Ćwiczenie nr 4
Gdańsk, 2008
ANALIZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
W SMALCU
METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Analiza żywności
UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Analiza kwasów tłuszczowych w smalcu metodą chromatografii gazowej, Laboratoria z Chimica
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Typologia: Laboratoria
2019/2020
1 / 27
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz Analiza kwasów tłuszczowych w smalcu metodą chromatografii gazowej i więcej Laboratoria w PDF z Chimica tylko na Docsity!
Ćwiczenie nr 4
Gdańsk, 2008
ANALIZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
W SMALCU
METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Analiza żywności
UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
I. CZĘŚĆ TEORETYCZNA
1. Wprowadzenie
Lipidy to obszerna grupa organicznych związków naturalnych występujących we wszystkich organizmach żywych. Są to substancje o bardzo złożonej i różnorodnej budowie, ulegające wielu przemianom. Z uwagi na funkcje, jakie pełnią w ustroju ich obecność w diecie człowieka jest absolutnie niezbędna do zapewnienia prawidłowego rozwoju. Tłuszcze z kolei są wieloskładnikową mieszaniną różnych lipidów. Możemy je spotkać w naszym życiu codziennym. Większe ilości tłuszczów występują bowiem w tkankach zwierzęcych (smalec, tran, itp.) a także w nasionach roślin (oleje, masło kakaowe, itp.).
2. Klasyfikacja lipidów
Z uwagi na pewne podobieństwa strukturalne, lipidy podzielono na trzy zasadnicze grupy: I. lipidy proste (estry kwasów tłuszczowych i alkoholi):
- tłuszcze właściwe - estry kwasów tłuszczowych i glicerolu. Kwasy tłuszczowe wchodzące w skład tych lipidów można podzielić na nasycone (palmitynowy, stearynowy) i nienasycone (arachidowy, oleinowy). Występują tu także kwasy polienowe (zawierające więcej niż jedno wiązanie podwójne) jak np. kwas linolowy – przedstawiciel tzw. - niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT).
- woski – estry wyższych kwasów tłuszczowych i wyższych alkoholi jednowodorotlenowych (innych niż glicerol); II. lipidy złożone (związki zawierające w strukturze chemicznej oprócz kwasów tłuszczowych i alkoholi również inne składniki):
- fosfolipidy – lipidy zawierające kwas fosforowy jako mono- lub diester np. glicerofosfolipidy i sfingofosfolipidy,
- glikolipidy – związki zawierające przynajmniej jedną resztę cukrową połączoną wiązaniem glikozydowym z częścią lipidową np. glikoglicerolipidy i glikosfingolipidy,
- inne lipidy złożone – np. sulfolipidy; III. lipidy wtórne (pochodne lipidów prostych i złożonych, powstałe głównie w wyniku ich hydrolizy, zachowujące ogólne właściwości lipidów):
- kwasy tłuszczowe ,
- alkohole lipidowe – sterole, barwniki,
- węglowodory.
