Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
włosowych, gronkowcowy zespół oparzonej skóry) oraz zakażenia ran pooperacyjnych. Gronkowce te mogą wywoływać także zakażenia układowe i narządowe np.
Typologia: Egzaminy
1 / 73
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Praca wykonana w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Niniejsza praca była częściowo finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego
w Warszawie (Grant nr N N401 004637)
Koleżankom i Kolegom Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
dziękuję za wsparcie i życzliwość w trakcie realizacji niniejszej pracy
Gronkowiec złocisty S. aureus należy do najczęstszych gatunków bakterii wywołujących zakażenia szpitalne i pozaszpitalne. Dobrze znana jest zdolność wywoływania pozaszpitalnych zakażeń przewlekłych przez S. aureus , najczęściej przewlekłych ropnych chorób skóry lub przewlekłych zapaleń górnych dróg oddechowych. Antybiotykoterapia tych stanów zapalnych jest często nieskuteczna, występują nawroty choroby, związane z przetrwałym zakażeniem S. aureus. Chorobotwórczość tego patogenu jest determinowana wytwarzaniem wielu czynników wirulencji, które podlegają kontroli u S. aureus przez system globalnej regulacji genów – agr (accessory gene regulator). Na podstawie polimorfizmu genów agr wyróżnia się 4 główne grupy specyficzności systemu agr: agr I, agr II, agr II, agr IV [40]. Jednocześnie bada się ich związek z typem choroby wywoływanej przez S. aureus.
Nadal brak jest danych w zakresie roli reakcji odpornościowej w patogenezie przewlekłych zakażeń gronkowcowych. Bardzo istotną rolę w przeciwdrobnoustrojowej reakcji odpornościowej spełnia odpowiedź cytokinowa limfocytów Th oraz monocytów/makrofagów.
Ryc. 1. Odpowiedź cytokinowa indukowana antygenami patogenów [22, 107].
1.1. Staphylococcus aureus 1.1.1. Charakterystyka Staphylococcus aureus
Gronkowce mają kształt kulisty, o średnicy 0,8-1 um. Są to ziarenkowce układające się (zwłaszcza w hodowli na podłożach stałych) w charakterystyczne, nieregularne skupienia przypominające winne grona — stąd nazwa gronkowce. W środowiskach naturalnych i w podłożach płynnych często występują pojedynczo, w postaci dwoinek, czworaczków lub krótkich łańcuszków. Barwią się Gram-dodatnio. Nie wytwarzają zarodników i nie wykazują ruchu; niektóre szczepy wytwarzają otoczki [35].
Gronkowce rosną na podłożach zwykłych w temperaturze 6,5-46°C przy pH 4,2-9,3. Optymalna temperatura wzrostu wynosi 30 – 37°C, optymalne pH 7,0 – 7,5. Są względnymi beztlenowcami, jednak lepiej rosną w warunkach tlenowych. W bulionie tworzą jednolite zmętnienie i osad na dnie. Na agarze w ciągu 24h powstają kolonie o średnicy 1-3 mm, okrągłe, wypukłe, gładkie, błyszczące, wilgotne, zwykle zabarwione na kolor złocisty, pomarańczowy lub żółty. Zabarwienie nie zawsze występuje, czasami kolonie są białe. Wytwarzanie barwnika zależy od składu podłoża i warunków hodowli [50].
Gronkowce (zwłaszcza szczepy chorobotwórcze) cechuje wysoka aktywność biochemiczna dzięki wytwarzanym przez nie enzymom. Na agarze z krwią niektóre szczepy wywołują hemolizę beta. Wykazują dużą odporność na działanie różnych czynników fizycznych i chemicznych. Rosną w podłożach z dodatkiem 40% żółci i 15% NaCl.
Są wytrzymałe na wysychanie; mogą przeżyć wiele tygodni poza ustrojem, zwłaszcza w obecności białka, np. w wyschniętej ropie na pościeli, w kurzu i w innych miejscach, do których nie dochodzą promienie słoneczne [50].
Po raz pierwszy gronkowiec złocisty ( Staphylococcus aureus ) został wykryty przez Pasteura w 1880 roku w materiale ropnym, a wyhodowany z czystej hodowli oraz bliżej opisany jako gronkowiec ropny przez Rosenbacha w 1884 roku, a także jako Micrococcus pemphigi neonatorum przez Winternitza w 1889roku [114].
