03_Krystynowicz.pdf, Notatki z Medycyna

Pobierz 03_Krystynowicz.pdf i więcej Notatki w PDF z Medycyna tylko na Docsity! ŻYWNOŚĆ 3(20)Supl„ 1999 ALINA KRYSTYNOWICZ, WOJCIECH CZAJA, STANISŁAW BIELECKI BIOSYNTEZA I MOŻLIW OŚCI WYKORZYSTANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ S t r e s z c z e n i e Produkcja celulozy bakteryjnej na skalę przemysłową jest jak dotychczas niewielka, głównie ze względu na trudności związane z wyselekcjonowaniem wysokoaktywnych szczepów, zdolnych do bio­ syntezy celulozy w warunkach hodowli wgłębnej, a także ze względu na wysokie koszty składników podłoża. Dotychczasowe badania nad biosyntezą celulozy przez Acetobacter xylinum wykazały, że polimer ten jest wydzielany na zewnątrz komórek w postaci wstążek tworzących misternie splecioną sieć, która w warunkach hodowli stacjonarnej formuje na powierzchni ciekłej pożywki galaretowatą błonę. Dzięki swoim wyjątkowym właściwościom, celuloza bakteryjna znalazła zastosowanie, szczególnie w przemyśle papierniczym, włókienniczym, spożywczym oraz w medycynie. Wstęp Wytwarzanie polimerów metodami mikrobiologicznymi oraz ich aplikacja stano­ wi jeden z głównych kierunków badań w dziedzinie biotechnologii. Spośród drobno­ ustrojów zdolnych do nadprodukcji celulozy znaczenie przemysłowe mają wyselek­ cjonowane szczepy Acetobacter xylinum [17, 25]. Bakterie te stały się modelem ba­ dawczym, który umożliwił wyjaśnienie drogi biosyntezy celulozy i jej regulacji, po­ znanie struktury polimeru oraz jego funkcji komórkowej [25, 14], Badania nad biosyntezą celulozy przez Acetobacter xylinum wykazały, że polimer ten jest wydzielany na zewnątrz komórek w postaci wstążek tworzących misternie splecioną sieć, która w warunkach hodowli stacjonarnej formuje na powierzchni cie­ kłej pożywki galaretowatą błonę o grubości dochodzącej nawet do 8 cm [18]. Z błony takiej, po oczyszczeniu i wysuszeniu, otrzymuje się produkt przypominający cienki pergaminowy papier o grubości 0,01-0,5 mm, będący prawie czystą (w około 97%), wysokokrystaliczną α -celulozą, o stopniu polimeryzacji 2000-6000 [18, 29]. Dr inż. A. Krystynowicz, mgr inż. W. Czaja, prof, dr hab. S. Bielecki, Instytut Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej, 90-924 Łodx, ul. Stefanowskiego 4/10. BIOSYNTEZA I MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ 23 Dzięki swoim wyjątkowym właściwościom, celuloza bakteryjna znalazła zasto­ sowanie, szczególnie w przemyśle papierniczym, włókienniczym, spożywczym oraz jako biomateriał w medycynie Tab. 1 [7, 15, 18, 19, 20], Tabe l a 1 Zastosowanie celulozy bakteryjnej w różnych gałęziach przemysłu. Application of bacterial cellulose in the different branches of industry. Przemysł / Industry Zastosowanie / Application przemysł spożywczy food industry • produkcja żywności niskokalorycznej (celuloza jako niskokalorycz- ny zamiennik tłuszczy), • czynnik stabilizujący zawiesiny, • wypełniacz poprawiający jakość żywności o konsystencji mazistej, • sporządzanie deserów smakowych np., filipiński „Nata de coco” • inne artykuły sporządzane przy udziale celulozy bakteryjnej jako dodatku: pasztety, tofu (serek sojowy), kamaboko (gotowana pasta rybna), nadzienie do hamburgerów i kiełbasek, • nośnik w procesach immobilizacji enzymów i komórek drobno­ ustrojów, • zastosowanie błon celulozowych jako membran do ultrafiltracji i dializy. przemysł papierniczy pulp industry • produkcja szlachetnych gatunków papieru, • konserwacja dokumentów oraz dzieł sztuki, • produkcja membran głośnikowych. medycyna medicine • zastosowanie celulozy bakteryjnej jako sztucznych organów, • zastosowanie błon