Tabela 1 Zawartość tłuszczu w wybranych surowcach i produktach spożywczych, w g/100 g części jadalnych. Produkt Zawartość tłuszczu w g/100 g produktu Kefir, jogurty, chudy twaróg, zwykłe pieczywo 0- Mięso indyka 3- Mięso kurcząt 7- Jaja 12- Ser żółty, parówki, wafle nadziewane 25- Chipsy ziemniaczane 20- Pączki 20-
Lipidy są składnikiem żywności niezbędnym do zapewnienia prawidłowego rozwoju naszego organizmu. Pełnią bardzo istotne funkcje. Przede wszystkim są głównym i najbardziej skoncentrowanym źródłem energii. Pod względem wartości energetycznej przewyższają wszystkie inne składniki pokarmowe. Przykładowo, z jednego grama tłuszczu uzyskać można ok. 37,7 kJ, a więc w przybliżeniu dwa razy więcej energii niż z podobnej ilości białka i sacharydów. Ponadto związki te pełnią w ustroju człowieka ważną rolę strukturalną. Triacyloglicerole, fosfolipidy oraz cholesterol i jego estry stanowią część składową komórek ustrojowych, m.in.: błon i organelli komórkowych. Dodatkowo, triacyloglicerole są też głównym składnikiem zapasowej tkanki tłuszczowej. Z racji tego, że tłuszcze są słabymi przewodnikami ciepła są doskonałymi izolatorami termicznymi. Ponadto pełnią funkcję ochronną dla organów wewnętrznych. Istotnym jest także fakt, że tłuszcze zawarte w diecie dostarczają niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT). Jest to o tyle ważne, gdyż kwasy te warunkują prawidłowy rozwój organizmu człowieka, a nie są endogennie syntetyzowane. Oprócz tego tłuszcze odgrywają w organizmie rolę rozpuszczalników wielu substancji, głównie witamin oraz karotenoidów, ułatwiając w ten sposób ich wchłanianie. Spełniają one również wiele istotnych funkcji w technologii żywności. Stosuje się je jako czynnik kontrolowanego przenoszenia ciepła (np. tłuszcze smażalnicze). Ponadto mają duże znaczenie w kształtowaniu cech organoleptycznych produktów tłuszczowych. Wpływają bowiem korzystnie na takie cechy jak: wygląd, tekstura, konsystencja, zapach, smak czy mazistość. Ważną rolę w technologii żywności spełniają także poszczególne składniki tłuszczów lub różne pochodne lipidów. Przykładowo mono- i diacyloglicerole oraz lecytyna są powszechnie stosowane jako emulgatory.
4. Tłuszcze – budowa i właściwości chemiczne
Tłuszcze pod względem chemicznym to estry gliceryny i wyższych kwasów tłuszczowych, zwane ogólnie glicerydami. Glicerol, jako alkohol trihydroksylowy, tworzy estry z trzema cząsteczkami kwasów. Mogą to być pochodne różnych kwasów nasyconych (np. stearynowy C 17 H 35 COOH, palmitynowy C 15 H 31 COOH) lub kwasów nienasyconych (np. oleinowy C 17 H 33 COOH, oraz linolowy C 17 H 31 COOH). Poniżej przedstawiono wzór przykładowej cząsteczki tłuszczu.
Tłuszcze są związkami o niskiej polarności, dlatego nie rozpuszczają się w wodzie, zaś dobrze rozpuszczają się w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak: eter etylowy, eter naftowy, chloroform, heksan, benzen, tetrachlorek węgla i in. Ponieważ tłuszcze “pływają” po powierzchni wody, oznacza to, że mają od niej mniejszą gęstość. Jako mieszaniny nie mają ściśle określonej temperatury topnienia. Triacyloglicerole w stanie stałym wykazują zjawisko tzw. polimorfizmu , co oznacza, że mogą występować w kilku formach krystalicznych. Przemiany polimorficzne z kolei bardzo silnie wpływają na właściwości reologiczne (konsystencję, plastyczność) i inne cechy fizyczne wielu produktów tłuszczowych. Z punktu widzenia zastosowań przemysłowych jest to więc zjawisko niepożądane. Przekształcenie jednej formy w drugą zachodzi wskutek np. ogrzewania, chłodzenia lub też jako wynik krystalizacji z różnych rozpuszczalników. Do badania tego zjawiska wykorzystuje się różne metody, m.in. kalorymetrię, dylatometrię, spektroskopię w podczerwieni oraz dyfrakcję promieni rentgenowskich. Z uwagi na obecność nienasyconych kwasów tłuszczowych w cząsteczce tłuszczu związki te ulegają reakcjom addycji (przyłączania) (np. reakcja uwodornienia). Przykład takiej reakcji podano poniżej.