Spośród ponad 40 gatunków wchodzących w skład rodzaju Staphylococcus , za najważniejszy uznawany jest Staphylococcus aureus. Gatunek ten powoduje częste infekcje bakteryjne zarówno ludzi jak i zwierząt [35].
Wśród czynników warunkujących inwazyjność S. aureus występują także białka powierzchniowe pełniące ważną rolę w adhezji do komórek gospodarza. S. aureus wytwarza również proteiny wiążące się z białkami i komórkami krwi (białko A, clumping factor CF), co sprzyja blokowaniu odpowiedzi immunologicznej oraz odgrywa ważną rolę w inicjacji i / lub nasileniu zapalenia [38, 99].
1.1.2. Chorobotwórczość Staphylococcus aureus
Częstość występowania, nasilenie i czas trwania infekcji gronkowcowych rosną za sprawą nosicielstwa gronkowców (głównie na śluzówkach nosa) wśród pacjentów i personelu medycznego. Drobnoustroje rozprzestrzeniają się głównie drogą kropelkową, rzadziej przez zakażone powietrze, kurz i przedmioty [113].
Gronkowce złociste są czynnikiem etiologicznym wielu schorzeń. Zakażenia dotyczą przede wszystkim skóry i tkanek podskórnych, zwykle z udziałem procesu ropnego [5] (czyraki, trądzik, jęczmień, liszajec zakaźny, zastrzał, róża, cellulitis , zapalenie mieszków włosowych, gronkowcowy zespół oparzonej skóry) oraz zakażenia ran pooperacyjnych. Gronkowce te mogą wywoływać także zakażenia układowe i narządowe np. zakażenia układu oddechowego, w tym zapalenie płuc, zapalenie oskrzeli, opłucnej, płuc, ucha środkowego, zatok obocznych nosa, gardła i migdałków, zapalenie opon mózgowo- rdzeniowych, ropnie mózgu, zapalenie szpiku kostnego i kości, zakażenia układu moczowego, zapalenie mięśnia sercowego oraz zakażenia lub zatrucia związane z wytwarzaniem przez te bakterie określonych toksyn: zespół wstrząsu toksycznego, zespół oparzonej skóry. U osób z obniżoną odpornością, u pacjentów leczonych z powodu innych chorób, a także po zabiegach chirurgicznych zakażenie gronkowcowe może przejść w postać uogólnionej posocznicy [17, 29]. Gronkowcowe zatrucia pokarmowe, których źródłem są produkty żywnościowe zanieczyszczone szczepami enterotoksycznymi charakteryzują się krótkim okresem wylęgania (od 1 do 5 godzin). Zanieczyszczenia mogą mieć charakter pierwotny, np. mięso zwierząt z gronkowcowym uogólnionym procesem ropnym lub mleko zwierząt chorych na gronkowcowe zapalenie wymienia. Najczęściej jednak dochodzi do wtórnego zakażenia produktów żywnościowych od ludzi chorych z zakażeniami ropnymi skóry lub od nosicieli gronkowców zatrudnionych w przemyśle spożywczym. Gronkowcowe zatrucia pokarmowe często występują w formie epidemii.
S. aureus jest zdolny do łatwego nabywania oporności na antybiotyki. Cecha ta jest kodowana chromosomalnie lub wiąże się z obecnością w komórce plazmidu niosącego geny oporności. Obecnie coraz częściej obserwuje się występowanie szczepów wielolekoopornych, co utrudnia skuteczne leczenie infekcji gronkowcowych.
Wprowadzenie każdego nowego antybiotyku do leczenia zakażeń gronkowcowych jak dotąd zawsze po dłuższym lub krótszym czasie prowadziło do selekcji szczepów opornych. Już w niedługim czasie po zastosowaniu w lecznictwie penicylin zaobserwowano występowanie szczepów opornych wytwarzających penicylinazę - enzym hydrolizujący penicyliny. Rozprzestrzenianie się tej oporności wśród szczepów jest bardzo szybkie ze względu na kodowanie jej przez geny plazmidowe. Dziś wiadomo, że ponad 90% szczepów S. aureus izolowanych od chorych hospitalizowanych jest niewrażliwych na działanie penicylin naturalnych, aminopenicylin oraz ureidopenicylin. Wobec tych szczepów mogą być skuteczne cefalosporyny, penicyliny oporne na działanie β-laktamaz np. penicyliny izoksazolylowe, oraz połączenia penicylin z inhibitorami β-laktamaz [34]. Są to szczepy wrażliwe na metycylinę – MSSA.
