0,5, saggiabile tramite l’utilizzo del nanodrop. Prelevati poi 20ml della sospensione ed inseriti in un tubo da 50ml preraffreddato, si è effettuata l’incubazione del suddetto campione in ghiaccio secondo i tempi e le modalità stabiliti dal protocollo. Al termine dell’incubazione è stata eseguita una doppia centrifugazione con eliminazione del surnatante e risospensione in calcio cloruro. Si ottengono quindi, dopo l’ultima risospensione, 300𝜇l di soluzione da aliquotare omogeneamente in 5 eppendorf da 1,5ml per l’utilizzo o per la conservazione. Le cellule ottenute saranno quindi competenti. A questo punto le cellule sono pronte per subire il processo di trasformazione: vengono utilizzate due eppendorf, una contenente le cellule competenti “fresche” appena aliquotate (60𝜇l) e una 6 contenente un’aliquota di pari volume di cellule congelate precedentemente preparate dal personale del laboratorio. La trasformazione avviene miscelando il volume di cellule competenti con 5𝜇l di ligazione; per fare in modo che il processo avvenisse è stato necessario svolgere una serie di incubazioni alternate in ghiaccio e in bagnetto termostatato, i cui tempi e modalità sono indicate sul protocollo. Al termine dell’incubazione le cellule trasformate sono state prelevate dal ghiaccio, addizionate con 650𝜇l di LB e incubate in agitazione a 37°C per un’ora. Infine, le cellule, dopo l’incubazione, sono state pellettate tramite centrifugazione ed eliminato il surnatante, sono state risospese in 100𝜇l di LB con l’aiuto del vortex. Dopo la risospensione le cellule sono state seminate su terreno solido LB + agar + ampicillina e incubate nel corso della notte a 37°C. Infine, è stato preparato un inoculo atto a valutare la curva di crescita batterica nel tempo: dall’inoculo del giorno precedente di cellule batteriche JM109 è stata prelevata un’aliquota di 200𝜇l diluita in 20ml di LB (diluizione 1:100). La coltura allestita è stata verificata nei seguenti intervalli di tempo: a 0’, 30’, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 24h, 32h e 48h. La verifica è avvenuta tramite lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 600nm. Lezione N.4: Per verificare la presenza del gene della ferritina nelle colonie batteriche è stato necessario effettuare uno screening. Il metodo seguito per questa verifica è quello della PCR con i primers usati per amplificare la ferritina. Ogni gruppo di lavoro ha dovuto fare lo screening di tre colonie batteriche prelevate da terreno solido seminato il giorno prima con cellule trasformate. Dopo aver fatto gli opportuni calcoli, seguendo le indicazioni presenti sul protocollo fornito, è stata preparata la mix di PCR sufficiente per l’allestimento di quattro tubi: tre contenenti le colonie da saggiare e uno di controllo negativo. Con la punta di un’ansa sterile si è prelevata una colonia batterica, inserita nel tubo già caricato con la mix della PCR e, successivamente, inserita in un tubo contenente 50𝜇l di LB. L’operazione è stata ripetuta tre volte per tre colonie differenti, per un totale di tre tubi di PCR e tre inoculi in LB. Durante l’attesa del termine della reazione di amplificazione ad opera della PCR si è proceduto con la valutazione dell’efficienza delle colonie batteriche precedentemente seminate: è necessario eseguire la conta delle colonie sviluppatesi su terreno solido ed eseguire il rapporto tra il numero delle colonie e i 𝜇g di DNA; se il risultato è ≥ a 106 allora l’efficienza è buona. L’efficienza ottenuta dal mio gruppo di lavoro è stata pari a 1,02∙106. Al termine della PCR è stato necessario verificare il prodotto della reazione tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1,2%. 