Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
spotykane uważa się α-helisę oraz β-kartkę, które zostały opisane już kilkanaście ... struktura β-kartkowa, która swoim pofałdowaniem przypomina harmonijkę ...
Typologia: Prezentacje
1 / 137
Pobierz cały dokument
poprzez zakup abonamentu Premium
i zdobądź brakujące punkty w ciągu 48 godzin
Praca doktorska zrealizowana pod kierunkiem dr hab., prof. UW Wojciecha Dzwolaka na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego w Pracowni Oddziaływań Międzymolekularnych
Warszawa, 2018
AD – choroba Alzheimera
AFM – mikroskopia sił atomowych
AG – aparat Golgiego
ANS – kwas 8-anilino-1-naftalenosulfonowy
BSE – zwyrodnienie mózgu bydła
CD – dichroizm kołowy
EDC – 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid
ER – endoplazmatyczne retikulum
F – stan natywny białka
FT-IR – spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera
HD – choroba Huntingtona
ICD – indukowany dichroizm kołowy
MG – stan stopionej globuli
ORD – dyspersja skręcalności optycznej
PDGA – kwas poli-D-glutaminowy
PLGA – kwas poli-L-glutaminowy
PLL – poli-L-lizyna
PolyQ – poli-L-glutamina
RC – konformacja kłębka statystycznego
SEM – skaningowa mikroskopia elektronowa
TEM – transmisyjna mikroskopia elektronowa
ThT – tioflawina T
TSE – pasażowalne encefalopatie gąbczaste
U – stan rozwinięty białka
VCD – wibracyjny dichroizm kołowy
2009]. Rusztowanie łańcucha polipeptydowego poza sztywnym wiązaniem peptydowym zawiera również typowe wiązania pojedyncze –NH–Cα– oraz – Cα–CO–, wokół których rotacje są dozwolone, co umożliwia, z kolei, obieranie odpowiedniej konformacji przez molekułę białka [Petsko, 2004]. Na swobodę rotacji, a tym samym zakres wartości przyjmowanych przez kąty torsyjne Φ oraz Ψ ogromny wpływ ma geometria łańcuchów bocznych aminokwasów tworzących łańcuch polipeptydowy (Rysunek 1).
Rysunek 1. Fragment łańcucha polipeptydowego z zaznaczonymi kątami torsyjnymi Φ oraz Ψ, oraz częściowo podwójny charakter wiązania peptydowego uniemożliwiający rotacje wokół jego osi.
Sztywność wiązania peptydowego i różnorodność łańcuchów bocznych znacznie ograniczają liczbę dostępnych konformacji dla łańcucha zbudowanego z danej sekwencji aminokwasowej [Ramachandran, 1963]. Obliczenia Ramachandrana pozwoliły określić dozwolone wartości kątów torsyjnych Φ oraz Ψ dla przyjmowanych przez łańcuch polipeptydowy konformacji (Rysunek 2). Uwzględniając ograniczenia steryczne, tylko niektóre wartości kątów torsyjnych mają przełożenie na stabilną strukturę przestrzenną, tj. konformację łańcucha głównego w której molekuła przyjmuje regularny kształt umożliwiający utworzenie jak największej liczby wiązań wodorowych.
Rysunek 2. Mapa dozwolonych konformacji według przyjmowanych wartości kątów torsyjnych Φ oraz Ψ. Ciemnym kolorem zaznaczone zostały konformacje sterycznie uprzywilejowane, natomiast jasnym kolorem konformacje mniej stabilne, rzadziej obserwowane w obrębie białek. Obliczenia oparte są na danych dyfrakcyjnych otrzymanych dla kilkuset białek. Na podstawie [Petsko, 2004].
