Pobierz 3. Enzymy i więcej Streszczenia w PDF z Systematyka tylko na Docsity!
3. Enzymy
3.1. Przykłady oznaczeń niektórych enzymów
3.1.1. Ogólne właściwości i systematyka enzymów
Enzymy — biokatalizatory wytwarzane przez komórki — przyspieszają przebieg reak
cji termodynamicznie możliwych poprzez obniżanie energii aktywacji. Szybkość re
akcji enzymatycznej (V) zależy od stężenia enzymu i substratu, stężenia aktywatorów
i inhibitorów oraz temperatury i pH. Mierzymy ją najczęściej przyrostem stężenia
produktu lub ubytkiem stężenia substratu w jednostce czasu. W warunkach optymal
nych przy nadmiarze substratu i stałym stężeniu enzymu szybkość jest wielkością
stałą, a wykres zależności szybkości od czasu odpowiada linii prostej (reakcja zero
wego rzędu). W miarę przebiegu reakcji jej szybkość z wielu powodów spada i dla
tego wyznacza się szybkość początkową reakcji (Vo) dokonując pomiaru po możliwie
krótkiej inkubacji enzymu z substratem. W takim przypadku szybkość reakcji jest
proporcjonalna do ilości enzymu i może służyć do pomiaru jego zawartości w próbce.
Enzymy należą do białek o masach cząsteczkowych w zakresie lo^-io 6 daltonów.
Niektóre z nich to białka proste zbudowane wyłącznie z aminokwasów (np. trypsy-
na); inne wymagają dla procesu katalizy składnika niebiałkowego. Enzym jako całość
nazywamy holoenzymem, jego część białkową — apoenzymem, a część niebiałkową,
uczestniczącą w reakcji — grupą prostetyczną lub koenzymem.
Klasyfikacja oraz nomenklatura enzymów są koordynowane przez Komitet No
menklaturowy Międzynarodowej Unii Biochemii i Biologii Molekularnej (z ang. NC-
IUBMB). Według przyjętych zasad, enzymy i katalizowane reakcje podzielono na
sześć klas głównych:
1. Oksydoreduktazy — katalizują odwracalne reakcje utleniania i redukcji, a więc
przemiany związane z przeniesieniem protonów i elektronów.
2. Transferazy — katalizują odwracalne reakcje przeniesienia grup funkcyjnych
z donora na akceptor.
3. Hydrolazy — katalizują nieodwracalne reakcje hydrolizy, a więc rozpadu wią
zań z jednoczesnym przyłączeniem się jednej cząsteczki wody na każde wiąza
nie ulegające rozpadowi.
4. Liazy — katalizują niehydrolityczny rozpad wiązań (bez pobrania i wydzielania
ubocznych produktów), niektóre reakcje są odwracalne.
5. Izomerazy — katalizują reakcje przekształceń strukturalnych w obrębie czą
steczki — reakcje odwracalne.
6. Ligazy czyli syntetazy — katalizują syntezę trwałych wiązań kowalencyjnych
(np. C-C, C-N, C-S, C-O) z wykorzystaniem wiązań wysokoenergetycznych
ATP.
W obrębie tych sześciu klas głównych wyróżnia się podklasy i podpodklasy, które
bliżej charakteryzują daną reakcję enzymatyczną. Zgodnie z przyjętą klasyfikacją,
każdy enzym jest charakteiyzowany przez 4 liczby, z których pierwsza oznacza przy
należność enzymu do jednej z klas głównych, druga i trzecia określają przynależność
do odpowiedniej podklasy i podpodklasy, czwarta zaś — kolejny numer enzymu
w obrębie podpodklasy. Przykładowo, trypsyna sklasyfikowana pod numerem EC
3.4.21.4, to enzym z klasy hydrolaz (cyfra 3), podklasy hydrolaz wiązań peptydowych
(cyfra 4 na drugiej pozycji), podpodkląsy endopeptydaz serynowych Qiczba 21)
i numerze porządkowym 4 (ostatnia cyfra).
Przynależność enzymu do określonej klasy głównej, a więc typ katalizowanej re
akcji oraz nazwa substratu, na który działa dany enzym, znajdują odbicie w systema
tycznym nazewnictwie enzymów. Każda nazwa złożona jest z dwóch części, z których
pierwsza określa typ katalizowanej reakcji (np. oksydoreduktaza), druga zaś wskazuje
substrat na który działa dany enzym. Nazwy systematyczne, chociaż jednoznaczne, np.
oksydoreduktaza nadtlenek wodoru : nadtlenek wodoru, są z reguły długie, a przez to
niewygodne i dlatego w dalszym ciągu często stosuje się nazwy potoczne — w tym
przypadku katalaza.
Niektóre enzymy produkowane są w formie nieaktywnej jako tzw. proenzymy
(zymogeny) np. trypsyna jako trypsynogen. Uaktywnienie proenzymów zachodzi czę
sto na drodze ograniczonej proteolizy, dzięki czemu dochodzi do uformowania się
centrum aktywnego enzymu lub jego odsłonięcia. Uaktywnienie enzymów zachodzi
pod wpływem odpowiednich aktywatorów lub też pod wpływem aktywnych już czą
steczek tego enzymu (autoaktywacja).