7 Non avendo a disposizione un gel delle dimensioni adeguate rispetto alla capienza della vasca, si è proceduto con il taglio della lastra di gel con l’utilizzo del bisturi, prestando attenzione a non intaccarne la struttura e la superficie (avrebbe potuto causare anomalie nella corsa). Dopo il taglio, sistemato il gel e caricati i campioni, è stata effettuata la corsa elettroforetica ottenendo i seguenti risultati: La zona della fotografia evidenziata presenta, da sinistra verso destra: marcatore di peso molecolare, controllo negativo (senza banda), campione numero 1 (esito negativo), campione numero 2 e campione numero 3 (esiti positivi). Al termine della giornata, le colonie batteriche con esito positivo sono state poi inoculate in 6ml di LB + ampicillina in funzione dell’attività del giorno seguente. Lezione N.5: Nonostante fosse ragionevole pensare che la trasformazione fosse avvenuta in modo corretto, vista la presenza del gene della ferritina murina identificato tramite PCR ed elettroforesi nelle colonie di batteri trasformati, non vi era la dimostrazione che questo fosse effettivamente vero. È quindi stato necessario estrarre il DNA plasmidico dalle cellule trasformate verificate positive e verificare, tramite opportuni enzimi di restrizione, che il plasmide contenga il frammento di DNA. Nello schema seguente è raffigurato il plasmide e sono evidenziati i siti di taglio EcoRI, presenti su entrambi i lati del sito di inserzione, fondamentali per la digestione. 10 La zona evidenziata dalla fotografia presenta, da sinistra verso destra, il marcatore di peso molecolare, il prodotto della digestione, il plasmide non digerito, il prodotto della digestione (secondo campione) e il plasmide non digerito (secondo campione). La seconda e la quarta colonna, ossia le colonne del prodotto digerito, mostrano (visibile più chiaramente dal vivo) una debole banda di prodotto digerito: dunque, il DNA esogeno è presente nel plasmide ma la digestione è stata scarsa. Ciò può essere dipeso da una concentrazione troppo alta del DNA da digerire o da una scarsa quantità dell’enzima di restrizione. Con una nuova digestione, tenendo conto dei limiti della prima, si sarebbero potuti ottenere risultati migliori. Al termine della giornata, conclusa la registrazione dei dati inerenti alla crescita batterica, iniziata il terzo giorno tramite letture spettrofotometriche a intervalli di tempo stabiliti, è stato possibile tracciare la curva di crescita. I valori delle ordinate indicano i valori di assorbanza spettrofotometrica a 600nm, l’unità di misura è l’OD e ad ogni aumento pari a 0,1 OD corrisponde ad un aumento di 108 cellule/ml. Il grafico mostra chiaramente le fasi canoniche della crescita batterica: la fase iniziale ha una crescita molto debole e coincide con la fase di latenza e successivamente si ha una crescita molto importante tipica della fase esponenziale. Superando la fase esponenziale, la crescita diminuisce fino a stabilizzarsi e i batteri morti vengono rimpiazzati da nuove cellule batteriche senza una crescita effettiva. Questa fase durerà fino all’esaurimento di sostanze nutritive essenziali e alla concentrazione elevata di cataboliti tossici quando insorgerà la fase di morte. La fase di morte non è identificabile tramite lettura spettrofotometrica, in quanto i batteri ormai morti e lisati restano in sospensione influenzando l’assorbanza (non è quindi riscontrabile una netta separazione tra fase stazionaria e fase di morte). 11 Conclusioni: Il bilancio di questa esperienza di laboratorio è stato positivo: gli errori commessi dal gruppo di lavoro sono stati minimi e questo ha permesso di svolgere le attività previste dall’inizio alla fine utilizzando solamente campioni da noi prodotti. Le modalità di lavoro presenti sui protocolli forniti (sia da Promega che dal personale di laboratorio) sono sempre state seguite con attenzione. Ciò è dimostrato anche dalle osservazioni delle semine su terreno solido, risultate senza contaminazioni esterne e con un quantitativo di batteri in linea con le previsioni fatte, e degli inoculi in terreno liquido, in particolar modo il campione saggiato tramite spettrofotometria. Delle tre elettroforesi eseguite, due hanno dato esiti positivi, l’ultima invece esito incerto, probabilmente dovuto a problemi con gli enzimi deputati alla digestione (come suggerito dal personale di laboratorio). Al termine di ogni attività è stato sempre lavato o riposto adeguatamente il materiale di laboratorio, svuotato il contenitore dei rifiuti liquidi, riordinato il piano di lavoro e igienizzato con alcol etilico denaturato.