W 1961 roku wykryto po raz pierwszy gronkowce złociste oporne na metycylinę, tj. gronkowce MRSA charakteryzujące się opornością na wszystkie antybiotyki β – laktamowe [52]. Oporność ta ma charakter receptorowy i jest kodowana przez gen mec A, który jest zlokalizowany na chromosomie i stanowi część regionu noszącego nazwę SCCmec (gronkowcowa kaseta chromosomalna mec, ang. staphylococcocal cassette chromosome mec ). Nabywanie metycylinooporności przez szczepy gronkowca złocistego ma związek z rozprzestrzenianiem się chromosomalnych kaset SCC mec zaliczanych do tzw. wysp genomowych [48, 56]. Gen mec A warunkuje syntezę nowego białka PBP (ang. Penicylin Binding Protein), tzw. PBP2’ lub PBP2a. W odróżnieniu od pozostałych białek PBP, białko PBP2a nie ulega hamowaniu przez antybiotyki β-laktamowe z powodu obniżonego powinowactwa do tych antybiotyków. Białko PBP2a zachowuje swoją funkcję enzymatyczną i uczestniczy w syntezie ściany komórkowej, ale jego ekspresja zachodzi tylko w obecności β-laktamu. Oporność na meticylinę może mieć charakter homogenny, gdy wszystkie komórki danej populacji gronkowca oznaczane w badaniach in vitro wykazują fenotyp oporności lub heterogenny, gdy tylko cześć komórek danej populacji wykazuje fenotyp oporności [10, 12, 80]. Zarówno szczepy o homogennej jak i heterogennej oporności na meticylinę są klinicznie oporne na wszystkie antybiotyki β - laktamowe.
W 1996 roku w Japonii pojawiły się pierwsze szczepy MRSA o średniej oporności na wankomycynę VISA – vancomycin intermediate S. aureus [18, 45]. Mechanizm oporności wynika z pogrubienia ściany komórkowej (zwiększona synteza prekursorów peptydoglikanu) jednocześnie występuje niska aktywność enzymów autolitycznych (mutacje w genie regulatorowym agr) co skutkuje większą zjadliwością. Szczepy VISA zidentyfikowano również w Polsce [63].
Opisano również gronkowce oporne na wankomycynę (VRSA) [71], linezolid, chinupristynę/ dalfopristynę oraz daptomycynę [43, 92, 101, 109, 112].
1.1.3. Diagnostyka zakażeń Staphylococcus aureus
Hodowla pobranego materiału w temp. 37°C przez 18 – 24h na podłożu wybiórczo
Fot. 2. Wzrost S. aureus na agarze z krwią.
Fot. 3. Wzrost S. aureus na podłożu Chapmana.
W preparatach wykonywanych z hodowli, barwionych metodą Grama można stwierdzić obecność barwiących się Gram - dodatnio ziarniaków układających się w grona (Fot. 4 ). Nie jest jednak możliwe odróżnienie gatunków saprofitycznych od chorobotwórczych ( Staphylococcus aureus) [103].
Fot. 4. S. aureus preparat barwiony metodą Grama.
Test na katalazę wykonuje się na szkiełku podstawowym nanosząc kroplę soli fizjologicznej, zawiesza się w niej szczep badany, następnie dodaje się wodę utlenioną. Pojawiające się pęcherzyki oznaczają, że szczep ten jest katalazo - dodatni. Próba na obecność koagulazy związanej ze ścianą komórkową tzw. Clumping Factor (CF), który ścina fibrynogen bez udziału aktywatora, dlatego test na obecność CF daje natychmiastowe wyniki. Rutynowo wykonywany jest w wersji szkiełkowej, mieszając osocze królicze z wodną zawiesiną bakterii (Fot. 5). W przypadku Staphylococcus aureus
Dla identyfikacji gatunku stosuje się biochemiczne test komercyjne np. Api ID 32 Staph (bioMerieux) (Fot. 7) lub automatyczne systemy identyfikacji typu Vitek System [104].
Fot. 7. Api ID 32 Staph (bioMerieux).
Molekularne metody identyfikacji przy użyciu gatunkowo specyficznego PCR służą również badaniom epidemiologicznym [104].
