Ćwiczenie 4
α-Amylaza (cz. I)
Oznaczanie aktywności enzymu
metodą kolorymetryczną
ENZYMOLOGIA
Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa
Centrum Bioimmobilizacji
i Innowacyjnych Materiałów
Opakowaniowych
ul. Klemensa Janickiego 35
71-270 Szczecin
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
α-Amylaza-oznaczanie aktywności enzymu metodą kolorymetryczną, Laboratoria z Technologia żywności i żywienia
Opisane ćwiczenie laboratoryjne do wykonania
Typologia: Laboratoria
2019/2020
1 / 6
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Dokumenty powiązane
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz α-Amylaza-oznaczanie aktywności enzymu metodą kolorymetryczną i więcej Laboratoria w PDF z Technologia żywności i żywienia tylko na Docsity!
Ćwiczenie 4
α-Amylaza (cz. I)
Oznaczanie aktywności enzymu
metodą kolorymetryczną
ENZYMOLOGIA
Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa
Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych
ul. Klemensa Janickiego 35 71 - 270 Szczecin
Ćwiczenie 4. α-Amylaza - oznaczanie aktywności enzymu metodą kolorymetryczną Oznaczanie aktywności α-amylazy metodą Streeta-Closego w modyfikacji Richtericha
Wśród hydrolaz glikozydowych rozkładających skrobię i glikogen wyróżnia się trzy główne grupy:
- α-amylazy (endoamylazy) rozszczepiające wiązania wewnątrz cząsteczek substratu w sposób przypadkowy, występujące powszechnie u roślin, zwierząt i mikroorganizmów, 2 ) β-amylazy (egzoamylazy) hydrolizujące co drugie wiązanie od nieredukującego końca substratu, rozpowszechnione u roślin wyższych; brak ich u zwierząt,
- glukoamylazy (egzoamylazy), hydrolizujące kolejno każde wiązanie od nieredukującego końca substratu, występujące u roślin, zwierząt i mikroorganizmów. α-Amylaza (EC 3.2.1.-) jest jednym z głównych enzymów trawiennych. Hydrolizuje wiązania α (1→4) w skrobi i glikogenie. Produktami jej działania są maltoza, maltotrioza, glukoza, a w przypadku hydrolizy amylopektyny, także krótkie, rozgałęzione α-dekstryny (wiązanie α (1→6) obecne w amylopektynie nie jest hydrolizowane przez α-amylazę). Aktywatorami amylazy są jony chlorkowe; inhibitorami: jony jodkowe, cytrynian, szczawian i chelatory jonów dwuwartościowych (np. wersenian). Amylaza zawarta w ślinie ma niewielkie znaczenie dla całkowitego procesu trawienia cukrów złożonych, gdyż jej działanie jest krótkotrwałe — traci aktywność pod wpływem kwaśnego środowiska żołądka. U wielu zwierząt amylaza w ogóle nie występuje w ślinie. Znacznie istotniejsze jest działanie amylazy trzustkowej. Enzym ten ma niewielką masę cząsteczkową (45000 D) i może w niewielkim stopniu ulegać resorpcji z soku trzustkowego do krwi a następnie przechodzić łatwo do moczu. Niewielka aktywność α-amylazy obecna w surowicy ludzi zdrowych (0.1-0.3 U/ml) może ulec znacznemu wzrostowi w przypadku niektórych schorzeń jak np. w ostrym zapaleniu trzustki lub przy zamknięciu przewodów trzustkowych przez nowotwór. Obniżona aktywność amylazy w surowicy może świadczyć o zapaleniu wątroby lub niewydolności trzustki. W tych stanach chorobowych, w których dochodzi do niedoboru enzymów trawiennych, pomaga się pacjentom stosując leki, zawierające skoncentrowane wyciągi z trzustki zwierzęcej, lub zestaw oczyszczonych z różnych źródeł enzymów hydrolitycznych. Jednym z takich leków jest Kreon. Jedna kapsułka tego leku zawiera (oprócz innych hydrolaz) α-amylazę o aktywności 8000 U. Jednostki enzymatyczne. Aktywność enzymatyczną można wyrazić na wiele sposobów. Najpowszechniejsze jest podawanie początkowej szybkości (Vo) katalizowanej reakcji (np. w
Część doświadczalna Ćwiczenie 4. α-Amylaza – oznaczanie aktywności enzymu metodą kolorymetryczną Oznaczanie aktywności α-amylazy metodą Streeta-Closego w modyfikacji Richtericha
Oznaczenie aktywności amylazy trzustkowej w preparacie leku Kreon ODCZYNNIKI: α-amylaza - preparat wyjściowy enzymu do oznaczenia aktywności α-amylazy został przygotowany przez rozpuszczenie 1 kapsułki leku Kreon w 100 ml 0.05 M buforu fosforanowego o pH 7.4. 0.05 M bufor fosforanowy o pH 7.4, 0.05 M bufor fosforanowy o pH 7.4 zawierający NaCl, 1% kleik skrobiowy, roztwór jodu w jodku potasu, 0.5 M HC1.