5. Charakterystyka kwasów tłuszczowych
Większość kwasów tłuszczowych, nasyconych i nienasyconych, należy do związków o prostym łańcuchu i parzystej liczbie atomów węgla w cząsteczce. Kwasy tłuszczowe o łańcuchach rozgałęzionych lub o nieparzystej liczbie atomów węgla występują na ogół rzadko i w niewielkich ilościach. W przyrodzie istnieje ok. 40 różnych kwasów tłuszczowych (od C 2 do ponad C 80 ) przy czym najczęściej spotykane są kwasy C16, C18, C20 i C22. Z kolei w tłuszczach naturalnych występują wyłącznie kwasy zawierające od 4 do 24 atomów C w cząsteczce. Kwasy tłuszczowe są cieczami lub ciałami stałymi. Ich temperatury topnienia rosną wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej. Obecność w łańcuchu podwójnego wiązania powoduje z kolei obniżenie temperatury topnienia. Na temperaturę topnienia wpływają także inne czynniki np. konfiguracja przestrzenna wiązań podwójnych, ich położenie w łańcuchu węglowodorowym, a także czy kwas jest parzysto - czy nieparzystowęglowy. W porównaniu z węglowodorami, kwasy tłuszczowe o podobnej długości podstawników alkilowych mają wyjątkowo wysokie temperatury wrzenia. Dzieje się tak ze względu na dodatkową obecność grup karboksylowych, pomiędzy którymi dochodzi do tworzenia się bardzo silnych wiązań wodorowych, w efekcie których następuje dimeryzacja kwasów. Rozpuszczalność kwasów tłuszczowych w wodzie maleje w miarę wzrostu liczby atomów węgla w łańcuchu (do 4 at. C - rozpuszczalne, od 4 do 12 at. C - słabo rozpuszczalne, powyżej 12 at C - praktycznie nierozpuszczalne). Znacznie lepiej związki te rozpuszczają się w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak: benzen, etanol, benzyna, izopropanol. W tłuszczach występują dwa główne rodzaje kwasów tłuszczowych:
- Nasycone kwasy tłuszczowe – nie mają wiązań podwójnych; najbardziej rozpowszech- nione w tej grupie są: kwas palmitynowy – C 15 H 31 COOH – znajduje się między innymi w oleju bawełnianym, mleku, rybach oraz kwas stearynowy - C 17 H 35 COOH – obecny głównie w tłuszczach zapasowych przeżuwaczy i maśle kakaowym.
- Nienasycone kwasy tłuszczowej – to kwasy, które w swojej cząsteczce posiadają przynajmniej jedno wiązanie podwójne; wyróżnić tu można: o monoenowe kwasy tłuszczowe – mające tylko jedno wiązanie podwójne najczęściej w konfiguracji cis ( kwasy o konfiguracji trans w naturze występują sporadycznie; duże ilości trans -izomerów w tłuszczach żywnościowych są wynikiem procesów modyfikacyjnych, np. katalicznego uwodornienia). Przedstawicielem w tej grupie jest kwas oleinowy - C 17 H 33 COOH – przyjmuje się, że stanowi on aż 40 % wszystkich kwasów tłuszczowych.
o polienowe kwasy tłuszczowe w skrócie PUFA – naturalnie występujące kwasy polienowe zawierają od 2 do 6 wiązań podwójnych przeważnie o konfiguracji cis ułożonych zazwyczaj w następujący sposób -CH=CH-CH 2 -CH=CH-. Najpopularniejsze w tej grupie kwasów są kwas linolowy ( cis , cis -9,12- oktadekadienowy) – obecny prawie we wszystkich tłuszczach, głównie jednak w olejach roślinnych np. słonecznikowym; oraz kwas linolenowy ( cis , cis, cis -9,12,15- oktadekatrienowy) – obecny w oleju lnianym, sojowym i rzepakowym. Niektóre spośród kwasów polienowych są niezbędne do prawidłowego rozwoju i normalnego funkcjonowania organizmu. Kwasy te określa się mianem niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT). Mają one szczególne znaczenie w żywieniu człowieka. Odgrywają ważną rolę w zapobieganiu i leczeniu miażdżycy oraz innych stanów chorobowych prowadzących do zaburzeń gospodarki lipidów w ustroju. Ponadto powodują obniżenie poziomu cholesterolu w surowicy krwi, poprawiają pracę serca i przepływ krwi przez naczynia wieńcowe. W Tabeli 2 przedstawiono przybliżony skład tłuszczów i olejów z różnych źródeł.