α C O
C
H R N
H α C H R
α
C
O Ψ Φ (^) C
O
C
H R N
H
C H R
α
C
O +
-
Ψ Φ
Spośród wielu konformacji, za najbardziej stabilne, a tym samym za najczęściej spotykane uważa się α-helisę oraz β-kartkę, które zostały opisane już kilkanaście lat przed publikacją Ramachandrana [Pauling, 1951a; Pauling 1951b]. Pierwsza z nich jest strukturą cylindryczną, w której skręcony łańcuch polipeptydowy stabilizowany jest wiązaniami wodorowymi pomiędzy grupami CO i NH należącymi odpowiednio do aminokwasów oznaczonych jako n oraz n+4 w łańcuchu polipeptydowym [Berg, 2009]. Pomijając terminalne aminokwasy łańcucha, wszystkie pozostałe tworzą wiązania wodorowe co skutkuje przesunięciem sąsiadujących ze sobą w α-helisie reszt aminokwasowych o 0,15 nm w kierunku propagacji helisy i obrócenie ich względem siebie o kąt 100°. Łańcuchy boczne kolejnych aminokwasów wysunięte są zawsze na zewnątrz α-helisy, a na jeden jej pełny obrót przypada 3,6 reszt aminokwasowych. Zbudowana α-L-aminokwasów α-helisa jest zawsze prawoskrętna. Zdecydowanie rzadziej od α-helis spotykane są inne formy helikalne takie jak helisa 3 10 , helisa π, helisa kolagenowa, a także struktury helikalne typu poliprolina I oraz II. W przypadku typowej, prawoskrętnej helisy 3 10 na jeden obrót przypadają 3 reszty aminokwasowe, czemu odpowiada tworzenie się wiązań wodorowych pomiędzy grupami CO i NH n-tego oraz n+3 aminokwasu w łańcuchu polipeptydowym [Barlow, 1988]. Z analizy krystalograficznej wynika, że około 4% łańcuchów białkowych zawiera konformację helisy 3 10 , co sprawia, że jest to czwarta, najczęściej występująca konformacja obok α-helisy, β-kartki oraz zwrotów β [Barlow, 1988; Karpen, 1992]. W przypadku helisy π pełen jej obrót obejmuje 4,4 reszty aminokwasowe, a wiązania wodorowe tworzone są pomiędzy aminokwasami n oraz n+5 [Branden, 1999]. Jest to jednak znacznie rzadziej występująca struktura ze względu na frustrację energetyczną wynikającą z trudności w wysyceniu stabilizujących oddziaływań van der Waalsa poprzez „pustą” w środku strukturę cylindryczną. Problematyczna jest też potrzeba prawidłowej orientacji aż 5 kolejnych aminokwasów w łańcuchu, która musi poprzedzać utworzenie jednego poprawnego wiązania wodorowego w helisie π [Low, 1953]. Odmienne właściwości, które powiązane są ze sporadycznością występowania, cechują helisę kolagenową oraz strukturę poliprolina I/II. W przeciwieństwie do omawianych wcześniej struktur helikalnych, łańcuchy polipeptydowe tworzące takie konformacje bogate są w aminokwasy takie jak glicyna oraz prolina, których obecność ma ogromny wpływ na przyjmowaną strukturę przestrzenną [Petsko, 2004]. Helisą kolagenową nazywane są superstruktury utworzone z trzech splecionych helis stabilizowanych międzyłańcuchowymi wiązaniami wodorowymi, co w przypadku samego kolagenu nadaje mu typowy, fibrylarny charakter [Brodsky, 1997]. W sekwencji peptydowej takich helis powtarzającym się fragmentem jest (GlyXY)n, gdzie
Zgodnie z przewidywaniami teoretycznymi, wzajemne ułożenie nici β może przebiegać w dwojaki sposób, co determinuje powstanie stabilnych konformacji równoległej bądź antyrównoległej (Rysunek 3). Obie formy określane są za pomocą kierunku propagacji reszt aminokwasowych w obrębie nici β. Kiedy sąsiadujące w płaszczyźnie β-kartki nici biegną zgodnie od N– do C–końca mówimy o β-kartce równoległej, natomiast w odwrotnym przypadku (w przeciwnych kierunkach) o β-kartce antyrównoległej (Rysunek 3). Według badań oraz obliczeń kwantowo-mechanicznych ułożenie antyrównoległe jest korzystne z punktu widzenia geometrii struktury oraz jej entalpii swobodnej [Perczel, 2005; Richardson, 1977]. Wiązania wodorowe tworzone przez grupy karbonylowe oraz amidowe leżą praktycznie w tej samej płaszczyźnie sprawiając, że oddziaływania są planarne, co jest najkorzystniejsze energetycznie. Kiedy nici β skierowane są równolegle, wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy grupą CO oraz NH pod pewnym kątem w stosunku do łańcucha polipeptydowego. Odmienna geometria nie generuje istotnych różnic w długościach wiązań wodorowych, które przyjmują wartości 0,197 nm oraz 0,196 nm (odpowiednio dla struktury równoległej oraz antyrównoległej) i różnią się jedynie nieznacznie w stosunku do α-helisy [Baker, 1984].