Niektóre enzymy występują w organizmie w kilku formach różniących się właści
wościami fizykochemicznymi. Czasem wynika to z obecności w cząsteczce enzymu do
datkowych składników obdarzonych ładunkiem, np. reszt kwasu sjalowego (mikrohe-
terogeniczność białek). Niekiedy jednak dany enzym występuje w poszczególnych
tkankach w postaci form różniących się składem aminokwasowym, powstających
w wyniku transkrypcji osobnych genów, utworzonych w wyniku duplikacji i mutacji
jednego pierwotnego genu. Te genetycznie uwarunkowane odmiany jednego enzymu
nazywamy izoenzymami. Z reguły dotyczy to enzymów oligomerycznych zbudowanych
z kilku łańcuchów polipeptydowych np. aldolazy. W niektórych przypadkach izoenzy-
my mogą reprezentować adaptację biochemiczną np. dehydrogenaza mleczanowa mię
śni szkieletowych łatwiej redukuje kwas pirogronowy niż analogiczny enzym z mięśnia
sercowego. W pewnych stanach patologicznych obraz izoenzymów surowicy krwi ulega
charakterystycznej zmianie, co może mieć znaczenie w diagnostyce klinicznej.
ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA:
- Budowa chemiczna enzymów, enzymy mono- i oligomeiyczne, kompleksy wie-
loenzymowe, definicje oraz przykłady takich pojęć jak holoenzym, apoenzym,
koenzym, grupa prostetyczna, izoenzym, proenzym, zymogen, marker enzyma
tyczny organelli komórkowych.
- Zasady klasyfikacji oraz nomenklatury enzymów.
- Ogólny mechanizm działania enzymów, podstawy termodynamiczne i kine
tyczne biokatalizy, definicja oraz znaczenie szybkości początkowej reakcji en
zymatycznej.
- Zasady wszystkich wykonywanych na ćwiczeniach oznaczeń.
3.1.3. Oznaczanie aktywności rodanazy (EC 2.8.1.1)
ZASADA:
Rodanaza (transsulfuraza tiosiarczanu) jest wygodnym enzymatycznym znacznikiem
mitochondriów wątroby. W centrum aktywnym tego enzymu znajduje się reszta cy
steiny. Rodanaza katalizuje przeniesienie atomu siarki na jon CN- zgodnie z reakcją:
Na 2 S 2 O 3 + KCN — Na 2 SO 3 + KSCN
Jon rodankowy, będący produktem reakcji, można oznaczyć ilościowo w reakcji z
jonami żelaza (III):
Enzym-SH + S 2 O 32 —> Enzym-S-SH + SO 32
CN -> SCN
Enzym-S-SH -------------------- > Enzym-SH
Fe+3 + 3 SCN’ Fe(SCN) 3
WYKONANIE:
Do zlewki o pojemności około 25 ml odmierzyć 0,5 ml rozcieńczonego (według
wskazówek asystenta) enzymu (homogenat wątroby szczura), dodać 1 ml 0,125 M
tiosiarczanu i 0,5 ml 0,2 M KH 2 PO 4 , wymieszać, a następnie ostrożnie (UWAGA:
silna trucizna!) dodać 0,5 ml 0,25 M roztworu cyjanku potasu KCN. Wymieszać po
nownie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Dodać 0,5 ml formali
ny, wytrząsnąć i dodać 2,5 ml odczynnika żelazowego. Próbkę ślepą sporządzić iden
tycznie, z tą różnicą, że formalinę (hamującą reakcję enzymatyczną poprzez dena-
turację białka) należy dodać przed KCN. Jeżeli próbki są żółte zmierzyć ich
absorbancję przy 460 nm wobec H 2 O bez rozcieńczenia. Jeżeli próbki są czerwone
rozcieńczyć je przed pomiarem absorbancji przez dodanie 25 ml destylowanej H 2 O.
UWAGA: próbki mętne (zawierające duże ilości białka) należy przesączyć przez
sączki bibułowe po rozcieńczeniu. W podanych warunkach w próbkach nierozcień-
czonych 1 pmol SCN- daje absorbancję 0,8 a w próbkach rozcieńczonych 1 pmol
SCN- daje absorbancję 0,11.
UWAGA: należy zachować dużą ostrożność przy pipetowaniu roztworu cyjanku
potasu. Użyć pipety automatycznej lub nasadki na pipetę szklaną, a próbki wylewać
do specjalnie przygotowanego naczynia zawierającego roztwór zasady, nie do zlewu!
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Obliczyć (z proporcji) ilość mikromoli produktu uwolnionego w ciągu 1 min przez
enzym zawarty w 1 ml nierozcieńczonego homogenatu wątroby szczura. Przeliczenie
takie jest w tym przypadku możliwe, bowiem z wcześniejszych doświadczeń wynika,
że w ciągu pierwszych 5 minut zachowany jest prostoliniowy charakter zależności
przyrostu stężenia produktu od czasu.
3.1.4. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.2.3)
ZASADA:
Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) katalizuje przemianę pirogronianu w mleczan
oraz reakcję odwrotną, zależnie od stężeń reagentów.