Tabela 2. Przybliżony skład niektórych tłuszczów i olejów Nasycone kwasy tłuszczowe [%] Nienasycone kwasy tłuszczowe [%] Źródło C 12 C 14 C 16 C 18 C 18 C 18 C 18
laurynowy mirystylowy palmitynowy stearynowy oleinowy rycynoleinowy linolowy Tłuszcze zwierzęce smalec - 1 25 15 50 - 6 masło 2 10 25 10 25 - 5 tłuszcz ludzki 1 3 25 8 46 - 10 tłuszcz wielorybi
- 8 12 3 35 - 10 Oleje roślinne kokosowy 50 18 18 2 6 - 1 kukurydziany - 1 10 4 35 - 45 z oliwek - 1 5 5 80 - 7 arachidowy - - 7 5 60 - 20 lniany - - 5 3 20 - 20 rycynowy - - - 1 8 85 4 rzepakowy wysokoerukowy
n.d. n.d. 3,2 1,4 13,1 n.d. 15, rzepakowy zeroerukowy
n.d. n.d. 5,2 1,9 58,4 n.d. 22, n.d. – brak danych
stopnia rozdrobnienia próby, zawartości wody w próbie, szybkości ekstrakcji, sposobu suszenia itp. Ważne jest, aby eter etylowy stosowany do ekstrakcji był wolny od nadtlenków, odwodniony i przedestylowany. Metoda Soxhleta jest stosowana głównie do oznaczania tłuszczu w nasionach oleistych, mięsie i przetworach mięsnych, produktach piekarskich. Nie nadaje się z kolei do oznaczania tłuszczu w mleku i przetworach mleczarskich, ponieważ występujące tam kuleczki tłuszczu otoczone substancjami białkowymi utrudniają przenikanie rozpuszczalnika. Weibulla-Stoldta – polega na przeprowadzeniu hydrolizy produktu za pomocą kwasu solnego w celu uwolnienia substancji tłuszczowych obecnych w analizowanej próbce, a dalej oddzieleniu ich od hydrolizatu, wysuszeniu na sączku i ekstrakcji tłuszczu w aparacie Soxhleta. Ta metoda jest zalecana do produktów, w których tłuszcz występuje w postaci zemulgowanej lub w połączeniu z białkami (mleko, sery, pieczywo). Roese-Gottlieba – polega na traktowaniu badanego produktu kolejno: roztworem amoniaku (rozpuszcza białka, powoduje rozerwanie wiązań białkowo-tłuszczowych), alkoholem etylowym (ma działanie odwadniające, ułatwia rozpuszczanie fosfolipidów), eterem etylowym i eterem naftowym (etery rozpuszczają tłuszcz, fosfolipidy i inne substancje znajdujące się w fazie tłuszczowej). Następnie cały wyciąg eterowy lub jego część przenosi się do uprzednio zważonej kolbki, odparowuje rozpuszczalniki, a pozostałość suszy i waży. 6.1.2. Metody ekstrakcyjno-refraktometryczne – polegają na ekstrakcji tłuszczu z badanej próby za pomocą określonej ilości odpowiedniego rozpuszczalnika o ustalonym współczynniku załamania światła i następnie refraktometrycznym pomiarze współczynnika załamania światła otrzymanego ekstraktu. Podstawą wyznaczenia zawartości tłuszczu jest różnica między współczynnikami refrakcji rozpuszczalnika i badanego ekstraktu. Zawartość tłuszczu odczytuje się z tablic bądź oblicza za pomocą specjalnych wzorów.