Rysunek 3. Antyrównoległa oraz równoległa struktura β-kartki. Strzałkami oznaczony został kierunek propagacji kolejnych nici β i ich wzajemne ułożenie. Pomiędzy łańcuchami przedstawione zostały wiązania wodorowe grup CO oraz NH sąsiadujących nici. Na podstawie [Branden, 1999].
Tworzenie się różnych struktur drugorzędowych w obrębie jednego łańcucha polipeptydowego wymusza powstawanie typowych dla danego białka struktur zwrotnych
(ang_. β turns, β hairpins, loops_ ). Umożliwia to zawracanie i tworzenie struktury β-kartkowej w obrębie pojedynczego łańcucha polipeptydowego [Berg, 2009]. Zwroty, zbudowane najczęściej z 4 kolejno występujących aminokwasów w łańcuchu, stabilizowane są poprzez tworzące się wiązanie wodorowe pomiędzy grupą CO aminokwasu n oraz grupą NH aminokwasu n+1 [Venkatachalam, 1968]. W przeciwieństwie do pozostałych struktur, zwroty β nie przybierają określonej, uporządkowanej struktury przestrzennej, ich lokalne geometrie są dość elastyczne, co umożliwia nagłe zmiany kierunku propagacji łańcucha polipeptydowego [Sibanda, 1985]. Sporadycznie występują również, bądź są postulowane teoretycznie inne, atypowe struktury drugorzędowe. Do takich konformacji należy np. β-helisa oraz α-kartka. β-helisa, lokalnie przypominająca równoległą β-kartkę, to struktura śrubowa (prawo– lub lewoskrętna) zbudowana z ułożonych spiralnie fragmentów β-kartkowych (Rysunek 4) [Jenkins, 1998]. Kolejne łańcuchy boczne zorientowane są naprzemiennie, co zwiększa nieco średnicę β-helisy, jednak konformacja stabilizowana jest wewnątrzłańcuchowymi wiązaniami wodorowymi. Dotychczas udało się wykrystalizować kilka β-helikalnych białek, których struktura przestrzenna została szczegółowo scharakteryzowana m.in. prawoskrętne liazy pektynowe C z bakterii Erwinia chrysanthemi [Yoder, 1993], bądź lewoskrętna anhydraza węglanowa z archeonów Methanosarcina thermophila [Kisker, 1996].
Rysunek 4. Struktura β-helisy w formie lewoskrętnego monomeru z gatunku Choristoneura fumiferana (PDB 1M8N) (A) oraz prawoskrętnego dimeru (PDB 1EZG) z gatunku chrząszczy Tenebrio molitor (B) należących do białek AFP (ang. antifreeze proteins ).
