1
UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Ćwiczenia laboratoryjne - teoria
Gdańsk, 2009
Analiza lipidów
A
NALIZA PRODUKTÓW POCHODZENIA NATURALNEGO
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Analiza lipidów - analiza produktów pochodzenia , Laboratoria z Chimica
Ćwiczenia laboratoryjne - teoria
Typologia: Laboratoria
2019/2020
1 / 11
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Dokumenty powiązane
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz Analiza lipidów - analiza produktów pochodzenia i więcej Laboratoria w PDF z Chimica tylko na Docsity!
UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Ćwiczenia laboratoryjne - teoria
Gdańsk, 2009
Analiza lipidów
ANALIZA PRODUKTÓW POCHODZENIA NATURALNEGO
1. Lipidy
Lipidy, inaczej tłuszcze, to naturalne związki chemiczne o różnorodnej budowie chemicznej. Lipidy są definiowane jako grupa związków dobrze rozpuszczalnych w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych takich jak chloroform, węglowodory, alkohole, etery i estry i w bardzo niewielkim stopniu rozpuszczalnych w wodzie [1]. Powyższa definicja jest bardzo ogólna, gdyż w skład lipidów wchodzą związki o różnej budowie chemicznej. Można je podzielić na dwie kategorie:
- lipidy o strukturach opartych na długołańcuchowych kwasach karboksylowych a także ich bezpośrednich pochodnych, czyli: kwasy tłuszczowe, alkany, niektóre alkeny, aldehydy i alkohole długołańcuchowe oraz ich pochodne (estry),
- lipidy terpenowe o strukturach opartych na jednostce izoprenowej C 5. Inna definicja została zaproponowana przez W. Christie [2], który proponuje, aby terminem lipidy określać kwasy tłuszczowe, ich pochodne oraz substancje związane z nimi bądź biochemicznie bądź poprzez funkcje w organiźmie. Kwasy tłuszczowe występują w naturze zazwyczaj w postaci związanej. Tworzą estry z glicerolem jako monoacyloglicerole, diacyloglicerole, triacyloglicerole, fosfolipidy i inne. Istnieją również ich estry ze sterolami oraz alkoholami długołańcuchowymi. Obecnie znanych jest powyżej 1000 kwasów tłuszczowych zidentyfikowanych w naturalnych produktach pochodzenia zwierzęcego, roślinnego a także z grzybów i bakterii. Najczęściej występuje i jest analizowanych około 50 kwasów. Ze względu na określoną, niewielką liczbę dróg biosyntezy z ograniczonej liczby substratów, kwasy tłuszczowe mają podobną budowę. Kwasy tłuszczowe (FA) charakteryzują się następującymi cechami:
- większość kwasów tłuszczowych ma prostołańcuchowe cząsteczki zawierające parzystą liczbę atomów węgla w zakresie od 12 do 22,
- kwasy jednonienasycone zawierają 1 wiązanie podwójne najczęściej o konfiguracji Z ( cis ),
- kwasy wielonienasycone zawierają dwa lub więcej wiązań podwójnych najczęściej o konfiguracji Z ( cis ) oddzielonych grupą metylenową. Kwasy tłuszczowe nazywane są od nazw węglowodorów o tej samej liczbie atomów węgla w cząsteczkach przy jednoczesnej zamianie końcówki z –an na –owy (tabela 1). Na przykład:
- węglowodór: n -heksadekan,
- kwas tłuszczowy: kwas n -heksadekanowy, CH 3 (CH 2 ) 14 COOH,
Triacyloglicerole (TAG) są to estry kwasów tłuszczowych oraz glicerolu (gliceryny). Ich strukturę można przedstawić w postaci ogólnego wzoru (rys. 1). W naturalnych tłuszczach TAG tworzą zwykle skomplikowane mieszaniny estrów różnych kwasów tłuszczowych. Na przykład, z dwóch kwasów tłuszczowych: palmitynowego i stearynowego, może powstać 9 różnych triacylogliceroli. Natomiast z 10 różnych kwasów tłuszczowych może powstać 1000 izomerów triacylogliceroli (wliczając w to izomery optyczne). CH 2 -OCOR^1 R^2 CO.O-CH CH 2 -OCOR^3 Rys. 1. Struktura triacyloglicerolu, gdzie R^1 CO−, R^2 CO− oraz R^3 CO− odpowiadają resztom kwasowym.