6.2. Metody objętościowe (butyrometryczne) Polegają one na rozpuszczeniu znajdującego się w próbce białka najczęściej kwasem siarkowym(VI) z dodatkiem niewielkiej ilości alkoholu izoamylowego, a następnie wydzieleniu tłuszczu za pomocą rozpuszczalnika organicznego. Proces ten przeprowadza się w specjalnych przyrządach zwanych tłuszczomierzami lub butyrometrami. Metody objętościowe stosuje się głównie do oznaczenia zawartości w mleku i produktach mleczarskich, w przetworach mięsnych oraz gotowych posiłkach. Ich zaletą jest prostota,
szybkość wykonania, nieskomplikowana aparatura i tanie odczynniki. Spośród tych metod oznaczania zawartości tłuszczu najczęściej stosowana jest tzw. metoda Gerbera.
6.3. Metody instrumentalne (pośrednie) Wykorzystuje się specyficzne właściwości lipidów a analizy przeprowadza się przy pomocy np. magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), techniki odbiciowej w bliskiej podczerwieni (NIR) i in. Z jednej strony metody te są proste, szybkie i wygodne, ale z drugiej w większości przypadków wymagają uprzedniego sporządzenia wykresu krzywej zależności mierzonego parametru od zawartości tłuszczu w próbie oznaczanej z zastosowaniem klasycznych metod ekstrakcyjnych. Dodatkową ich wadą jest również konieczność dysponowania odpowiednią i drogą aparaturą. Metody te znalazły zastosowanie głównie do oznaczania zawartości tłuszczu w nasionach, margarynie, mięsie, produktach mleczarskich, czekoladzie i in.
7. Parametry jakości tłuszczu
Podczas przechowywania tłuszczów zachodzi wiele niekorzystnych zmian pod wpływem czynników zewnętrznych (temperatura, światło, powietrze) i wewnętrznych (enzymy tkankowe), w efekcie czego następuje psucie się produktu. Wymienić tu można: o Zmiany hydrolityczne – powodowane działaniem warunków zewnętrznych, mikroorganizmów i enzymów tkankowych; prowadzą do uwalniania z glicerydów wolnych kwasów tłuszczowych, jak również rozpad tych kwasów na kwasy o krótszym łańcuchu węglowym. o Zmiany spowodowane działaniem tlenu na nienasycone wiązania przy udziale światła i katalizatorów , np. jonów żelaza; w efekcie dochodzi do powstania nadtlenków, a następnie aldehydów i ketonów. W celu określenia niekorzystnych zmian zachodzących w tłuszczu podczas jego przechowywania wprowadzono tzw_. liczby tłuszczowe_. Do podstawowych liczb tłuszczowych należą: o Liczba kwasowa (LK) – określa ilość wolnych kwasów tłuszczowych; wyraża się ją jako liczba miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych (RCOOH) zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa jest miarą zawartości wolnych kwasów tłuszczowych, czyli inaczej efektem hydrolizy glicerydów; nie jest wartością stałą dla danego gatunku
zastosowana specjalna procedura (aby uniemożliwić ich straty podczas analizy). Po otrzymaniu metylowych pochodnych kwasów tłuszczowych poddaje się je następnie analizie ilościowej głównie za pomocą chromatografii gazowej.