CH 3 -CO-COO" + NADH + H+ CH 3 -CHOH-COO" + NAD+
Enzym ten występuje we wszystkich komórkach, a szczególnie obficie w mięśniach
szkieletowych, wątrobie i mięśniu sercowym. LDH izolowane z różnych typów tkanek
katalizują wprawdzie identyczne reakcje, lecz enzymy te różnią się właściwościami
fizykochemicznymi, stanowiąc klasyczny przykład izoenzymów. Jedną z metod ozna
czania aktywności LDH jest metoda spektrofotometryczna. W reakcji pirogronianu
z NADH katalizowanej przez LDH dochodzi do spadku absorbancji przy 340 nm spo
wodowanego ubytkiem NADH. Forma utleniona NAD+ wykazuje pasmo absorpcyj
ne przy 260 nm, natomiast forma zredukowana posiada dodatkowe pasmo przy 340
nm. Szybkość reakcji tworzenia mleczanu i NAD+ (a tym samym aktywność enzymu)
można więc mierzyć śledząc obniżenie wartości absorbancji przy 340 nm:
próbki po 5, 10, 20, 40 i 60 min. Wszystkie próbki miareczkować 0,02 M NaOH
z mikrobiurety, w obecności fenoloftaleiny.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Uwzględniając wynik miareczkowania próby kontrolnej, wyliczyć liczbę mikromoli
uwolnionych grup aminowych po określonym czasie trawienia białka. Należy pamię
tać, że 1 ml 0,02 M NaOH użytego do miareczkowania odpowiada 20 pmolom grup
aminowych. Uzyskane wyniki przedstawić w postaci wykresu. Wykreślić styczną do
krzywej i wyznaczyć szybkość początkową Vo (patrz oznaczenie aktywności katalazy).
ODCZYNNIKI:
Homogenat wątroby szczura: wątrobę odpłukać od krwi zimnym 0,9% NaCl i pociąć
dokładnie nożyczkami. Podzielić na 5 części i homogenizować z 4 objętościami wy
chłodzonego 0,9% NaCl w homogenizatorze Potter-Elvehjema (teflon-szkło) przez
około 2 min przy 1000 obr./min. Wszystkie zabiegi wykonywać przy chłodzeniu lo
dem. Homogenat rozcieńczyć dwukrotnie i odwirować przez 10 min przy 2500 ob
r./min w wirówce K-23 w temperaturze +4°C. Osad odrzucić, a nadsącz wirować
w plastikowych probówkach w wirówce K-24 przy 8000 obr./min przez 15 min
w temperaturze 4°C. Nadsącz zamrozić w kilku porcjach.
Hemolizat krwinek czerwonych: odwirować 2,5 ml krwi pobranej do cytrynianu,
osad przemyć 2 razy 5 ml 0,9% NaCl, a następnie do osadu dodać 7,5 ml wody desty
lowanej. Wytrząsnąć i ponownie odwirować na nasadce szybkoobrotowej w celu
usunięcia błon erytrocytów.
Trypsyna (2,4 mg/ 10 ml 0,5% Na 2 CO 3 ); 0,1% bufor fosforanowy pH 7,4; 0,1 M
nadboran sodu (NaBO 2 -H 2 O 2 -3H 2 O) 1,54 g/ 100 ml, przygotować bezpośrednio przed
użyciem; 1 M H 2 SO 4 ; 0,02 M KMnO 4 ; 1% MnS0 4 ; 0,125 M tiosiarczan sodu;
0,25 M KCN; formalina (38% roztwór aldehydu mrówkowego); odczynnik żelazowy
(50 g Fe(NO 3 ) 3 -9H 2 O + 100 ml 65% HN0 3 (stężony) + woda destylowana do
500 ml). Jeżeli brak azotanu żelaza to można go zastąpić (60 g FeNH 4 (S0 4 ) 2 i2H 20
+ 100 ml 65% HN0 3 + woda destylowana do 500 ml); 0,05 M bufor fosforanowy pH
7,5 zawierający 3 mM pirogronian sodu (14,8 ml 0,05 M KH 2 PO 4 + 85,2 ml 0,05 M
Na 2 HPO 4 + 3,3 mg pirogronianu sodu); 9 mM NADH (6,3 mg NADH rozpuścić
w 1 ml 0,01 M NaOH); 0,1 M bufor maleinianowy pH 6,5; substrat do oznaczania
glukozo-6-fosfatazy: glukozo-6-fosforan (odważyć 30 mg G-6-PNa 2 i rozpuścić
w 1 ml buforu maleinianowego). Jeżeli jest dostępna tylko sól barowa G-6-P, należy
substrat przygotować następująco: do 260 mg G-6-PBa-7 H 20 w probówce wirów
kowej dodać 2 ml H 20 i 1 kroplę 1 M HC1 do rozpuszczenia. Następnie wsypać 72 mg
bezwodnego Na 2 SO 4 i powstały osad odwirować. Przelać supernatant, doprowadzić
pH do 6,5 i uzupełnić wodą do 5 ml. Przechowywać w zamrażarce. 6% TCA; 5 M
H 2 SO 4 ; 2,5% molibdenian amonu (2,5 mg molibdenianu amonu rozpuścić w 20 ml
H 2 0, przenieść do kolby miarowej na 100 ml zawierającej 5 ml 5 M H 2 SO 4 i uzupełnić
H 2 0). Roztworu nie używać po wypadnięciu osadu. 0,25% eikonogen (kwas 1-amino-
2-naftolo-4 Qub 6) sulfonowy) — (do około 90 ml wody o temperaturze 9O°C dodać
15 g Na 2 S 2 O 5 , po rozpuszczeniu dodać 25 g eikonogenu i wytrząsać do uzyskania zawie
siny. Dodać lg Na 2 SO 3 , jeżeli eikonogen się nie rozpuści, można jeszcze dodać
Na 2 SO 3 ). Przechowywać w ciemnej butelce; roztwór trwały kilka tygodni. Substrat do
oznaczania fosfatazy alkalicznej; 60% TCA; 4% roztwór żelatyny; formalina zobojęt
niona wobec fenoloftaleiny; 0,02 M roztwór NaOH.
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
Homogenizator, wirówka K-23, wirówka K-24, spektrofotometr.
