Analiza jakościowa i ilościowa RNA, Streszczenia z Biologia

Pobierz Analiza jakościowa i ilościowa RNA i więcej Streszczenia w PDF z Biologia tylko na Docsity!

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: „BIOLOGIA MOLEKULARNA” Analityka Medyczna 2015

Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa

Analiza jakościowa i ilościowa RNA

Wstęp

W komórkach występują trzy główne rodzaje RNA: mRNA, tRNA, rRNA. Największą pulę RNA stanowi rRNA kodujące podjednostki rybosomów (u Eukariota o stałych sedymentacji 25-28S, 18S, 5S i 5,8S). Cząsteczki tRNA biorą czynny udział w procesie translacji dostarczając odpowiednie aminokwasy w trakcie syntezy łańcucha polipeptydowego. Z kolei mRNA stanowi matrycę dla syntezy białek funkcjonalnych i strukturalnych (1-5% całkowitego RNA komórki).

MikroRNA (miRNA) zaliczane są do endogennych, krótkich (19 - 23 nukleotydów), jednoniciowych, niekodujących cząsteczek RNA, uczestniczących w regulacji ekspresji genów. MikroRNA przyłączają się głównie do regionów 3’UTR (ang. untranslated region ) docelowego mRNA. Skutkuje to zahamowaniem translacji lub nawet degradacją nici nukleotydowej, co przekłada się w następstwie na obniżenie ekspresji docelowego genu. Wykazano, że jedno miRNA może oddziaływać na różne mRNA jak również jedno mRNA może posiadać sekwencje komplementarne dla różnych miRNA. Szacuje się, że ponad 60% transkryptomu ssaków podlega regulacji miRNA.

Biosynteza miRNA MiRNA powstają na matrycy genów, które przeważnie położone są w intronach. Niewielka liczba genów miRNA znajduje się w egzonach, rejonach 5’UTR i 3’UTR. Takie geny miRNA ulegają transkrypcji razem z genami „gospodarzami”. Ponadto, geny miRNA mogą znajdować się również w obszarze międzygenowym. W takiej sytuacji, ich transkrypcja przebiega z udziałem własnych promotorów i czynników transkrypcyjnych. Warto dodać, że geny miRNA mają charakter mono- i policistronowy. Biosynteza miRNA rozpoczyna się w jądrze komórkowym i ma charakter wieloetapowy. Początkowo z udziałem głównie polimerazy II RNA transkrybowany jest pri- miRNA. Przeciętny pri-miRNA złożony jest z ~ 33 nukleotydowego dwuniciowego rdzenia zawierającego sekwencję dojrzałego miRNA, który zakończony jest jednoniciową pętlą oraz jednoniciowych regionów flankujących. Pri-miRNA ulega pocięciu w swoistym mikroprocesorze złożonym z rybonukleazy III Drosha oraz białka DGCR8. W efekcie działania mikroprocesora, powstają ~ 70 nukleotydowe cząsteczki o strukturze spinki do włosów, zwane prekursorowymi miRNA (pre-miRNA). Na tym etapie, zostaje zakończona biosynteza miRNA w jądrze komórkowym, a pre-miRNA ulega transportowi przez błonę jądrową do cytoplazmy. Transport

zmienioną ekspresję podczas procesu patologicznego, co może być korzystne np. w diagnostyce nowotworów – w raku piersi obserwuje się wzrost ekspresji miRNA-21 i obniżenie miRNA-125-1, miRNA-125-2, miRNA-145, w raku jelita grubego stwierdzono obniżenie poziomu miRNA-143 i miRNA-145.

MiRNA jako czynnik terapeutyczny MikroRNA może stać się również wartym uwagi czynnikiem terapeutycznym. Strategie terapeutyczne mogą opierać się na eliminacji miRNA będącego w nadekspresji, blokowaniu pri-miRNA czy wprowadzaniu miRNA, którego ekspresja jest obniżona. Z wykorzystaniem miRNA w terapii wiążą się jednak liczne problemy związane z właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi cząsteczki.