celulozowych jako materiałów opatrunkowych, • produkcja różnego typu tamponów chirurgicznych, podpasek higie­ nicznych, pieluszek i innych materiałów sanitarnych. przemysł włókienniczy i chemiczny textile and chemical industry • modyfikacja za pomocą celulozy bakteryjnej typowych tkanin i dzianin syntetycznych, • surowiec do chemicznego przetwarzania na włókna celulozowe, • produkcja wysoko adsorpcyjnych materiałów służących do oczysz­ czania niektórych rodzajów ścieków przemysłowych, • produkcja niezwykle wytrzymałych kompozytów, o własnościach mechanicznych porównywalnych z własnościami tytanu. Mechanizm biosyntezy celulozy Bezpośrednim prekursorem w procesie biosyntezy celulozy jest glukoza w formie aktywnej urydynodifosforanowej pochodnej - UDPG, która w reakcji katalizowanej przez syntazę celulozową jest przenoszona na cząsteczkę primera - (P-l,4-glukozyl)n i 26 Alina Krystynowicz, Wojciech Czaja, Stanisław Bielecki Fot. 2. Błona celulozowa wytworzona w warunkach hodowli stacjonarnej. Fig. 2. Cellulose film produced in stationary culture conditions. W wyniku optymalizacji wyeliminowano nieorganiczne źródło azotu. Otrzymany wynik biosyntezy jest dotychczas najlepszy spośród publikowanych wyników uzyski­ wanych w hodowlach stacjonarnych. Pomimo tych dość obiecujących danych, sposób hodowli stacjonarnej zalicza się do metod mało wydajnych i są one zastępowane metodami wgłębnymi w fermento- rach. Generalnie należy stwierdzić, że wybór metody hodowli podyktowany jest prak­ tyczną przydatnością wytworzonego produktu, który może być np. w formie błony (Fot. 3), rurek lub pulpy. spowolnieniu. Z badań prowadzonych przez Embuscado [5] nad wpływem źródła azotu wynika, że stosowanie azotu organicznego w postaci, ekstraktu drożdżowego lub peptonu, warunkuje uzyskanie najwyższych wydajności procesu. Wpływ różnych czynników na biosyntezą celulozy bakteryjnej w warunkach stacjonarnych badali Em­ buscado i wsp. [6], stosując matematyczną metodę optymalizacji podłoża hodowlanego i warunków prowadzenia procesu, które pozwoliły na uzyskanie około 13 g celulozy/l. Ustalono następujące warunki biosyntezy celulozy: • fruktoza 24,8 g/l, • sacharoza 76,5 g/l, • ekstrakt drożdżowy 3 g/l (nie optymalizowano), • pepton 0,08% (w przeliczeniu na azot ogólny), • pH 4,49, • temperatura 29,3°C, • K2H P04 1,0 g/l, • MgS0 4 '7 H20 0,2 g/l, > (ostatnie trzy składniki nie były optymalizowane) • NaCl 0,1 g/l. } BIOSYNTEZA I MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ 27 Fot. 3. Celuloza bakteryjna w formie błony o wymiarach lm x 0,5m, wytworzona w warunkach ho­ dowli stacjonarnej w Instytucie Biochemii Technicznej PŁ. Fig. 3. Bacterial cellulose film (lm x 0,5m) produced in stationary culture in Technical Biochemistry Institute of Łódź University of Technology. Celulozę w formie rękawa otrzymali Sattler i Fiedler [26], prowadząc hodowlę bakterii Acetobacter xylinum w fermentorze poziomym, zaopatrzonym w obracający się wałek, zanurzony do połowy w podłożu hodowlanym. Polisacharyd nagromadzał się na wałku lub na szeregu współosiowych tarcz, formując po 5 dniach hodowli, mocno zżelowaną błonę o grubości 2-3 centymetrów. Proces biosyntezy celulozy może być również prowadzony metodą dwustopnio­ wą: wgłębną i stacjonarną. Okiyama i wsp. [16] pierwszy etap hodowli prowadzili w fermentorze w czasie 3 dni, po czym porcje cieczy przenosili na tace i w II etapie kontynuowali proces w warunkach stacjonarnych. Otrzymywanie celulozy bakteryjnej w formie rurek podyktowane było głównie możliwością jej wykorzystania jako zamienników takich organów, jak: tchawica, mo- czowody, jelita, naczynia