3.2. Badanie kinetyki reakcji enzymatycznej 3.2.1. Wprowadzenie do kinetyki reakcji enzymatycznych
Znajomość kinetyki reakcji enzymatycznych umożliwia zrozumienie roli, jaką speł
niają enzymy w procesach metabolicznych. Według historycznych zaleceń Komisji
Enzymowej z 1961 r., jednostka standardowa enzymu (U) odpowiada takiej jego ilo
ści, która katalizuje przemianę 1 mikromola substratu w ciągu 1 min w warunkach
optymalnych (miano: pmol/min). Natomiast stopień czystości preparatów enzyma
tycznych określa aktywność właściwa, tzn. liczba jednostek standardowych przypa
dająca na 1 mg białka preparatu (U/mg). Dla maksymalnie oczyszczonych prepara
tów enzymu można wyznaczyć aktywność molekularną, tj. liczbę cząsteczek sub
stratu przekształconych w czasie 1 min przez 1 cząsteczkę enzymu w warunkach
optymalnych. Aktywność molekularną wyraża się w takich samych jednostkach co
stałą katalityczną — k<at (patrz dalej).
W 1972 r. Komisja Enzymowa wprowadziła zmiany w definicji jednostki enzyma
tycznej. Jeden katal (kat) jest to taka aktywność enzymu, która przekształca 1 mol
substratu w ciągu 1 sekundy. Jego mianem jest mol/s, a pochodnymi są mikrokatal
inanokatal. Aktywność właściwą wyraża się w mikrokatalach na kilogram białka
(pkat/kg).
Zależność między szybkością reakcji enzymatycznej a stężeniem substratu przed
stawiona graficznie ma najczęściej kształt wycinka równoramiennej hiperboli (z wy
jątkiem enzymów allosterycznych, dających często krzywe sigmoidalne):
Wykres zależności szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu
wg Michaelisa-Menten
W miarę nasycania enzymu substratem szybkość reakcji enzymatycznej zbliża się
asymptotycznie do wartości granicznej, nazywanej szybkością maksymalną (Vmax).
związane z enzymem zanim pierwszy produkt zostanie uwolniony czy też niezależnie. Kinetyka tych reakcji jest bardziej złożona aniżeli kinetyka reakcji jednosubstratowych. Inhibitorami enzymów nazywamy swoiste czynniki hamujące przebieg określonych reakcji enzymatycznych. Działanie ich może być nieodwracalne (inaktywatory enzymów) lub odwracalne, jeżeli kompleks enzym-inhibitor ma zdolność do dysocjacji. Inhibitory odwracalne mogą się wiązać w miejscu aktywnym enzymu lub poza nim. Te, które wiążą się w centrum aktywnym enzymu są nazywane inhibitorami kompetycyjnymi (współzawodniczącymi), bo konkurują z substratem o miejsce wiążące enzymu. Ich działanie ulega osłabieniu w miarę wzrostu stężenia substratu, zwiększa się zatem wartość Km, która w obecności inhibitora staje się wówczas tzw. pozorną stalą Michaelisa K„,app. Prędkość maksymalna reakcji pozostaje taka sama chociaż do jej osiągnięcia będzie oczywiście wymagana większa ilość substratu aby zniwelować działanie inhibitora. Natomiast inhibitory wiążące się z enzymem poza centrum aktywnym określa się jako niekompetycyjne (niewspółzawodniczące) lub akompetycyjne (gdy inhibitor może się wiązać wyłącznie z kompleksem enzym-substrat). Inhibicja niekompetycyjna może być czysta (gdy związanie inhibitora nie wpływa na wiązanie substratu do enzymu, rzadko występuje) lub mieszana (częstszy przypadek, gdy związanie inhibitora wpływa na siłę wiązania substratu z centrum aktywnym enzymu). W przypadku inhibicji niekompetycyjnej czystej Km pozostaje niezmienna, zmniejsza się tylko Vmax, zaś w inhibicji niekompetycyjnej mieszanej zmniejsza się wartość Vniax a rośnie lub maleje wartość pozornej stałej Michaelisa K,„w. Natomiast w inhibicji akompetycyjnej maleją zarówno Vmax jak i wartość pozornej stałej Michaelisa K™^ Graficzna ilustracja tych zależności w ujęciu Lineweavera - Burka przedstawia się następująco: Osobną klasę inhibitorów stanowią ujemne efektory allosteryczne, lecz kinetyka reakcji allosterycznych nie będzie tutaj omawiana.
ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA:
- Kinetyka reakcji enzymatycznych w ujęciu Michaelisa-Mentena oraz Linewe-
avera-Burka.
- Kinetyka hamowania reakcji enzymatycznych, typy, przykłady oraz znaczenie
fizjologiczne inhibitorów enzymatycznych.
- Arylosulfatazy - katalizowane reakcje, rola w organizmie, oznaczanie aktywno
ści.
- Zasady wszystkich wykonywanych na ćwiczeniach oznaczeń.
LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA:
- Elementy enzymologii. Witwicki J., Ardelt W. (red.), PWN, Warszawa 1984.
- Ługowska A, Tylki-Szymańska A, Arylosulfataza a efekty niedoboru. Postępy
Biochemii, 42 (1996) 284.