Fosfolipidy to liczna grupa polarnych lipidów zawierających estrowo związaną resztę kwasu fosforowego. Zalicza się do niej kilka klas związków znacznie różniących się budową. Fosfolipidy występują we wszystkich organizmach żywych, zwierzęcych i roślinnych, w większych ilościach w organach o szczególnym znaczeniu takich jak mózg lub nasiona u roślin. Do fosfolipidów zaliczamy m.in. fosfatydylocholiny (PC), fosfatydylo- etanoloaminy (PE), fosfatydyloseryny (PS) i fosfatydyloinozytole (PI) (rys. 2). Fosfatydylocholiny, zwane inaczej lecytyną, zawierają w swej cząsteczce glicerol związany estrowo z dwiema resztami kwasów tłuszczowych, trzecia grupa hydroksylowa jest zestryfikowana kwasem fosforowym, który z kolei jest związany z choliną. Fosfolipidy odkryto najpierw w mózgu a następnie w żółtku jaj. Od jego greckiej nazwy wywodzi się zwyczajowa nazwa lecytyny. Lecytyna jest najczęściej występującym lipidem w membranach komórkowych w tkankach zwierzęcych i często jest także znaczącym lipidem w tkankach roślinnych. Lizofosfolipidy mają tylko jedną resztę acylową w cząsteczce, generalnie w pozycji sn -1. Na przykład lizofosfatydylocholina (rys. 2).
CH 2 -OCOR^1
R^2 CO.O-CH O
CH 2 -O-P-O-CH 2 -CH 2 -N+(CH 3 ) 3
O-
1,2-diacylo- sn -glicerolo-3-fosforylocholina czyli fosfatydylocholina
CH 2 -OCOR^1 R^2 CO.O-CH O CH 2 -O-P-O-CH 2 -CH 2 -NH 2 OH fosfatydyloetanoloamina
CH 2 -OCOR^1 R^2 CO.O-CH O CH 2 -O-P-O-CH 2 -CH-COOH OH NH 2 fosfatydyloseryna
CH 2 -OCOR^1 R^2 CO.O-CH O CH 2 -O-P-O-C 6 H 5 (OH) 5 OH fosfatydyloinozytol
CH 2 -OCOR^1 HO-CH O CH 2 -O-P-O-CH 2 -CH 2 -N+(CH 3 ) 3 O- lizofosfatydylocholina
Rys. 2. Struktury fosfolipidów, gdzie R^1 CO− oraz R^2 CO− odpowiadają resztom kwasowym.
3. Analiza lipidów
Metody analiz składników lipidowych złożonych próbek naturalnych mogą być bardzo różnorodne tak jak występujące w nich związki. Celem analizy jest uzyskanie informacji o składzie próbki, czyli identyfikacja poszczególnych składników a także oznaczenie ich ilości. Analiza składa się z kilku równie istotnych etapów. Pierwszym z nich jest ekstrakcja lipidów a następnie, w większości przypadków, rozdział na poszczególne klasy związków o podobnej budowie i polarności. Składniki każdej z wyizolowanych grup identyfikuje się w oparciu o nowoczesne metody analityczne między innymi chromatografię gazową i cieczową, spektrometrię mas, spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopię w podczerwieni. W niektórych przypadkach analizuje się ekstrakt bez wcześniejszego podziału na klasy związków. Zanim zaczniemy analizę próbki lipidów, najpierw musimy wyekstrahować ją z tkanki. Lipidy wyodrębnia się z tkanek poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami najczęściej w układzie ciecz-ciecz. Istnieje wiele różnych metod ekstrakcji lipidów z tkanek. Wybór rozpuszczalnika i procedura ekstrakcji zależą od tego, którą frakcję lipidów chcemy uzyskać oraz z jakiej tkanki ją ekstrahujemy. Lipidy niepolarne, takie jak na przykład triacyloglicerole, występują zazwyczaj w tkance tłuszczowej, skąd mogą być z łatwością wyekstrahowane. Lipidy polarne tworzą strukturę błon komórkowych wraz z polisacharydami i białkami, z którymi są związane i dlatego ich ekstrakcja jest trudniejsza niż lipidów niepolarnych. Aby wyekstrahować lipidy z tkanek należy znaleźć taki