Izolacja miRNA Otrzymanie wysokiej jakości RNA (niezdegradowanego o wysokim stopniu czystości) jest często momentem krytycznym w dalszej analizie opierającej się o wykorzystanie takich metod jak Nothtern blot, RT-PCR, mapowanie RNA, translacja in vitro, czy tworzenie bibliotek cDNA. W procesie obróbki RNA ważny jest dobór odpowiedniej metody homogenizacji materiału wyjściowego, dobór samej metody izolacji RNA jak i przechowywania wyizolowanego materiału.

RNA jest znacznie bardziej narażony na degradację niż kwas dezoksyrybonukleinowy. W materiale biologicznym i środowisku zewnętrznym obecne są rybonukleazy. Są to bardzo aktywne i stabilne, niewymagające dla swej aktywności kofaktorów, enzymy degradujące RNA. Ze względu na specyficzne właściwości RNaz należy poddawać je działaniu bardzo silnych związków denaturujących białka (chlorowodorek/izotiocyjanian guanidyny ), a sprzęt i niektóre bufory wykorzystywane do pracy z RNA traktować roztworem dietylopirowęglanu (0,1% roztwór DEPC).

Izolację miRNA można wykonać różnymi metodami. Można wśród nich wyróżnić metodę z użyciem RNAzol®RT oraz TRIZOL. RNAzol®RT jest odczynnikiem, który poprzez działanie fenolu i guanidyny prowadzi do lizy komórek. Dodanie wody powoduje precypitację cząsteczek takich jak np. DNA i białko, które usuwane są z roztworu w procesie wirowania. Uzyskany supernatant traktuje się alkoholem w celu wytrącenia i oczyszczenia cząsteczek RNA.

TRIzol- Total RNA Isolation, jest mieszaniną fenolu, izotiocyjanianu guanidyny i innych związków, które prowadzą do lizy komórek i inaktywacji endogennych RNaz. Pierwszym etapem izolacji RNA

jest zawieszenie materiału komórkowego/tkankowego w Trizolu. W kolejnym etapie dodawany jest chloroform, odpowiedzialny za ekstrakcję zanieczyszczeń białkowych, ale także rozdział DNA i RNA. Wirowanie w obecności chloroformu prowadzi do utworzenia się 3 warstw i tym samym rozdzielenia składników lizatu (RNA, DNA, białek). We frakcji wodnej (górnej) zatrzymuje się RNA, traktowanie następnie izopropanolem w celu wytrącenia i koncentracji. Końcowe etapy izolacji sprowadzają się do osuszenia i rozpuszczenia w wodzie osadu RNA. Białka i DNA możliwe są do odzyskania w trakcie procesu izolacji RNA z fazy organicznej. Twórcą Trizolu był Piotr Chomczyński.

Nadmiar DNA w mieszaninie traktowany jest kwaśnym fenolem, alternatywnie roztwór RNA trawi się DNazą.

Jeżeli interesuje nas określona frakcja RNA (mRNA) w trakcie procedury izolacji należy uwzględnić dodatkowe etapy wymywające z preparatu pozostałe kwasy tRNA oraz rRNA. Wykorzystuje się w tym celu fakt, że cząsteczki mRNA na końcach 3’ zawierają sekwencje poli(A), które mogą wiązać się z cząsteczkami poli(T) przyłączonymi do stałego podłoża (kulki magnetyczne, kolumna chromatograficzna). Cząsteczki RNA nie związane z podłożem są wymywane, natomiast oczyszczone związane z podłożem mRNA poddawane są elucji.

Elektroforeza agarozowa

Elektroforeza wykorzystuje zjawisko przemieszczania się w polu elektrycznym cząsteczek obdarzonych ładunkiem. Na szybkość migracji w polu elektrycznym mają wpływ takie czynniki jak: różnica potencjałów w polu, wielkość, kształt, ładunek i charakter chemiczny przemieszczającej się cząsteczki. Kwasy nukleinowe mają ładunek ujemny (nadany przez grupy fosforanowe) i zgodnie z nim migrują w polu elektrycznym do anody (+).