limfatyczne i krwionośne [18]. Sposób otrzymywania takiej formy celulozy polegał na hodowli bakterii Acetobacter xylinum w wewnętrznej i/lub zewnętrznej części węży celofanowych, teflonowych, porcelanowych, sporządzanych z tkanych lub nietkanych materiałów, z możliwością doprowadzenia tlenu. W takich 28 Alina Krystynowicz, Wojciech Czaja, Stanisław Bielecki warunkach na powierzchni nośnika formuje się warstwa celulozy o grubości około 0,01 do 20 mm. Drugi sposób polegał na hodowli bakterii w zbiorniku, w warunkach stacjonarnych, w czasie 50 dni. Wytworzona w tym czasie błona celulozowa o grubo­ ści około 3 centymetrów, po uprzednim powleczeniu glicerolem i zamrożeniu w temp. -80°C, wykorzystana była do sporządzania rurek przy użyciu korkoboru. Trzeci sposób polegał na hodowli bakterii w przestrzeni między ściankami dwóch rurek o różnych średnicach. Otrzymano w ten sposób rurkę celulozową o średnicy wewnętrznej 2-3 mm, którą można wykorzystać jako sztuczne naczynie krwionośne. Możliwość szerszego zastosowania celulozy bakteryjnej w przemysłach chemicz­ nym, papierniczym czy włókienniczym uwarunkowana jest dostępnością i ceną. Speł­ nienie tych wymogów umożliwia produkcja polimeru w fermentorach, z wykorzysta­ niem wysokoaktywnych szczepów, zdolnych do biosyntezy celulozy w warunkach wgłębnych na tanich surowcach odpadowych [17, 30]. Hodowla wgłębna może być prowadzona metodą jednoetapową, podczas której następuje wzrost mikroorganizmów i produkcja celulozy. W metodzie tej można sto­ sować trzy sposoby prowadzenia procesu biosyntezy: okresowy, okresowy z zasila­ niem, ciągły. Metoda dwuetapowa produkcji celulozy polega na stworzeniu warunków, w I etapie dla wzrostu mikroorganizmu i w II etapie dla właściwego procesu biosyntezy. W niektórych hodowlach wgłębnych, stosowany do biosyntezy celulozy biore- aktor musi być zaopatrzony w elementy pozwalające na związanie drobnoustroju i stopniowe formowanie mikrofibryli. Udowodniono bowiem, że celuloza formuje się z dużymi trudnościami w wolnej fazie ciekłej, pozbawionej miejsc wiązania, takich jak: grzebienie, łopatki, okładziny, elementy wypełniające [17]. W pewnych przypadkach do pożywki w bioreaktorze wprowadzano różnego typu nierozpuszczalne w wodzie mikrocząstki: piasek morski, ziemię okrzemkową lub szklane kulki. Stężenie dodawa­ nych mikrocząsteczek było optymalizowane wraz ze stopniem napowietrzania. Wydaj­ ność biosyntezy celulozy w tak prowadzonym procesie, wzrosła trzykrotnie (z 1,1 do 3,6 g/l) w stosunku do wydajności celulozy uzyskiwanej w normalnych warunkach (bez obecności mikrocząstek) [30]. Ten wzrost wydajności syntezy celulozy jest we­ dług autorów rezultatem powstania wokół mikrocząstek swoistego biofilmu ograni­ czającego dopływ tlenu. Według ogólnie akceptowanej teorii Schramma i Hestrima [27] produkcja celulozy przez Acetobacter xylinum jest niezbędna dla komórek do osiągnięcia bogatej w tlen granicy faz: powietrze - pożywka. W wyżej wymienionym procesie wysokie stężenie rozpuszczonego tlenu, rzeczywiście nie doprowadziło do spadku produkcji celulozy. Konsekwentnie jednakże, rolę tlenu należy bardziej wiązać ze wzrostem syntezy kwasów ketoglukonowego i glukonowego, aniżeli z bezpośred­ nim oddziaływaniem na syntezę celulozy. Pozytywny efekt, uzyskany poprzez dodanie mikrocząstek, był więc według autorów spowodowany wytworzeniem się wokół po­ BIOSYNTEZA I MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ 31 Fot. 4. Celuloza bakteryjna w formie kuleczek wytworzona w warunkach hodowli wgłębnej. Fig. 4. The balls of bacterial cellulose produced in agitated culture. Właściwości celulozy