Szczepy MRSA identyfikuje się oznaczając wrażliwość na cefoksytynę metodą dyfuzyjno-krążkową lub oznacza się wrażliwość na oksacylinę na podłożu Muller – Hinton agar (MHA). Stosowana jest metoda mikrorozcieńczeń w bulionie [74] lub metoda dyfuzji z paska zawierającego gradient antybiotyku [31, 118]. Pomocny może być również test aglutynacji lateksu np. Slidex MRSA Detection (bioMerieux) (Fot. 8) wykrywający białko PBP2a, produkt genu mecA warunkującego oporność na meticylinę [85].
Fot. 8. Slidex MRSA Detection (bioMerieux), aglutynacja lateksu.
Jednak wykrywanie obecności genu mecA metoda PCR jest nadal uznawane za ”złoty standard” i powinno być wykonywane w przypadku uzyskania niejednoznacznych wyników w metodach fenotypowych [118].
1.2. Charakterystyka systemu globalnej regulacji genów agr (accessory gene regulator) Obecnie znany jest system globalnej regulacji genów agr , kontrolujący wytwarzanie czynników wirulencji u szczepów S. aureus. Zdolność bakterii do wywoływania różnorodnych stanów chorobowych przypisywana jest imponującej ilości zewnątrzkomórkowych oraz powierzchniowych czynników wirulencji produkowanych przez te mikroorganizmy. Ekspresja czynników wirulencji jest skoordynowana i kontrolowana przez system regulacji agr [21]. Locus agr kontroluje między innymi wytwarzanie enterotoksyn, toksyny TSST-1, eksfoliatyn A i B, leukocydyny Panton Valentin, hemolizyn: α, β, γ, δ, białek powierzchniowych: wiążących kolagen, fibrynogen, fibronektynę [13]. Locus agr jest związany z czterema genami agr A, agr B, agr C, agr D, genem hld oraz zawiera dwie jednostki transkrypcyjne RNA II i RNA III znajdujące się pod kontrolą promotorów P2 i P3 [13]. Aktywacja promotora P3 uruchamia transkrypcję RNA III, który jest cząsteczką efektorową systemu agr [40].
Ryc. 3. Zmodyfikowany schemat funkcjonowania systemu agr u Staphylococcus aureus [49, 52, 72].
Cząsteczką sygnałową jest białko Agr D, które przy udziale cząsteczki Agr B [52], będącej transbłonowym białkiem ulega modyfikacji i przekształceniu do cząsteczki autoinduktora AIP (autoinducing peptide). Następnie cząsteczka AIP aktywuje cząsteczkę sensorową Agr C, co prowadzi do fosforylacji i aktywacji białka Agr A, będącego cząsteczką efektorową. Białko Agr A poprzez oddziaływanie na transkrypt RNA III reguluje ekspresję genów wirulencji S. aureus [4].
wydzielanie IL-10 jest TNF-α. IL-10 wykazuje w szerokim zakresie zdolność osłabiania odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego i hamowania odpowiedzi zapalnej. Działając na makrofagi i monocyty powoduje zmniejszenie syntezy TNF-α, IL-1, IL -6, IL -8, IL -12 i czynników wzrostowych [47]. Hamuje powstawanie limfocytów Th pobudzonych przez antygen i wytwarzanie przez nie IFN-γ i IL-2. Obecność IL- w surowicy krwi obwodowej ma istotne znaczenie dla proliferacji i różnicowania aktywowanych limfocytów B, limfocytów Tc i dla aktywacji komórek NK [57]. IL- blokuje także wydzielanie prozapalnych mediatorów przez pobudzone lipopolisacharydem (LPS) eozynofile i komórki tuczne [76].
Interleukina 17A (IL−17A) jest prozapalną cytokiną wytwarzaną przez aktywowane limfocyty CD4+, której receptor jest obecny na różnych typach komórek. IL−17 oddziałuje plejotropowo na wiele komórek, m.in. na neutrofile, makrofagi, fibroblasty, komórki endo− i mezotelium. IL−17 wydaje się pełnić rolę mediatora odpowiedzi zapalnej w następstwie aktywacji limfocytów T i jest związana z niektórymi schorzeniami o podłożu zapalnym, autoimmunologicznym i nowotworowym [60]. Istnieje dodatnia korelacja między stężeniem IL−17 a zaawansowaniem procesu zapalnego. IL – 17 wykazuje zdolności do indukcji ekspresji wielu mediatorów reakcji zapalnej, poprzez udział w proliferacji, dojrzewaniu i chemotaksji neutrofili [68, 115].