- Biochemistry (j. ang.). Garrett RH., Grisham CM. (red.), Belmont 2005. 3.2.2. Wyznaczanie stałej Michaelisa dla arylosulfatazy A (EC 3.1.6.1)
Arylosulfatazy są enzymami katalizującymi in vitro hydrolizę estrów siarczanowych
fenoli według reakcji:
R-O-SO3H + H 2 O -> R-OH + SO 4 ' 2 + H+
Opierając się na specyficzności substratowej, wpływie inhibitorów i lokalizacji sub-
komórkowej dokonano podziału arylosulfataz na dwa typy, I i II. Enzymy typu I wy
kazują optimum działania w środowisku obojętnym lub słabo zasadowym. Charakte
ryzuje je mała specyficzność substratowa, a ich aktywność enzymatyczna jest hamo
wana przez cyjanki. U ssaków nazwano te enzymy arylosulfatazą C i są one znacz
nikami frakcji mikrosomowej. Arylosulfatazy typu II charakteryzują się optimum
działania leżącym w zakresie kwaśnym. Hamowane są przez jony siarczanowe
i fosforanowe i cechuje je wysoka aktywność wobec siarczanu p-nitrokatecholu
(NCS). Należą do hydrolaz lizosomowych. Dzieli się je na arylosulfatazę A i B. Enzy
my te różnią się masą cząsteczkową, optimum pH i powinowactwem do substratu.
Stała Michaelisa wobec NCS jako substratu wynosi odpowiednio dla arylosulfatazy
z wątroby ludzkiej 1,54 mM, z wątroby wołowej 0,47 mM, z wątroby szczura 0,
mM. Obecność w środowisku reakcji inhibitorów kompetycyjnych sprawia, że war
tość pozornej stałej Michaelisa Kmapp podnosi się do wartości około 5-6 mM.
Arylosulfataza A jest kwaśną glikoproteiną o dużej zawartości reszt kwasu glu
taminowego i asparaginowego oraz proliny. Centrum aktywne zawiera reszty histy-
dyny oraz co najmniej dwie reszty argininy. Naturalnym substratem dla tego enzymu
jest m.in. siarczan cerebrozydu — ważny składnik mieliny. Deficyt aktywności arylo
sulfatazy A prowadzi do spichrzania siarczanu cerebrozydu głównie w mielinie
ośrodkowego układu nerwowego i nerwów obwodowych, co prowadzi do demielini-
Opisane oznaczenie wykonać dla 6 różnych stężeń substratu w zakresie od 20 do 120
mg/10 ml.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Dla każdego z użytych stężeń substratu wykreślić krzywe kinetyczne wyrażające za
leżność przyrostu stężenia produktu od czasu inkubacji. W obliczeniach przyjąć, że
w podanych warunkach 1 pmol nitrokatecholu daje absorbancję 3,2 przy 515 nm.
Znaleźć graficznie szybkości początkowe i następnie po sporządzeniu wykresu Line-
weavera-Burka wyznaczyć graficznie wartości Km i Vmax.
UWAGA: wyjściowe stężenia substratu są podane na butelkach.
ODCZYNNIKI:
Homogenat wątroby szczura, przygotowanie str. 34.
Substrat do oznaczenia arylosulfatazy A: 20, 40, 60, 80 i 120 mg siarczanu p-nitro-
katecholu w 10 ml 0,5 M buforu octanowego zawierającego 10% NaCl; 0,5 M NaOH;
0,5 M bufor octanowy pH 5,0 z 10% NaCl (100 ml 1 M CH 3 COOH + 20 g NaCl + 39
mg K4P2O7 • 3 H 2 O uzupełnić do 200 ml wodą i doprowadzić do pH 5,0 1 M NaOH).
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
Spektrofotometr lub czytnik mikropłytek 96-dołkowych; płaskodenne polistyrenowe
mikropłytki 96-dołkowe.
3.3. Hydrolazy peptydylo-peptydów. Wpływ temperatury oraz inhibitorów na aktywność enzymatyczną 3.3.1. Typy peptydaz oraz stuktura i aktywacja peptydaz serynowych
Enzymy rozszczepiające wiązania peptydowe w białkach z przyłączeniem cząsteczki
wody nazywamy peptydazami. Należą one do klasy hydrolaz (EC 3.-.-.-), podklasy
hydrolaz wiązań peptydowych (EC 3.4.-.-). W związku z ciągłym postępem badań
klasyfikacja oraz nomenklatura peptydaz często podlegają zmianom i są stosunkowo
skomplikowane. Ich podstawowymi kryteriami są: a) rodzaj aminokwasu w centrum
aktywnym enzymu, b) liczba, lokalizacja i natura aminokwasów obecnych w sąsiedz
twie trawionego wiązania, c) konformacja trawionego łańcucha polipeptydowego.
Podobnie jak w przypadku wszystkich enzymów, dla peptydaz obowiązuje nazewnic
two oparte na zaleceniach Komitetu Nomenklaturowego Międzynarodowej Unii Bio
chemii i Biologii Molekularnej (NC-IUBMB). Należy jednak wiedzieć, że niezależnie
od tej oficjalnej i zalecanej klasyfikacji, dużą liczbę enzymów proteolitycznych zgru
powano również w bazie danych peptydaz o nazwie MEROPS, która stosuje inne,
bardziej filogenetyczne kryteria klasyfikacji. W bazie MEROPS każda peptydaza jest
przyporządkowana do określonej rodziny na podstawie statystycznie znamiennych
podobieństw w sekwencji aminokwasowej enzymu. Rodziny homologiczne są na
stępnie grupowane w klany.