bakteryjnej i jej praktyczne wykorzystanie Celuloza bakteryjna wytworzona w hodowli szczepów rodzaju Acetobacter cha­ rakteryzuje się wysoką czystością i w przeciwieństwie do celulozy roślinnej nie wy­ maga kosztownego i skomplikowanego procesu oczyszczania. Etapy oddzielania i oczyszczania celulozy obejmują: filtrację, wyżymanie, prze­ mywanie wodą, usunięcie komórek bakterii związanych z fibrylami celulozowymi lub na nich zaadsorbowanymi. Celulozę pozbawia się tych komórek stosując najczęściej merceryzację wodorotlenkiem sodu o stężeniu 1-4%, w temperaturze 60 do 100°C, w czasie kilku lub kilkunastu godzin, lub poprzez traktowanie kwasami organicznymi, jak np. kwasem octowym 5-8%, najlepiej w 100°C, w czasie 1 godziny [17, 18, 21]. Celuloza bakteryjna charakteryzuje się wysoką zawartością wody, w której 0,3% stanowi woda żwiązana i 98,8% - woda wolna. Woda ta jest utrzymywana w struktu­ rze celulozy dzięki słabym oddziaływaniom kapilarnym. Traktowanie celulozy lepkimi roztworami, np. alkoholami cukrowymi powoduje pęcznienie celulozy i jej zmiękcza­ nie. Tekstura tak otrzymanego produktu przypomina teksturę owoców, lub fibrylamą strukturę mięśnia. Taka forma jest wykorzystywana na Filipinach do sporządzania deserów smakowych o nazwie ,jsfata” [15]. Celulozę bakteryjną w postaci pasty zasto­ sowano jako czynnik stabilizujący zawiesiny, jako wypełniacz wzmacniający fizyczną strukturę łamliwych hydrożeli, jako wypełniacz poprawiający jakość żywności o kon­ systencji mazistej, zmniejszając ich lepkość. Celuloza może być też stosowana jako zamiennik tłuszczu oraz wypełniacz obniżający kaloryczność słodzonych produktów, np. dżemów [15]. 32 Alina Krystynowicz, Wojciech Czaja, Stanisław Bielecki Charakterystyczną właściwością celulozy bakteryjnej, różniącą ją od celulozy ro­ ślinnej jest wysoce uporządkowana struktura, utworzona przez mikrofibryle w kształ­ cie wstążki o szerokości poniżej 100 nm. Struktura niezwykle cienkich włókienek splątanych ze sobą decyduje o bardzo dobrze rozwiniętej powierzchni, umożliwiającej adsorbowanie 100 krotnej (lub więcej) ilości wody w stosunku do jej suchej masy [15]. Zdolność do wiązania wody i tworzenia wiązań z włóknami celulozowymi innego pochodzenia umożliwia zastosowanie celulozy w produkcji szlachetnych gatunków papieru. Powlekając papier zawiesiną celulozy bakteryjnej o wielkości cząstek 100— 125 μηι, w ilości 0,4-1,2%, w obecności czynnika dyspergującego, jak np. CMC, uzy­ skuje się produkt przewyższający jakością papier powlekany skrobią [22], Dodatek celulozy bakteryjnej do włókien nieorganicznych (węglowych, glino­ wych), pozwala na uzyskanie produktu o zwiększonej wytrzymałości na zrywanie [29], Impregnowanie bakteryjną celulozą materiałów hydrofobowych, jak np. poliestro­ wych, polipropylenowych, nadaje im doskonałą hydrofilowość, wysoką wytrzymałość, co stwarza możliwość ich zastosowania jako materiałów opatrunkowych [23], Właściwości błon celulozowych formowanych podczas wzrostu bakterii na po­ wierzchni ciekłych pożywek, w szczególności wysoka zawartość a-celulozy (powyżej 90%), znaczna smukłość mikrofibryli celulozowych wyrażona stosunkiem długości do średnicy wynosząca 200-500, średnica porów poniżej 3000 nm, porowatość 50-93%, wytrzymałość dynamiczna - 16-18 GPa, pozwalają na zastosowanie takich błon jako membran do ultrafiltracji i dializy [24], Dobrze rozwinięta powierzchnia, duża trwałość i wysokie zdolności adsorpcyjne celulozy bakteryjnej sprawiają, że jest ona stosowana jako nośnik do immobilizacji enzymów i komórek drobnoustrojowych. Błony celulozowe sprasowane w temp. 130°C, przyjmujące formę kartonów, sto­ sowano jako stożkowe membrany głośnikowe. Charakteryzowały się one wysokim modułem Younga - 13,6 GPa, gęstością - 1060 kg/m2, prędkością rozchodzenia się dźwięku - 3580 m/s, ostrością rezonansu - 29,2. W porównaniu z diafragmami papie­ rowymi, powyższe parametry były znacznie korzystniejsze [29], Możliwość wykorzystania celulozy bakteryjnej w medycynie, a szczególnie jako sztucznych organów, stwarzają takie jej właściwości, jak: zawartość a-celulozy o wy­ sokiej krystaliczności, wysoka wytrzymałość, bardzo dobra zgodność z żywą tkanką, a w szczególności z krwią. Opracowano sposób hodowli bakterii Acetobacter xylinum, pozwalający na wytwarzanie celulozy bakteryjnej w formie rurek o wymaganej średni­ cy. Otrzymane sztuczne naczynie krwionośne o średnicy wewnętrznej 2 do 3 mm wszczepiono psu, zastępując część aorty i żyły szyjnej. Ocena stanu przylegania skrze­ pów i prześwitu po 1 miesiącu funkcjonowania naczynia, wypadła bardzo dobrze [18]. Jak już podkreślono, błona celulozowa uformowana na powierzchni ciekłej po­ żywki w hodowli stacjonarnej, charakteryzuje się wielowarstwową strukturą zbudowa­ BIOSYNTEZA I MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ 33 ną z sieci mikrofibryli o średnicy poniżej 100 nm, wysoką zawartością wody (około 95%) w przestrzeniach między mikrofibrylami, nadającej jej właściwości żelu, czysto­ ścią (zawartość a-celulozy powyżej 95%), wytrzymałością, porowatością, elastyczno­ ścią. Ponadto błony takie, po dokładnym oczyszczeniu nie wywołują działania tok­ sycznego, alergicznego i drażniącego. Stosowane jako opatrunek, stwarzają korzystne warunki „gojenia się rany, bowiem nowe badania mechanizmu gojenia się rany wska­ zują na to, że wilgotne, a nie suche środowisko zapewnia optymalne warunki dla pro­ cesów naprawczych [12]. Podsumowanie Właściwości celulozy bakteryjnej otwierają wiele możliwości jej praktycznego wykorzystania i znajduje to ekonomiczne uzasadnienie przy wzięciu pod uwagę, że jej produkcja może być oparta na tanich surowcach odpadowych przemysłu spożywczego lub farmaceutycznego. LITERATURA [1] Brown R.M., Houghler C.H., Benziman M., White A.R., Cooper K.M.: Proc. Natl., Acac. Sci., USA, 77, 1980, 6678, [2] Brown R.M.: „Use of cellulase preparations in the cultivation and use of cellulose-producing micro­ organisms”, Patent 0258 038, 1988 [3] Calvin J.R.: Biosynthesis of cellulose, Plant Biochem., J. Priess., 3, 1980, 543, [4] Dudman W.: J. Gen. Microbiol., 21, 1959, 312, [5] Embuscado M.E., Marks J.S., BeMiller J.N.: Food Hydrocolloids, 8, 1994, 407, [6] Embuscado M.E., Marks J.S., Be Miller J.N.: Food Hydrocolloids, 8, 1994, 419, [7] Fontana J. D., de Souza A., Fontana C. K., Torriani J.L.: Appl. Biochem. Biotech., 24/25, 1990, 253, [8] Geyer U., Klemm D., Schmauder H.P.: Acta Biotechnol., 14, 1994, 261, [9] Haighler C.H.: Cellulose chemistry and its applications, Eds. Nevelí R.R., Zerionian S.H., Ellis Horwood C.H. Ltd, 1985, 151, [10] Kai A., Xu P.: Polymer J., 22, 11, 1990, 955, [11] Kent R.A., Stephens R.S., Wetsland J.A.: Food Technology, 5, 1991, 108, [12] Kleczyński S., Niedźwiecki T, Brzeziński K.: Polimery w medycynie, XY, 1, 2, 55, 1986, [13] Kudlicka K.: Postępy biologii komórek, 16, 1989, 197, [14] Lin F.C., Brown R.M., Cooper J.B., Dehner D.P.: Science, 230, 1985, 822, [15] Okiyama A., Motoki M., Yamanaka S.: Food Hydrocolloids, 6, 1993, 493, [16] Okiyama A.,Shirac H., Kano H.,Yamanaka S.: Food Hydrocolloids, 6, 1992, 471, [17] Patent PCT/FR88/00266, [18] Patent EP 0396 344 A2, 1990, [19] Patent EP 0 200 409 A2, 1986, [20] Patent WO 92/07946, 1992, [21] Patent 5, 144, 021, USA, 1992,