Czynnik martwicy nowotworów - α (TNF-α) jest wytwarzany głównie przez makrofagi. Może być też syntetyzowany przez komórki cytotoksyczne NK, komórki tuczne i komórki niektórych linii nowotworowych. Cytokina ta ma zdolność nekrotyzacji komórek nowotworowych, ma właściwości immunomodulujące oraz odgrywa istotną rolę w zapaleniu i wstrząsie septycznym [90]. TNF-α wykazuje wysoki stopień aktywności prozapalnej, często związany z IL-1 [94]. Zwiększa właściwości fagocytarne neutrofili oraz przyspiesza ich uwalnianie ze szpiku kostnego. TNF-α wraz z IFN-γ indukuje ekspresję cząsteczek MHC (główny układ zgodności tkankowej). Ponieważ receptory dla TNF-α są obecne na wielu komórkach, posiada on wiele biologicznych właściwości. Między innymi może stymulować powstawanie fibroblastów i osteoklastów (komórek kościogubnych), angiogenezę (powstawanie nowych naczyń krwionośnych) oraz podnosić temperaturę ciała. Ze względu na swoje właściwości biologiczne TNF ma szerokie zastosowanie w leczeniu wielu schorzeń i chorób.
Interleukina-1β (IL-1β) jest cytokiną wytwarzaną głównie przez aktywowane monocyty i makrofagi. Najbardziej aktywną formą IL - 1β jest jej rozszczepiona, dojrzała forma powstająca pod wpływem działania swoistej proteazy cysteinowej (enzym konwertujący IL-1) [19]. IL-1 jest określana jako czynnik aktywujący limfocyty. Receptory dla tej cytokiny stwierdzono na spoczynkowych limfocytach T i B, fibroblastach, keratynocytach, komórkach śródbłonka i hepatocytach. IL-1 jest kostymulatorem limfocytów T nasilając wytwarzanie IL-2. IL-1 działa stymulująco na układ krwiotwórczy indukując wytwarzanie krwiotwórczych czynników wzrostowych oraz TNF, IL-2 i IL-6 [26]. IL-1β działa synergistycznie z czynnikami stymulującymi proliferację i różnicowanie limfocytów B oraz wytwarzanie przez nie przeciwciał.
Interleukina 12 (IL-12) jest produkowana głównie przez monocyty, makrofagi, komórki dendrytyczne i limfocyty B. IL-12 zbudowana jest z 4 helis alfa, jest ona heterodimerem złożonym z dwóch podjednostek: p40 i p35. IL-12 inicjuje różnicowanie limfocytów T w kierunku Th1 lub limfocytów Th2. IL-12 jest kluczowym induktorem Th1- zależnej odpowiedzi zapalne, chroni przed zakażeniem i nowotworami, ale również bierze udział w autoimmunologicznej destrukcji tkanki [54]. Ponadto IL-12 wpływa na proliferację, cytotoksyczność limfocytów T i komórek NK, aktywuje limfocyty i komórki NK do produkcji INF-γ i TNF-α [25]. IL-12 pobudza wydzielanie IgG oraz hamuje wydzielanie IgE, a w warunkach in vitro jest odpowiedzialna za niektóre procesy krwiotworzenia.
Transformujący czynnik wzrostu-β1 (TGF-β1) który wytwarzają komórki dendrytyczne, leukocyty i komórki NK, a ludzki gen odpowiedzialny za tworzenie tej cytokiny jest umiejscowiony na chromosomie 19 [46, 62, 66]. Działanie TGF-β1 polega na wspomaganiu procesów mających na celu regenerację uszkodzeń pourazowych bądź chorobowych. Druga podstawowa aktywność biologiczna TGF-β1 to działanie immunomodulacyjne [67]. Jest jednym z głównych czynników immunosupresyjnych blokujących oba typy odpowiedzi immunologicznej: komórkowej (Th1) i humoralnej (Th2), poprzez zahamowanie różnicowania limfocytów T oraz blokowania produkcji wielu cytokin [14]. Znosi działanie TNF-α. Stwierdzono, że TGF-β 1 wpływa immunosupresyjnie na limfocyty T i B, a brak tej cytokiny może predysponować do częstszego ujawniania się schorzeń z autoagresji, takich jak toczeń układowy czy sklerodermia układowa [16, 62, 79]. TGF-β1 odgrywa również rolę w patogenezie astmy oskrzelowej [66, 79, 98], stanów zapalnych naczyń, miażdżycy [ 32 ] oraz marskości