Peptydazy dzielimy na dwie duże grupy: egzopeptydazy, działające na pierwsze,
drugie lub trzecie wiązanie peptydowe i mogące prowadzić rekację na jednym z obu
końców trawionego łańcucha peptydowego oraz endopeptydazy (zwane dawniej pro-
teinazami), działające na dalsze niż trzecie wiązanie peptydowe wewnątrz łańcucha
polipeptydowego. Do egzopeptydaz zaliczamy obecnie 9 podpodklas (ze względu na
przemieszczanie między podpodklasami ich numeracja nie jest kolejna):
- (EC 3.4.11.-) — aminopeptydazy — uwalniające pojedyncze aminokwasy od
wolnego N-końca białka (np. aminopeptydaza leucynowa)
- (EC 3.4.13.-) — dipeptydazy — uwalniające dipeptydy od N-końca białek (np.
dipeptydaza E)
- (EC 3.4.14.-) — dipeptydylo-peptydazy oraz tripeptydylo-peptydazy — uwal
niające zarówno di- jak i tripeptydy od N-końców białek (np. dipeptydaza
I = katepsyna C, dipeptydazy II, III i IV)
- (EC 3.4.15.-) — peptydylo-dipeptydazy — uwalniające dipeptydy od C-końca
białek (np. peptydylo dipeptydaza A, zwana również kininazą II albo enzymem
konwertującym angiotensynę I)
- (EC 3.4.16.-) — karboksypeptydazy typu serynowego — uwalniają pojedyncze
aminokwasy od C-końca białek, zawierają serynę w centrum aktywnym (np.
karboksypeptydazy C i D)
- (EC 3.4.17.-) — metalokarboksypeptydazy — uwalniają pojedyncze aminokwa
sy od C-końca białek, zawierają metal (cynk) w centrum aktywnym (np. kar
boksypeptydazy A, B, E, M, T i U)
- (EC 3.4.18.-) — karboksypeptydazy typu cysternowego — uwalniają pojedyncze
aminokwasy od C-końca białek, zawierają reaktywną cysteinę w centrum ak
tywnym (np. katepsyna X)
- (EC 3.4.19.-) — omega-peptydazy — od C-końca białek uwalniają pojedyncze
aminokwasy cykliczne lub przyłączone przez wiązanie izopeptydowe (np. pep
tydazy piroglutamylowe I i II).
Natomiast endopeptydazy podzielono na 6 podpodklas:
- (EC 3.4.21.-) — endopeptydazy serynowe — zawierają reaktywną resztę seryny
w centrum aktywnym, omówiono je szczegółowo w dalszej części niniejszego
rozdziału (np. katepsyna G ludzkich neutrofili, elastaza trzustkowa, elastaza
neutrofili ludzkich, trypsyna, chymotrypsyna)
- (EC 3.4.22.-) — endopeptydazy cysternowe — zawierają reaktywną cysteinę
w centrum aktywnym (np. katepsyny B, H i L)
- (EC 3.4.23.-) — endopeptydazy aspartylowe — hydrolizują wiązania peptydo
we z wykorzystaniem dwóch reszt asparaginianu w centrum aktywnym (np.
pepsyny A i B, chymozyna, katepsyny D i E, renina)
- (EC 3.4.24.-) — metaloendopeptydazy — zawierają metal (najczęściej cynk)
w centrum aktywnym (np. stromielizyna 1 i 2, żelatynaza A i B, matrylizyna,
kolagenaza neutrofilowa, termolizyna)
- (EC 3.4.25.-) — endopeptydazy treoninowe — zawierają N-końcowe aktywne
reszty treoniny (jedynym przedstawicielem jest kompleks endopeptydaz pro-
teasomów)
- (EC 3.4.99.-) — endopeptydazy o nieznanym mechanizmie katalizy.
Endopeptydazy serynowe stanowią największą, najszerzej rozpowszechnioną, a za
razem najlepiej poznaną grupę enzymów proteolitycznych. Spełniają one kluczową
- Zasady wszystkich wykonywanych ćwiczeń.
LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA:
- Elementy enzymologii. Witwicki J., Ardelt W. (red.), PWN, Warszawa 1984. 3.3.2. Oznaczanie aktywności trypsyny na substratach białkowych
ZASADA:
Trypsyna (EC 3.4.21.4), tak jak i inne endopeptydazy, działa na substraty wielkoczą
steczkowe (np. kazeina, zdenaturowany kolagen) z wytworzeniem produktów na ogół
rozpuszczalnych w kwasie trichlorooctowym (TCA). Zawartość tych produktów w su-
pernatancie po odwirowaniu strąconego niestrawionego białka można badać np.
spektrofotometrycznie poprzez pomiar absorbancji charakterystycznej dla amino
kwasów aromatycznych (280 nm) lub przy charakterystycznej długości fali dla sub
stratów znakowanych barwnikami związanymi kowalencyjnie (np. azocoll) czy też
metodą Lowry'ego (oznacza się przyrost stężenia rozpuszczalnej w kwasie tyrozyny
lub peptydów zawierających tyrozynę).
WYKONANIE:
Rozcieńczyć trypsynę 10 razy przy pomocy 0,001 M HC1 tzn. odpipetować do ozna
czonej probówki wirówkowej typu Eppendorf 100 pi wyjściowego roztworu trypsyny
i dodać 900 pi 0,001 M HC1. UWAGA: roztwory enzymu przechowywać w lodzie!