Po rozdziale elektroforetycznym całkowitego RNA najlepiej widoczne na żelu są dwie frakcje rRNA (u myszy 28S oraz 18S). Intensywność prążków daje nam informacje na temat jakości preparatu RNA: ich zanikanie świadczy o postępującej degradacji RNA. Niewielkie ilości wyizolowanego mRNA ze względu na swoją wielkość po rozdziale całkowitego RNA mogą nie być widoczne.

Protokół izolacji i analizy jakościowej i ilościowej frakcji RNA

całkowitego z frakcją mikroRNA z hodowli komórkowej

Izolacja RNA

Potrzebne materiały i odczynniki:

1. Odwirowany osad komórek zawieszonych w RNAlater.
2. TRIZOL
3. Chloroform
4. Izopropanol
5. 75% etanol
6. Woda (wolna od RNaz, woda do wstrzykiwań)
7. Eppendorfy
8. Vortex
9. Wirówka

UWAGA!!! Wykonanie procedury izolacji należy bezwzględnie

przeprowadzić w rękawiczkach!

1. Osad komórek zawiesić w 0,5 ml Trizolu (dobrze „przepipetowac”)
2. Inkubować 5 min w temp pokojowej (RT)
3. Dodać 100 ul chloroformu i wytrząsać w ręku przez 15s – uwaga, „leje” się z pipety – niskie napięcie powierzchniowe
4. Inkubować 2-3 min w RT
5. Wirować 11 500 rpm / 15 min / 4ºC 6. Górną wodną fazę przenieść do nowej probówki
6. Dodać 0,25 ml izopropanolu i delikatnie wymieszać, obracając probówkę
7. Inkubować 10 min w RT
8. Wirować 11 500 rpm / 10 min / 4ºC
9. Po wirowaniu obserwować osad na dnie probówki i uważnie odlać supernatant, nie naruszając osadu
10. Przemyć osad RNA dodając 0,5 ml 75% etanolu – jeżeli po dodaniu etanolu, osad wciąż_ będzie obecny na dnie probówki, próby należy delikatnie zworteksować – do momentu oderwania się osadu z dna probówki

12. Wirować 9 000 rpm / 5 min / 4ºC
13. Odrzucić supernatant obserwując osad RNA
14. Osad RNA suszyć na powietrzu, pozostawiając probówkę otwarta i ustawiając ja do góry dnem na bibule przez 10 – 20 min
15. RNA zawiesić w 2 0μl wody (wolnej od RNaz, woda do wstrzykiwań).

Ocena jakościowa RNA – elektroforeza w żelu agarozowym

UWAGA!!! Bromek etydyny jest silnym kancerogenem! Należy bezwzględnie

pracować w rękawiczkach!

Potrzebne materiały i odczynniki:

1. Bufor do elektroforezy TAE 1x (10x TAE: 40mM Tris, 0,12 % kwas octowy, 1mM EDTA pH 8,0)
2. Agaroza
3. Bromek etydyny
4. Obciążnik (10x obciażnik: 0,25% bromophenol blue, 0,25% xylene cyanol, 20%ficoll typ
5. Saneczki, grzebienie i komora elektroforetyczna
6. Wzmacniacz prądu

1. Z żelu wyciągnąć grzebień i przenieść saneczki do komory elektroforetycznej
2. Napełnić komorę buforem TAE 1x, w ilości która zapewni pokrycie żelu
3. Próby RNA należy inkubować w temp 70ºC przez 1 min, a następnie umieścić na lodzie
4. Przygotować próby do nałożenia na _el: 10 μl próby + 5 μl obciążnika ,
5. wymieszać przez przepipetowanie w probówce i nałożyć na żel – jeżeli pozostał płyn na ściance próbówki, należy próbę zwirować
6. Elektroforezę prowadzić przez 30-40 min / 80V
7. Po zakończonej elektroforezie przeanalizować wynik w świetle UV

Pomiar spektrofotometryczny

1. Dokonać pomiaru spektrofotometrycznego z użyciem spektrofotometru kropelkowego
2. Przeanalizować wyniki

260nm – 280nm – 260/280 – 260/230 – Stężenie RNA –