Struktura α-kartki natomiast przypomina nieco strukturę β-kartkową, jednak zakłada, że jej pojedyncze nici α są idealnie uporządkowane – wszystkie grupy karbonylowe oraz aminowe zorientowane są w jednym, przeciwstawnym do siebie kierunku tworząc w ten sposób periodyczną sieć wiązań wodorowych [Pauling, 1951b]. Choć nie jest to struktura
A. B.
aminokwasy faworyzują strukturę α-helikalną (np. Glu, Ala, Leu) [Levitt, 1978; Williams, 1987]. Należy podkreślić, że przyjmowanie struktury trzeciorzędowej również determinowane jest przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu. Wprowadzenie oddziaływań pomiędzy segmentami drugorzędowymi w łańcuchu polipeptydowym, a zatem zwinięcie się do stanu natywnego, uzależnione jest od oddziaływań molekuły białka z rozpuszczalnikiem, co powoduje, że hydrofilowe regiony białka wyeksponowane są na zewnątrz, zaś hydrofobowe ukrywają się wewnątrz globuli [Kauzmann, 1959; Vendruscolo, 2001]. Anfinsen, poza odwracalnością procesu denaturacji, zwrócił również uwagę na aspekty termodynamiczne zwijania się białek [Anfinsen, 1973]. Na podstawie prowadzonych eksperymentów zaproponował, że stan zwinięty (ang. folded, F) oraz rozwinięty (ang. unfolded, U) występują w równowadze, która w warunkach fizjologicznych przesunięta jest w kierunku stanu natywnego (F). To oznacza, że procesem zwijania U→F kieruje zmiana entalpii swobodnej Gibbsa, która w przypadku przyjmowania stabilnego stanu natywnego osiąga globalne minimum [Murphy, 2001]. Wzrost uporządkowania molekuły białka w trakcie zwijania, a tym samym drastyczne ograniczenie liczby stopni swobody generuje niekorzystny wkład entropowy do sumarycznej entalpii swobodnej Gibbsa. Aby proces zwijania mógł być dozwolony termodynamicznie musi pociągać za sobą wzrost entropii uniwersum. Dzieje się to za sprawą efektu hydrofobowego sterującego hydrofilowymi oraz hydrofobowymi fragmentami molekuły podczas zwijania. Kiedy hydrofobowe łańcuchy boczne asocjują wewnątrz cząsteczki, uwalniania jest warstwa niskoentropowej wody (Rysunek 5), co poprzez wzrost entropii rozpuszczalnika przyczynia się do kompensacji spadku entropii konformacyjnej łańcucha polipeptydowego [Kauzmann, 1959; Vendruscolo, 2001].
Rysunek 5. Proces zwijania się łańcucha polipeptydowego z formy rozwiniętej do konformacji natywnej. W trakcie renaturacji w środowisku wodnym (zaznaczone kolorem szarym) dochodzi do asocjacji reszt hydrofobowych (zaznaczone kolorem czarnym) do wewnątrz molekuły białka natywnego, uwalniania wody ze sfrustrowanej termodynamicznie warstwy solwatującej i w efekcie do wzrostu entropii. Na podstawie [Huang, 2000].