Do 6 probówek wirówkowych odpipetować odpowiednio:
- do probówek 1 i 4 po 50 pl roboczego roztworu enzymu i 50 pl wody des tylowanej,
- do probówek 2 i 5 po 100 pl roboczego roztworu enzymu,
- do probówek 3 i 6 po 100 pl 0,001 M HC1,
a następnie do probówek 1, 2 i 3 dodać po 1,4 ml zawiesiny substratu azocoll (wstrzą
snąć przed pipetowaniem!), a do probówek 4, 5 i 6 po 1,0 ml roztworu kazeiny i pro
wadzić inkubację przez 15 min w temperaturze 37°C. Po tym czasie probówki ochło
dzić w lodzie i do probówek 4-6 dodać po 0,4 ml 20% TCA, wytrząsnąć i pozostawić
w lodzie przez 5 min, a następnie wszystkie probówki odwirować przez 2 minuty
w mikrowirówce (16 000 obr./min) i w supematancie z probówek 1-3 dokonać po
miaru absorbancji przy 520 nm na spektrofotometrze (kuweta szklana lub plastiko
wa), a w supematancie z probówek 4-6 dokonać pomiaru absorbancji przy 280 nm
na spektrofotometrze (kuweta kwarcowa) względem wody destylowanej.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Określić bezwzględne przyrosty absorbancji przez odjęcie wartości próbek ślepych
tzn. niezawierających enzymu (3 dla 1 i 2 oraz 6 dla 4 i 5). Aktywność enzymu wyra
zić w jednostkach aktywności przyjmując za jednostkę przyrost absorbancji o 0,
w warunkach doświadczenia. Porównać uzyskane wyniki i przedyskutować przydat
ność i czułość obu metod oznaczania aktywności proteolitycznej trypsyny.
ODCZYNNIKI:
Trypsyna z trzustki wołowej 2 x krystalizowana 2,4 mg w 10 ml 0,001 M HC1 (
nmoli/ml) — przechowywana w lodzie; azocoll — denaturowany kolagen znakowany
barwnikiem karminowym, 0,25% (w/o) zawiesina w 0,2 M Tris-HCl pH 8,0; kazeina
mleka — 2% (w/o) roztwór w 0,2 M buforze Tris-HCl pH 8,0; 20% (w/o) TCA (kwas
trichlorooctowy) w wodzie destylowanej (UWAGA: odczynnik silnie żrący!); 0,2 M
bufor Tris-HCl pH 8,0.
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
Pipety automatyczne 2-20 pl, 20-200 pl i 200-1000 pl; termostatowana łaźnia
wodna lub termobloki na probówki typu Eppendorf; spektrofotometr na światło wi
dzialne i ultrafioletowe; kuwety kwarcowe oraz do światła widzialnego; wirówka do
probówek typu Eppendorf.
3.3.3. Oznaczanie aktywności trypsyny na substracie syntetycznym i wpływ pH na aktywność enzymatyczną
ZASADA:
Trypsyna (EC 3.4.21.4) hydrolizuje nie tylko wiązania peptydowe w białkowych sub-
stratach naturalnych, ale i wiązania estrowe czy amidowe w substratach syntetycz
nych będących pochodnymi takich aminokwasów jak arginina czy lizyna.
Jeżeli substratem jest np. p-nitroanilid benzoilo-L-argininy (BAPNA) to po reak
cji hydrolizy uwalnia się wolna p-nitroanilina, która absorbuje światło przy 405 nm.
Tak więc przez pomiar absorbancji przy długości fali 405 nm można dokonać pomia
rów aktywności enzymatycznej trypsyny przy użyciu tego substratu syntetycznego.
WYKONANIE A (metoda tradycyjna z użyciem probówek i spektrofotometru):
a) Rozcieńczyć tiypsynę 10 razy przy pomocy 0,001 M HC1. Do 2 probówek wi
rówkowych odpipetować po 100 pl roztworu enzymu a do trzeciej 100 pl 0,001 M
HC1. Do wszystkich probówek dodać po 1 ml 0,2 M buforu Tris-HCl o pH 8,0 i po
20 pl roztworu substratu BAPNA. Wymieszać, inkubować 15 min w temperaturze
37°C a następnie przerwać reakcję enzymatyczną przez dodanie 100 pl stężonego
kwasu octowego i zmierzyć absorbancję względem wody destylowanej przy 405 nm.
b) Do siedmiu probówek wirówkowych odpipetować po 100 pl 10 razy rozcień
czonej trypsyny, a do ósmej 100 pl 0,001 M HC1. Kolejno do probówek dodać po 1 ml
buforów o pH 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 a do ostatniej 1 ml buforu o pH 7,0. Następnie do
każdej probówki dodać po 20 pl substratu BAPNA i inkubować w temperaturze 37°C
przez 15 min, a następnie do każdej probówki dodać 100 pl kwasu octowego i doko
nać pomiaru absorbancji przy 405 nm względem wody destylowanej.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Dla części a) ocenić przydatność oraz powtarzalność metody oznaczania trypsyny
z użyciem substratu syntetycznego. Dla części b) wykreślić wykres zależności aktyw
ności właściwej od pH roztworu i wyznaczyć optimum działania trypsyny dla BAPNA
jako substratu, przyjmując jako jednostkę aktywności przyrost absorbancji o 0,
w warunkach doświadczenia. Przedyskutować wynik w kontekście fizjologicznej roli
trypsyny w układzie pokarmowym. Aktywność właściwa to liczba jednostek aktywno
ści przypadająca na 1 mg enzymu.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Wykreślić zależność aktywności właściwej trypsyny od temperatury inkubacji mie
szaniny reakcyjnej. Przedyskutować wyniki.
ODCZYNNIKI:
Trypsyna z trzustki wolowej 2 x krystalizowana 2,4 mg w 10 ml 0,001 M HC
(10 nmoli/ml) — przechowywana w lodzie; 0,2 M bufor Tris-HCl pH 8,0; 25 mM
roztwór p-nitroanilidu benzoilo-L-argininy (BAPNA) w dimetylosulfotlenku (DMSO)
(11 mg/ml).
