Badania mikrobiologiczne działanie przeciwdrobnoustrojowe kosmetyków - charakterystyka, Poradniki, Projekty, Badania z Mikrobiologia

Pobierz Badania mikrobiologiczne działanie przeciwdrobnoustrojowe kosmetyków - charakterystyka i więcej Poradniki, Projekty, Badania w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity!

Według powyższych norm badania te można wykonać metodą z użyciem sączków

membranowych oraz bezpośredniego posiewu.

Metoda z użyciem sączków membranowych polega na przesączeniu przez sączek

membranowy o nominalnej wielkości porów 0,45 μm próbki odpowiadającej 1g lub 1ml

kosmetyku. W celu określenia ilości tlenowych bakterii mezofilnych sączek należy umieścić na

powierzchni agaru z hydrolizatem kazeiny i soi. Natomiast w celu określenia ogólnej liczby

drożdży i pleśni na powierzchni agaru Sabouraud z dekstrozą z dodatkiem lub bez

chloramfenikolu, jako antybiotyku hamującego wzrost bakterii.

Badanie metodą bezpośredniego posiewu można wykonać na dwa sposoby metodą

płytek lanych oraz posiewu powierzchniowego.

Należy wówczas przygotować szereg rozcieńczeń badanej próby, odmierzyć po 1ml do Płytek

Petriego i dodać około 15-20 ml odpowiedniego podłoża agarowego bądź rozprowadzić po

powierzchni podłoży agarowych odmierzoną objętość próbki. Następnie podłoża należy

poddać stosownej inkubacji.

Płytki z agarem z hydrolizatem kazeiny i soi należy inkubować 72 +- 6 godzinach w

temperaturze 32,5 +- 2,

o

C.

Natomiast płytki z podłożem Sabouraud z dekstrozą należy inkubować 5-7 dni w temperaturze

22,5 do 27,

o

C. Po okresie inkubacji zlicza się wyrastające kolonie przeliczając wynik na cfu/ml

lub cfu/g.

Badania wykrywania obecności S.aureus, P. aeruginosa, C.albicans oraz E.coli

wykonywane są wg norm ISO, odpowiednio PN-EN ISO 22718 : 2010 „Mikrobiologia.

Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus" , PN-EN ISO 22717 : 2010 „Mikrobiologia.

Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa” , PN-EN ISO 18416 : 2009 „Mikrobiologia.

Wykrywanie Candida albicans” oraz PN-EN ISO 21150 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie

obecności Escherichia coli”.

Pierwszy etap tych badań polega na wzbogaceniu próbki z wykorzystaniem nieselektywnej

pożywki bulionowej. Ma to na celu wzrost liczby mikroorganizmów, przy jednoczesnym

uniknięciu ryzyka zahamowania wzrostu jakie wywołują selektywne składniki pożywek

wybiórczych/różnicujących. Drugi etap badania (izolowanie) jest prowadzony na selektywnych

pożywkach, na których rośnie ograniczona ilość drobnoustrojów, a wzrost innych jest

hamowany. Badania wykrywania obecności określonych drobnoustrojów mają na celu

wykrycie w próbkach kosmetyków drobnoustrojów uznanych za patogenne. Obecność

któregokolwiek z tych drobnoustrojów ( S.aureus, P.aeruginosa, C.albicans ) dyskwalifikuje

skażony nimi kosmetyk. Natomiast wykrywanie obecności E.coli ma na celu stwierdzenie, czy

produkcja badanego kosmetyku odbywała się w warunkach odpowiedniej czystości

mikrobiologicznej. Stwierdzenie obecności E.coli w produkcie uważa się za skażenie mikroflorą

kałową.