rozpuszczalnik, który nie tylko rozpuszcza lipidy, ale również przełamie oddziaływania pomiędzy cząsteczkami lipidów a innymi składnikami komórek. Do wyekstrahowania jednocześnie lipidów niepolarnych i polarnych stosuje się mieszaninę chloroformu i metanolu. Rozpuszczalniki do ekstrakcji lipidów powinny być świeżo destylowane w szklanej aparaturze bez jakichkolwiek smarów (np. używanych do szlifów). W trakcie ekstrakcji lipidów należy zachować środki ostrożności i unikać kontaktu skóry rąk i twarzy z rozpuszczalnikami. Mieszanina chloroformu z metanolem używana do ekstrakcji lipidów powoduje natychmiastowe usunięcie bariery lipidowej ze skóry i bolesne podrażnienie. Próbki lipidów należy przechowywać w szklanych naczyniach. Lipidy przechowywane w plastikowych pojemnikach absorbują plastyfikatory ze ścianek pojemnika, które przeszkadzają w dalszych analizach próbki lipidów.
4. Metoda Folcha
Ekstrakty lipidów z tkanek zawierają duże ilości nie-lipidowych związków rozpuszczalnych w wodzie takich jak cukry, aminokwasy i inne. Substancje te muszą być usunięte z próbki przed rozpoczęciem analiz. Stosuje się do tego celu prostą metodę przemywania nazywaną od nazwiska jej twórcy metodą Folcha [4]. Procedura ekstrakcji i przemywania próbki jest następująca [5]:
- próbka tkanki jest homogenizowana z roztworem chloroform-metanol (2:1) w proporcji 1 g tkanki na 20 ml roztworu rozpuszczalników,
- homogenizat jest filtrowany albo odwirowywany,
- uzyskany ekstrakt (20 ml) jest przemywany albo wodą albo 0,9% wodnym roztworem NaCl (4 ml), objętość roztworu soli wynosi 1/5 objętości ekstraktu lipidów,
- po rozdzieleniu faz usuwa się górną fazę zawierającą większość nie-lipidowych zanieczyszczeń, dolna warstwa zawiera lipidy. Efektywność przemywania zależy od obecności soli mineralnych w surowym ekstrakcie [4]. Obecność soli zmienia podział lipidów pomiędzy dwie fazy i praktycznie eliminuje lipidy z górnej warstwy. Niewielką stratę lipidów można zredukować poprzez zastosowanie roztworu soli zamiast wody do przemywania ekstraktu. Dokładne procedury metody Folcha oraz jej modyfikacji zamieszczone są w wielu publikacjach dotyczących ekstrakcji i analiz lipidów.
5. Profil kwasów tłuszczowych
W lipidach kwasy tłuszczowe występują w postaci estrów. Najprostszy sposób analizy mieszaniny lipidów polega na uwolnieniu kwasów tłuszczowych poprzez kwaśną lub alkaliczną hydrolizę i następnie na analizie składu kwasów tłuszczowych. Jakościowa i ilościowa kompozycja kwasów tłuszczowych z lipidów nosi nazwę profilu kwasów tłuszczowych. Przed analizą należy wykonać albo hydrolizę lipidów a następnie uwolnione kwasy tłuszczowe zestryfikować albo należy wykonać transestryfikację. Jeżeli transestryfikację lipidów przeprowadzimy w bezwodnym środowisku w metanolu to uzyskamy estry metylowe kwasów tłuszczowych. Jest to tzw. metanoliza. Jej produkty, estry metylowe kwasów tłuszczowych, możemy łatwo analizować metodą chromatografii gazowej. Profil kwasów tłuszczowych z żółtka jaj jest podany na rys. 1.
Rys. 1. Chromatogram GC-FID estrów metylowych kwasów tłuszczowych wyizolowanych z żółtka jaja kurzego. Kolumna kapilarna RTX-5 (faza stacjonarna niepolarna), 30 m × 0, mm; 0,25 μm grubość filmu fazy stacjonarnej. Analiza w warunkach programowanej temp. od 70 °C do 300 °C, narost 4°C/min.