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
Pipety automatyczne 2-20 pi, 20-200 pl i 200-1000 pl; termostatowana łaźnia
wodna lub termobloki na probówki typu Eppendorf; spektrofotometr na światło wi
dzialne. 3.3.5. Miareczkowanie centrum aktywnego trypsyny przy użyciu p-nitrofenylo-p'-guanidynobenzoesanu
ZASADA:
p-Nitrofenylo-p-guanidynobenzoesan (NPGB) jest w enzymologii najpowszechniej
stosowanym odczynnikiem do miareczkowania centrum aktywnego peptydaz sery-
nowych, czyli innymi słowy do precyzyjnego określania stężenia aktywnych enzy
mów. Charakterystyczną cechą NPGB jako pseudosubstratu peptydaz serynowych
jest bowiem to, że bardzo szybko tworzy on z proteinazą kompleks enzymatyczny ES
i odszczepia pierwszy z produktów — barwny p-nitrofenol. Natomiast przejściowo
acylowany enzym ES’ ma bliską zeru stałą prędkości dysocjacji k 3 , długo pozostając
w stanie zablokowanym i pozwalając na precyzyjny spektrofotometryczny pomiar
uwolnionego w pierwszym etapie reakcji p-nitrofenolu. Znając molowy współczynnik
absorbancji p-nitrofenolu dla 402 nm (18 000 M^cm 1 ) można wyliczyć ilość aktyw
nego enzymu.
NPGB:
WYKONANIE:
a) Pomiar rzeczywistej ilości białka w roztworze enzymu:
Korzystając z następujących danych: masa cząsteczkowa trypsyny Mr = 24 000;
współczynnik absorbancji 1% roztworu trypsyny mierzony przy 280 nm w kuwecie
kwarcowej 1 cm (A1%, lcm) = 14,4 oraz dokonując pomiaru absorbancji badanego
roztworu trypsyny (rozcieńczonego 5 razy 0,001 M HC1) przy 280 nm na spektrofo
tometrze względem 0,001 M HC1 wyliczyć rzeczywiste stężenie trypsyny w roztworze.
b) Miareczkowanie centrum aktywnego enzymu:
Do kuwety spektrofotometru dodać 0,8 ml buforu i 0,2 ml 0,001 M HC1 i dokonać
zerowania spektrofotometru dla długości fali 405 nm. O czasie o dodać do kuwety
10 pl roztworu substratu równocześnie włączając stoper. Co 30 sekund (przez 3 mi
nuty) dokonywać pomiarów absorbancji przy 405 nm. W analogiczny sposób doko
nać pomiaru przy użyciu roztworu enzymu (nierozcieńcznego) zamiast HC1.
OPRACOWANIE WYNIKÓW:
Przygotować wykres zależności zmian absorbancji względem czasu i z różnicy eks-
trapolowanych wartości uzyskanych dla czasu o obliczyć (korzystając z molowego
współczynnika absorbancji p-nitrofenolu 18000 M^cnr 1 ) jego ilość uwolnioną w re
akcji. Ilość ta odpowiada ilości aktywnego enzymu użytego do miareczkowania. Wy
liczyć procent aktywnego enzymu w preparacie handlowym.
ODCZYNNIKI:
Roztwór trypsyny 5 mg w 2 ml 0,001 M HC1 przechowywany w lodzie; roztwór sub
stratu: 0,02 M p-nitrofenylo-p'-guanidynobenzoesan, 7 mg substratu w 1 ml N,N'-
dimetyloformamidu; 0,2 M bufor Tris-HCl pH 8,0.
MATERIAŁY I SPRZĘT LABORATORYJNY:
Pipety automatyczne 2-20 pl, 20-200 pl i 200-1000 pl; spektrofotometr UV/VIS;
kuwety kwarcowe, kuwety do światła widzialnego.
3.3.6. Hamowanie aktywności trypsyny przez inhibitor z nasion soi
ZASADA:
Inhibitor trypsyny z nasion soi łączy się z enzymem w stosunku molowym 1:1. Przez
inkubację stałej znanej ilości enzymu ze wzrastającą ilością inhibitora i oznaczenie
resztkowej ilości enzymu przy użyciu syntetycznego substratu można otrzymać tzw.
krzywą miareczkowania enzymu inhibitorem, a z niej wyznaczyć stosunek molowy
wiązania lub też wyliczyć rzeczywiste stężenie inhibitora (procent aktywnego inhibi
tora w preparacie handlowym).
WYKONANIE A (metoda tradycyjna z użyciem probówek i kolorymetru):
Do 6 oznakowanych probówek Eppendorf (1,5 ml) odpipetować po 100 pl roztworu
tiypsyny (0,1 nmola), a do siódmej (próba ślepa) 100 pl 0,001 M HC1. Następnie do
dać do kolejnych probówek odpowiednio po 1000, 980, 960, 940, 920, 900 i 1000 pl
0,2 M buforu Tris-HCl pH 8,0 i do pierwszych sześciu probówek po o, 20, 40, 60, 80
i 100 pl 50 razy rozcieńczonego buforem roztworu sojowego inhibitora trypsyny.
Probówki zamknąć, zawartość wymieszać, preinkubować 10 minut w temperaturze
pokojowej, a następnie do każdej próbki dodać po 20 pl substratu BAPNA, wymie
szać i inkubować 15 min w temperaturze 37°C. Reakcję przerwać przez dodanie do
każdej probówki po 100 pl kwasu octowego, po czym zmierzyć absorbancję przy 405
nm względem próby ślepej.