WYKONANIE:
- Przygotuj 6 rozcieńczeń -amylazy (preparatu leku Kreon): I. 7 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (15-krotne rozcieńczenie) II. 9,5 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (20-krotne rozcieńczenie) III. 12 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (25-krotne rozcieńczenie) IV. 14,5 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (30-krotne rozcieńczenie) V. 17 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (35-krotne rozcieńczenie) VI. 19,5 ml buforu fosforanowego + 0,5 ml amylazy (40-krotne rozcieńczenie)
- Przygotuj 40 ml zbuforowanego roztworu substratu przez zmieszanie 20 ml roztworu skrobi i 20 ml buforu fosforanowego zawierającego NaCl.
- Do nowych 7 probówek odmierz po 4 ml przygotowanego w punkcie 2 roztworu substratu.
- Do probówki nr 1 dodaj 1 ml 0,5M HCl (próbka kontrolna, K).
- Probówki (7 sztuk) wstaw do łaźni wodnej (37oC) i inkubuj przez 3 minuty.
- Po tym czasie wyjmij probówki z łaźni i szybko dodaj do nich kolejno:
Probówka nr 1 (K): 1 ml buforu fosforanowego, Probówka nr 2 (B 1 ): 1 ml rozcieńczenia I , Probówka nr 3 (B 2 ): 1 ml rozcieńczenia II , Probówka nr 4 (B 3 ): 1 ml rozcieńczenia III , Probówka nr 5 (B 4 ): 1 ml rozcieńczenia IV , Probówka nr 6 (B 5 ): 1 ml rozcieńczenia V , Probówka nr 7 (B 6 ): 1 ml rozcieńczenia VI.
- Zawartość probówek wymieszaj, wstaw ponownie do łaźni wodnej (37oC) i inkubuj przez 15 min.
- Po zakończonej inkubacji do probówek nr 2-7 dodaj po 1 ml 0.5M HCl, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
- Do wszystkich probówek odmierz po 1 ml roztworu I 2 w KI i wymieszaj zawartość probówek.
- Barwa roztworów powinna być niebieska i powinna różnić się w niewielkim stopniu intensywnością. Jeśli przy najwyższych użytych stężeniach enzymu barwa roztworu jest czerwonawa lub żółtawa, należy te próbki odrzucić i nie brać ich pod uwagę przy obliczeniach aktywności enzymatycznej -amylazy.
- Zmierz absorbancję próbek względem wody przy długości fali λ=620 nm.
OPRACOWANIE WYNIKÓW: Efektem końcowym ćwiczenia jest oznaczenia aktywności enzymu w jednej kapsułce leku Kreon.
- Aktywność α-amylazy zdefiniujmy jako ilość μmoli zhydrolizowanych wiązań glikozydowych w czasie 1 min. w warunkach optymalnych (pH, temperatura, wysycenie substratem, obecność jonów chlorkowych). W tym doświadczeniu oznaczamy ją mierząc kolorymetrycznie ubytek substratu. Należy więc określić jakiemu stężeniu substratu (a więc jakiemu stężeniu wiązań glikozydowych) odpowiada absorbancja (A 620 ) próby kontrolnej. Stężenie wiązań glikozydowych obliczamy dzieląc masę (g) skrobi znajdującą się w 1 l roztworu przez masę cząsteczkową monomeru (C 6 H 10 O 5 = 162 g).