Ocena jakości mikrobiologicznej kosmetyku polega na wykonaniu badań na obecność

mikroorganizmów chorobotwórczych oraz oznaczeniu ogólnej liczby bakterii. Na etapie

wdrażania nowego kosmetyku wykonuje się również tzw. badania obciążeniowe, w których

zakaża się kosmetyk różnymi bakteriami i w ten sposób sprawdza się skuteczność układu

konserwującego. Dzięki temu producent ma pewność, że przez cały okres użytkowania przez

konsumenta określonego kosmetyku, produkt ten będzie spełniał wymogi jakości

mikrobiologicznej.

Cz. II Badania mikrobiologiczne potwierdzające deklarowane działanie

przeciwdrobnoustrojowe kosmetyków (antybakteryjne i przeciwgrzybicze).

Celem badania jest potwierdzenie lub wykluczenie deklarowanych własności

przeciwdrobnoustrojowych preparatów kosmetycznych.

Zakres badań obejmuje określenie właściwości przeciwdrobnoustrojowych, ocenę

bakteriobójczego i grzybobójczego działania preparatu względem patogennych

szczepów testowych oraz ocenę oddziaływania preparatu na mikroflorę bakteryjną

skóry w miejscu jego stosowania.

Rodzaje badanych kosmetyków:

• kosmetyki do pielęgnacji skóry skłonnej do wykwitów, zmian ropnych,

trądziku;

• kosmetyki antybakteryjne do mycia skóry ciała;
• kosmetyki do higieny intymnej;
• kosmetyki do pielęgnacji skóry stóp
• antyperspiranty, dezodoranty;
• chusteczki antybakteryjne.

Cechy kosmetyków antybakteryjnych:

• powinny wykazywać działanie deklarowane przez producenta;
• powinny działać bakteriostatycznie;
• nie powinny zaburzać naturalnej równowagi skóry;
• nie powinny drażnić i powodować alergii;
• nie powinny nadmiernie wysuszać skóry.

Przykładowe metody stosowane w badaniach potwierdzających działanie

przeciwdrobnoustrojowe kosmetyków:

• metoda dyfuzyjna (krążkowa i studzienkowa)
• metoda zawiesinowa

Działanie preparatów sprawdzane jest względem:

• szczepów z kolekcji muzealnych (szczepy chorobotwórcze odpowiedzialne za

występowanie zmian na skórze w miejscu przeznaczenia stosowania preparatu)

• mieszaniny szczepów uzyskanych bezpośrednio od probantów - ochotników z

ADANIA MIKROBIOLOGICZNE

PREPARATÓW LECZNICZYCH I

KOSMETYKÓW

10.06.

Dodaj do:

Autor:

Filip Półtoranos, Katarzyna Czuba*

Zdjecie artykułu:

Wstęp

Mikrobiologia farmaceutyczna jest stosunkowo młodą specjalnością, której

początek można upatrywać w mikrobiologii ogólnej, lekarskiej oraz

przemysłowej. W Polsce powstanie mikrobiologii farmaceutycznej jako

odrębnej dziedziny nauki datuje się na okres po II Wojnie Światowej wraz z

powstaniem przemysłu farmaceutycznego. Głównym zadaniem

mikrobiologii farmaceutycznej jest określenie jakości mikrobiologicznej

produktów leczniczych. Problem ten w przemyśle farmaceutycznym

obejmuje kontrole środowiska wytwarzania produktów leczniczych

(czystość mikrobiologiczną powietrza, powierzchni i personelu), procesu

produkcyjnego a także jakość surowców, produktów pośrednich oraz

produktu końcowego. Jakość mikrobiologiczna produktów leczniczych

znajdujących się w obrocie ma istotne znaczenie dla zdrowia przyjmujących

je osób.

Liczne monografie farmakopealne mają na celu zapewnienie właściwej

kontroli mikrobiologicznej i uzyskanie bezpiecznego produktu leczniczego.

Przyczynia się do tego także coraz powszechniejsze przestrzeganie zasad

Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) przez producentów. Ważną rolę w

ocenie jakości i bezpieczeństwa stosowania zarówno produktów leczniczych

jak i kosmetycznych odgrywają także poszczególne normy ISO.