9. Chromatografia gazowa – technika analizy kwasów tłuszczowych
Chromatografia jest fizykochemiczną metodą rozdzielania, w której składniki rozdzielane są pomiędzy dwie fazy: jedna jest nieruchoma (faza stacjonarna), a druga (faza ruchoma) porusza się w określonym kierunku_._ Jeżeli fazą ruchomą jest gaz, to mamy do czynienia z chromatografią gazową (GC − gas chromatography ). W zależności od rodzaju fazy stacjonarnej wyróżnić można dwa typy chromatografii gazowej: o chromatografię adsorpcyjn ą (GSC − gas-solid chromatography ), gdzie fazą stacjonarną jest ciało stałe. o chromatografię podziałow ą (GLC − gas-liquid chromatography ), gdzie fazą stacjonarną jest ciecz osadzona na stałym nośniku w postaci jednorodnego filmu (warstwy). Faza ruchoma porusza się wewnątrz kolumny, natomiast faza stacjonarna jest osadzona na wewnętrznych ściankach kolumny. Związki chemiczne z większym powinowactwem do fazy stacjonarnej są przez nią selektywnie zatrzymywane i poruszają się wzdłuż kolumny znacznie wolniej. Związki z mniejszym powinowactwem do fazy stacjonarnej poruszają się z kolei szybciej i tym samym opuszczają kolumnę, czyli eluuj ą z kolumny, jako pierwsze. Równowaga podziału pomiędzy fazy ma charakter dynamiczny, co oznacza, że cząsteczki substancji nieustannie przechodzą od fazy ruchomej do stacjonarnej i z powrotem.
9.1. Podstawowe parametry chromatograficzne Podstawowym parametrem określającym podział substancji X pomiędzy dwie fazy jest stała podziału Kc , którą można wyrazić równaniem Nernsta.
gdzie: cs − oznacza stężenie substancji X w fazie stacjonarnej, cm – oznacza stężenie substancji X w fazie ruchomej. Innym ważnym parametrem jest współczynnik retencji k , który wyraża się jako stosunek czasu, w jakim substancja X przebywa w fazie stacjonarnej do czasu, w którym
przebywa ona w fazie ruchomej. Określa on, ile razy dłużej dana substancja jest zatrzymywana przez fazę stacjonarną, niż potrzebowałaby na przejście przez kolumnę z prędkością poruszania się fazy ruchomej. Tylko związki chemiczne charakteryzujące się różnymi współczynnikami retencji mogą zostać rozdzielone na kolumnie chromatograficznej.
Efekt rozdziału chromatograficznego jest wykreślany w postaci chromatogramu. Przedstawia on wykres wskazań sygnału uzyskanego w detektorze w funkcji czasu lub w funkcji objętości fazy ruchomej. Zapis stężenia pojedynczej substancji w funkcji czasu ma postać krzywej Gaussa i nosi nazwę piku (ang. peak czyli szczyt). Typowy chromatogram przedstawiony jest na poniższym rysunku.
Rys. 1. Chromatogram i sposób pomiaru typowych wielkości chromatograficznych.
Na podstawie obrazu chromatograficznego możemy określić:
- czas retencji tR − czas mierzony od momentu wprowadzenia próbki na kolumnę do momentu pojawienia się na wyjściu z kolumny maksimum stężenia danego związku chemicznego czyli maksimum piku.
gdzie: L − długość kolumny chromatograficznej, u − średnia, liniowa prędkość przepływu gazu nośnego, k − współczynnik retencji.
- zerowy czas retencji tM (czas „martwy”) − czas przebywania w kolumnie substancji, która nie ma powinowactwa do fazy stacjonarnej np. metanu; czas zerowy jest równy czasowi przepływu fazy ruchomej przez kolumnę,
temperaturze wrzenia, jeżeli faza stacjonarna jest niepolarna. Wpływ długości kolumny na analizę jest następujący: im dłuższa kolumna tym czasy retencji są większe i tym wyraźniejsze są różnice między czasami retencji dwóch substancji. Jednak dłuższy czas analizy powoduje, że piki są bardziej rozmyte. Temperatura kolumny ma ogromny wpływ na analizę. Proces chromatograficzny można prowadzić w stałej temperaturze (tzw. analiza izotermiczna ) lub metodą programowanej temperatury ( analiza z programowan ą temperatur ą). Tę drugą opcję stosujemy wtedy, gdy składniki mieszaniny różnią się znacząco temperaturami wrzenia, np. węglowodory z ropy naftowej lub szereg homologiczny alkoholi. Dozowana próbka powinna być bardzo mała, ponieważ wówczas strefa startowa jest bardzo wąska. Próbka wprowadzona do kolumny nie może być większa od pojemności sorpcyjnej kolumny, ponieważ przeładowanie kolumny prowadzi do złego rozdzielenia składników próbki i powstawania niesymetrycznych, szerokich pików.