6. Analiza kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej
Kwasy tłuszczowe są najczęściej analizowaną, metodą chromatografii gazowej (GC), klasą lipidów. Aby poprawić kształt pików i rozdzielczość, kwasy tłuszczowe analizuje się w postaci estrów metylowych. Większość tych związków można analizować na kolumnach kapilarnych z niepolarną fazą stacjonarną. Kolejność elucji niepolarnych związków z kolumny o niepolarnej fazie stacjonarnej jest zgodna z kolejnością rosnących temperatur wrzenia a tym samym mas cząsteczkowych. Obecność wiązań podwójnych lub rozgałęzień łańcucha skraca czas elucji (rys. 1). Kolejność elucji estrów metylowych kwasów tłuszczowych będzie następująca: 16:1, 16:0, 18:3, 18:2, 18:1, 18:0. W przypadku występowania problemów z rozdziałem estrów metylowych kwasów wielonienasyconych polecane jest użycie kolumn o polarnej fazie stacjonarnej. Kolejność elucji estrów metylowych kwasów tłuszczowych na polarnej fazie stacjonarnej jest w zasadzie zgodna z kolejnością rosnących mas cząsteczkowych estrów. Jednak obecność wiązań podwójnych w łańcuchach kwasów powoduje niewielki wzrost polarności tych estrów, czego
efektem jest zwiększenie czasu retencji zgodnie z regułą, że polarne związki eluują z dłuższymi czasami retencji z polarnych kolumn. Związki zawierające wiązanie podwójne w łańcuchu są dłużej zatrzymywane w polarnej fazie stacjonarnej ze względu na oddziaływania dipol-dipol pomiędzy wiązaniem podwójnym a polarną fazą stacjonarną. Kolejność elucji estrów metylowych kwasów tłuszczowych będzie następująca: 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3. Analizy ilościowe metodą chromatografii gazowej wykonuje się metodą wzorca wewnętrznego. Metoda wzorca wewnętrznego polega na dodaniu do próbki określonej, dokładnie znanej ilości substancji wzorcowej, która nie występuje w badanej próbce natomiast jej właściwości fizykochemiczne są zbliżone do właściwości analitu. W przypadku analiz kwasów tłuszczowych, do próbki lipidów dodaje się najczęściej rzadko występujące w naturze nasycone kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla w łańcuchach (kwasy heptadekanowy, nonadekanowy lub trikozanowy). Wzorzec wewnętrzny powinien przejść tę samą procedurę wyodrębniania i spochadniania próbki, co analit i dlatego dodaje się go do próbki przed wykonaniem ekstrakcji. Stosując do spochadniania lipidów transestryfikację katalizowaną zasadowo wybierzemy jako wzorzec wewnętrzny węglowodór, ponieważ wolne kwasy tłuszczowe nie są estryfikowane w tych warunkach. W analizach chromatograficznych substancje identyfikuje się za pomocą detektorów jakościowych takich jak spektrometr mas bądź identyfikuje się związki na podstawie ich parametrów retencji. Najczęściej porównuje się czas retencji analizowanej substancji z czasem retencji substancji o znanej strukturze.
Literatura
- Morrison R.T, Boyd R.N. Chemia Organiczna. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1996.
- http://www.lipidlibrary.co.uk/index.html (aktualizacja 17.09.2009)
- Padley F.B., Gunstone F.D., Harwood J.L. Occurrence and characteristics of oils and fats. W: The Lipid Handbook , red. Gunstone F.D., Harwood J.L., Padley F.B., Chapman & Hall, Cambridge, drugie wydanie, 1995, str. 193-194. http://books.google.pl/books?id=m9J9pTDZEGEC&printsec=frontcover&source=gbs_v2_summary_r&cad=0#v =onepage&q=&f=false
- Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. J. Biol. Chem. 1957, 226: 497-509. http://www.jbc.org/cgi/reprint/226/1/
- http://www.cyberlipid.org/extract/extr0005.htm#1 (aktualizacja 09.09.2009)