Poza wkładem entropowym (ΔS), na entalpię swobodną Gibbsa ma również wpływ entalpia (ΔH) procesu zwijania, w której udział mają wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa oraz mostki solne, które także uczestniczą w tym procesie [Pace, 1996]. Biorąc pod uwagę długość i elastyczność łańcucha polipeptydowego, a co za tym idzie liczbę stopni swobody łańcucha, wydawać by się mogło, że czas potrzebny na wybranie najstabilniejszej struktury przestrzennej spośród wszystkich możliwych konformacji będzie niezwykle długi. Wyraża to tzw. „paradoks Levinthala” pokazujący, że dla łańcucha złożonego ze 100 aminokwasów i czasie termodynamicznego „próbkowania” pojedynczych konformacji rzędu 10-12^ s, zwijanie mogłoby trwać ok. 10^27 lat, co w oczywisty sposób nie odpowiada rzeczywistości, gdyż czas ten szacowany jest często na mniej niż 1 ms [Levinthal, 1968]. Doprowadziło to do postawienia tezy, że proces zwijania nie polega na przeszukiwaniu wszystkich dostępnych konformacji na drodze U→F, tylko na tworzeniu stanów pośrednich, o niższej energii swobodnej Gibbsa, które ograniczając lokalnie stopnie swobody molekuły białka wyznaczają kierunek tworzenia się stanu natywnego [Creighton, 1974; Kuwajima, 1976; Wong, 1973]. Taka interpretacja procesu zwijania białek, zakładająca występowanie kolejnych, bardziej prawdopodobnych konformacji pośrednich, umożliwiła stworzenie koncepcji wielowymiarowej hiperpowierzchni energii potencjalnej (ang. energy landscape ) dla całej przestrzeni konformacyjnej białka dostępnej w trakcie zwijania. Charakterystyczny, nieregularny kształt tzw. lejka zwijania (ang. folding funnel ) obrazuje ograniczanie stopni swobody molekuły białka, a co za tym idzie tworzenie bardziej korzystnych energetycznie stanów pośrednich prowadzących do globalnego minimum entalpii swobodnej (Rysunek 6) [Jaenicke, 1999; Radford, 2000]. Zwężanie się lejka jest skorelowane z liczbą dostępnych konformacji, która w miarę osiągania przez kolejne reszty aminokwasowe położenia, jak w stanie natywnym, ulega drastycznemu zmniejszeniu. Nieregularny kształt lejka zwijania jest ściśle powiązany z sekwencją aminokwasową białka, długością łańcucha oraz warunkami fizykochemicznymi otoczenia. Małe molekuły (<100 aminokwasów) zazwyczaj charakteryzowane są poprzez „gładki” lejek, wyróżniający tylko stan rozwinięty oraz natywny [Jackson, 1998]. W miarę wzrostu długości łańcucha polipeptydowego rośnie liczba krótkożyciowych stanów pośrednich osiąganych przez białka, a zatem zwiększa się „pofałdowanie” lejka [Dobson, 2004]. Spośród wielu niestabilnych, krótkotrwałych stanów pośrednich wyjątkowo dużą stabilnością charakteryzuje się stan tzw. stopionej globuli (ang. molten globule , MG). Dość głębokie, lokalne minimum przypadające na MG wynika z faktu, że posiada ona dobrze wykształconą strukturę drugorzędową ale brak trzeciorzędowej struktury jak w stanie
potrzebny na utworzenie konformacji natywnej zależy natomiast od rozmiaru molekuły i różnorodności przyjmowanych konformacji w obrębie łańcucha polipeptydowego. Rozważając proces zwijania się natywnego białka in vivo należy pamiętać o niezwykłej złożoności struktur komórkowych i wielu ścieżkach, niekoniecznie poprawnych, którymi może podążać zwijające się białko. Docelowym miejscem przeznaczenia syntezowanych molekuł białka w komórkach eukariotycznych jest zwykle środowisko pozakomórkowe. Białko musi pokonać drogę od rybosomu, przez endoplazmatyczne retikulum (ER), gdzie następuje zwijanie, aż do aparatu Golgiego (AG) odpowiedzialnego za sekrecję. Aby zapewnić maksymalną wydajność zwijania i zapobiec tworzeniu się niepoprawnie zwiniętych konformacji w ER wykorzystywany jest szereg molekularnych mechanizmów wspomagających takich jak białka opiekuńcze – chaperony oraz układ ubikwityna – proteasom. Chaperony, czyli białka opiekuńcze jest to grupa białek, które asystują innym białkom na drodze zwijania się [Hartl, 1996]. Wspomagają ten proces zapobiegając powstawaniu niepoprawnych konformacji w obrębie zsyntezowanego łańcucha polipeptydowego, a także agregacji białkowych superstruktur [Dobson, 2004]. Rola chaperonów jest szczególnie istotna w sytuacji stresu komórkowego np. wywołanego podwyższeniem się temperatury poprzez wspomaganie lokalnej renaturacji danej molekuły ze stanu częściowo zdenaturowanego [Lindquist, 1988]. Z kolei wysoce specyficzne białka opiekuńcze tzw. foldazy pomagają osiągnąć strukturę natywną bezpośrednio katalizując przemiany strukturalne w obrębie łańcucha polipeptydowego [Pauwels, 2007]. Drugim przykładem komórkowego sytemu wspomagania zwijania jest układ ubikwityna – proteasom, który selektywnie degraduje niezwinięte lub nieprawidłowo zwinięte białka komórkowe [Dobson, 2004]. Specyficzne cięcie enzymatyczne niepoprawnie zwiniętych białek komórkowych jest częścią procesu regulacji metabolizmu komórkowego zapewniającego homeostazę i prawidłowe funkcjonowanie organizmu [Ciechanover, 1994]. Dysfunkcja systemów regulujących proces zwijania oraz wychwytywania „niepoprawnych” struktur białka bardzo często prowadzi do spontanicznej proliferacji błędnie zwiniętych, zagregowanych struktur zarówno w komórce, jak i w przestrzeni pozakomórkowej. Wysoce uporządkowane, fibrylarne struktury zagregowane noszą nazwę amyloidów i niezależenie od białka prekursora charakteryzują się podobną morfologią i wysoką stabilnością termodynamiczną [Dobson, 2004]. Odkładanie się takich struktur w mózgu, wątrobie lub tkankach szkieletowych jest bezpośrednio powiązane z występowaniem szeregu chorób m.in. choroba Alzheimera, Parkinsona, czy Huntingtona [Thomas, 1995].
1.3. Struktury niepoprawnie zwinięte – amyloidy
Pojęcie amyloidu, początkowo błędnie utożsamiane ze złogami węglowodanowymi, wprowadzone zostało w 1854 roku przez niemieckiego badacza Rudolpha Virchowa po serii eksperymentów in vivo , w których agregaty amyloidowe pozyskane z tkanek mózgowych wybarwiane były jodyną [Virchow, 1854]. Białkową genezę złogów amyloidowych udowodniono już w 1859 roku [Friedreich, 1859], jednak pierwotna nazwa amyloid funkcjonuje do dzisiaj opisując agregaty powstałe z różnych białek. Specyficzne wiązanie barwników pozwoliło na rozpoznawanie struktur amyloidowych za pomocą dodatku barwnika czerwieni Kongo (ang. Congo red) , a także za pomocą polaryzacyjnego mikroskopu optycznego ze względu na zaobserwowaną dla amyloidów tzw. „zieloną dwójłomność” (Rysunek 7). Świadczyło to dodatkowo o ich fibrylarnej morfologii wbrew wcześniejszym hipotezom o ich amorficznym charakterze [Cohen, 1959; Divry, 1927].
Rysunek 7. Obraz mikroskopowy wyizolowanych fibryli amyloidowych z łańcucha Aα fibrynogenu wybarwionych czerwienią Kongo (a), oraz w świetle spolaryzowanym (b) przedstawiający charakterystyczną dwójłomność obserwowaną dla złogów amyloidowych [Serpell, 2007].
W toku badań na amyloidami, wraz z rozwojem metod biologii strukturalnej, poszerzono analizę fibrylarnych agregatów o metody dyfrakcyjne. Scharakteryzowanie motywu cross-β w obrębie fibryli za pomocą dyfrakcji proszkowej przyniosło znaczący postęp w badaniach nad strukturami amyloidowymi [Eanes, 1968]. Uzyskane dwa prostopadłe do siebie refleksy: 4,75Å i ok. 9,8Å (Rysunek 8) zasugerowały występowanie powtarzającego się motywu w fibrylach amyloidowych, co powiązano ze znanymi odległościami pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi w obrębie struktury β–kartkowej (4,75Å) oraz odległościami pomiędzy kolejnymi, sąsiadującymi ze sobą β–kartkami (9,8Å). To wskazało na β-kartkę jako główny, II-rzędowy motyw strukturalny białek tworzących fibryle amyloidowe [Eanes, 1968; Pauling, 1953].