9.3. Aparatura w chromatografii gazowej Analizy w chromatografii gazowej przeprowadza się za pomocą chromatografu gazowego. Schemat takiego urządzenia przedstawiono poniżej na Rys.2.
Rys. 2. Schemat chromatografu gazowego
Zasada pracy tego urządzenia jest następująca: gaz nośny (faza ruchoma) doprowadzony z butli płynie przez regulator przepływu do dozownika, a następnie przez kolumnę i detektor, skąd jest usuwany na zewnątrz do atmosfery. Kolumna umieszczona jest w termostacie. Temperatura dozownika, detektora i kolumny jest odpowiednio regulowana. Przy pomocy dozownika analizowaną substancję wprowadza się w strumień gazu nośnego,
który to następnie przenosi ją do kolumny. Tam właśnie następuje rozdział chromatograficzny składników próbki. Po rozdzieleniu poszczególne składniki próbki kierowane są do detektora, a ten wykrywa je i reaguje sygnałem elektrycznym Sygnały po wzmocnieniu zostają rejestrowane w komputerze bądź w rejestratorze w postaci chromatogramu. W chromatografii gazowej fazę ruchomą stanowią gazy o małej gęstości, niskiej lepkości, w których współczynniki dyfuzji są duże. Najczęściej jest to: wodór, azot, argon lub hel. Rodzaj gazu nośnego ma niewielki wpływ na wynik rozdziału chromatograficznego. Zadaniem gazu jest transportowanie próbki przez dozownik, kolumnę i detektor. Przy wyborze gazu nośnego należy się kierować przede wszystkim rodzajem wybranego detektora oraz ceną, dostępnością i czystością gazu. Wymagana czystość gazów wynosi >99,999%. Dozownik jest elementem umożliwiającym wprowadzenie próbki w strumień gazu nośnego. Stosując chromatografię gazową, można analizować substancje, które w warunkach chromatografowania mają postać gazów lub par. Klasyczne dozowanie próbki do typowej kolumny kapilarnej polega na wprowadzeniu cieczy (0,1 –5 μl) za pomocą strzykawki do dozownika. W dozowniku następuje gwałtowne odparowanie próbki i po zmieszaniu z gazem nośnym próbka jest wprowadzana na kolumnę. Dla większości kolumn kapilarnych dopuszczalna objętość próbki wynosi 0,01 do 0,001 μl cieczy. Jest to poważne ograniczenie i dlatego właśnie w chromatografii kapilarnej stosuje się często dozowniki z dzieleniem strumienia gazu nośnego. Taki dzielnik dozuje do kolumny tylko część próbki np. 1/100 – 1/300, zaś pozostała część jest usuwana na zewnątrz i tracona. Niewątpliwie najważniejszą częścią składową każdego chromatografu gazowego jest kolumna. To tam bowiem zachodzi właściwy proces rozdziału chromatograficznego. W celu uzyskania jak najlepszych rozdziałów istotne jest zatem, aby odpowiednio dobrać rodzaj kolumny. Rozróżnia się następujące rodzaje kolumn: o pakowane (kolumny z wypełnieniem): analityczne, mikropakowane i preparatywne, o kolumny o przekroju otwartym – kapilarne. Kolumny pakowane napełnione są fazą stacjonarną w całej swojej objętości. Ten rodzaj kolumn jest najczęściej stosowany do preparatywnego otrzymywania niewielkich ilości czystych związków chemicznych. Kolumny kapilarne pozwalają na osiągnięcie dużo wyższych sprawności niż kolumny pakowane i obecnie większość analiz chromatograficznych wykonuje się przy zastosowaniu tych właśnie kolumn.. Fazy stacjonarne w kolumnach kapilarnych mogą być zarówno adsorbentami, jak i cieczami i mogą być osadzone na ściankach kapilar w różny sposób. Wyróżnia się następujące rodzaje kolumn kapilarnych:
o fazy polarne oparte o kopolimery styrenu i diwinylobenzenu (np. PoraPLOT Q). Substancje rozdzielane w kolumnie chromatograficznej są wykrywane przez detektor w miarę, jak eluują z kolumny. Detektor reaguje sygnałem elektrycznym na obecność chromatografowanego związku w gazie nośnym opuszczającym kolumnę. Detektory można podzielić na: o nieselektywne – detektory uniwersalne, reagują na wszystkie składniki próbki, o selektywne – reagują na pewną grupę związków, które mają podobne właściwości chemiczne lub fizyczne, o specyficzne – reagują na pojedynczy związek chemiczny. Najczęściej używanym detektorem w chromatografii gazowej jest detektor płomieniowo-jonizacyjny ( FID ) (Rys.3). Jest to detektor uniwersalny, czyli taki, który jest czuły na prawie wszystkie związki organiczne. Detektor FID nie wykrywa obecności związków nieorganicznych oraz niektórych związków węgla: CO, CO 2 , CS 2 , HCOOH, COCl 2. Działanie tego urządzenia opiera się na spalaniu wodoru w tlenie. Do detektora doprowadzone są z butli dwa gazy: wodór i powietrze. Gaz nośny wypływający z kolumny jest mieszany z wodorem i kierowany przez dyszę do komory, przez którą przepływa powietrze. Wodór spala się, tworząc płomień wodorowy. Składniki próbki doprowadzane wraz z gazem nośnym do płomienia ulegają również spaleniu. Niewielka część (około 0,001%) atomów węgla w trakcie spalania ulega jonizacji. W komorze znajdują się dwie elektrody: jedną jest dysza palnika, drugą (zbierającą) stanowi pierścień umieszczony w odpowiedniej odległości od dyszy. Powstający prąd jonowy jest wzmacniany i rejestrowany przez potencjometr. Sygnał z detektora jest proporcjonalny do liczby atomów węgla niezwiązanych z tlenem, co oznacza, że w przybliżeniu jest on również proporcjonalny do masy substancji.
Rys. 3. Detektor płomieniowi-jonizacyjny FID (J. K. Hardy, Chemical Separations, 2005).
9.4. Analiza jakościowa i ilościowa w GC Chromatografia gazowa jest nieocenioną techniką w chemii instrumentalnej głównie dlatego, iż przy jej pomocy można przeprowadzać zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe. Analiza jakościowa dotyczy identyfikacji pików odpowiadających poszczególnym składnikom próbki i opiera się na wielkościach retencyjnych. Porównuje się czas retencji piku identyfikowanej substancji z czasem retencji piku wzorca (chromatografowanych w jednakowych warunkach). Istnieją również inne sposoby identyfikacji związków w chromatografii gazowej, a mianowicie zastosowanie odpowiedniego detektora jakościowego. W tym przypadku najczęściej wykorzystuje się połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC/MS). Oprócz parametrów retencji układ ten rejestruje również widma mas i tym samym umożliwia przeprowadzenie kompletnej identyfikacji. Analizy ilościowe w chromatografii gazowej, podobnie jak analizy jakościowe, można także przeprowadzać na kilka sposobów. Spośród różnych metod oceny ilościowej metoda normalizacji wewnętrznej jest jedną z najprostszych. Wyznacza się tu procentowy udział wszystkich składników w próbce w oparciu o obraz chromatograficzny uzyskany z analizy. Podstawowym warunkiem jest to, aby na chromatogramie znajdowały się piki wszystkich substancji obecnych w próbce. Zasada tej metody polega na pomiarze powierzchni wszystkich sygnałów i sumowaniu ich. Suma wszystkich powierzchni stanowi 100 %, zaś powierzchnia każdego piku w stosunku do powierzchni sumy wszystkich pików odpowiada