Bezpieczeństwo mikrobiologiczne

Zaburzenia w równowadze ekologicznej środowiska człowieka oraz

obniżenie naturalnej odporności populacji stwarzają niebezpieczeństwo

zakażeń nie tylko ze strony drobnoustrojów chorobotwórczych, ale także

oportunistycznych. W sytuacji normalnego stanu odporności człowieka

drobnoustroje te stanowią jego naturalną florę bakteryjną i nie powodują

zagrożenia. Jednak w przypadkach obniżonej odporności mikroorganizmy te

stają się inwazyjne i mogą być czynnikiem etiologicznym wielu chorób [1].

Z tego powodu jakość mikrobiologiczna produktów leczniczych odgrywa

ważną rolę dla bezpieczeństwa stosujących je osób. Problem ten posiada

swoje uwarunkowania w przeszłości w postaci klinicznie stwierdzonych

zakażeń odlekowych, spowodowanych obecnością drobnoustrojów w

lekach. Obecność mikroorganizmów w produktach leczniczych może być

wynikiem błędów produkcyjnych, nieodpowiednimi warunkami aseptyki

procesu produkcyjnego, pierwotnego skażenia surowców farmaceutycznych

czy niewłaściwej konserwacji. Klasycznym przykładem zakażenia

odlewowego jest epidemia duru brzusznego w 1966 roku w jednym z

szwedzkich szpitali. Spowodowana ona była podaniem chorym leku

doustnego zawierającego surowiec, gruczoły tarczycy, skażony

pałeczkami Salmonella. Zanotowano wówczas około 200 zachorowań.

Kolejnym problemem związanym z obecnością drobnoustrojów w

produktach leczniczych jest utrata właściwości terapeutycznych leków

podawanych chorym. Sytuacja taka może być wynikiem przemiany lub

rozkładu substancji leczniczych wskutek działania mikroorganizmów.

Należy więc zagwarantować, że leki nie są zanieczyszczone drobnoustrojami

chorobotwórczymi mogącymi spowodować pogorszenie się stanu zdrowia

chorego lub nawet śmierć [1].

Zasady Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP)

Dobra Praktyka Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice, GMP) jest

to zbiór przepisów i wytycznych stosowanych w celu zapewnienia

prawidłowego procesu wytwarzania produktów leczniczych, materiałów

medycznych i aktywnych substancji farmaceutycznych. Stosowanie zasad

GMP zapewnia powtarzalność oraz jednorodność produktów poprzez

nadzór nad procesem produkcji, od momentu zaopatrzenia w surowce,

poprzez ich magazynowanie, produkcję, pakowanie, znakowanie, aż do

etapu składowania i dystrybucji gotowych wyrobów. Umożliwia to

czyszczenia są przedmiotem procedur walidacji, których celem jest

weryfikacja poprawności i powtarzalności procesów produkcyjnych. Proces

produkcji powinien być prowadzony i nadzorowany przez osoby

kompetentne. Każda czynność dotycząca materiałów i produktów, między

innymi: odbiór, przechowywanie, wydawanie z magazynu, etykietowanie,

przetwarzanie, pakowanie czy dystrybucja musi odbywać się zgodnie z

pisemnymi procedurami lub instrukcjami. Na każdym etapie wytwarzania

materiały oraz produkty muszą być chronione przed zanieczyszczeniami,

w szczególności przed zanieczyszczeniami mikrobiologicznymi. Ocena

produktu końcowego powinna obejmować warunki produkcji, przegląd

dokumentacji wytwarzania, wyniki kontroli procesu, sprawdzenie zgodności

ze specyfikacją produktu końcowego oraz badanie opakowania końcowego.

Natomiast specyfikacja produktu końcowego powinna zawierać nazwę

produktu, skład, okres ważności, warunki przechowywania oraz specjalne

środki ostrożności. Kontrola Jakości gwarantuje, że przeprowadzane zostały

wszystkie niezbędne badania oraz że jakość materiałów i produktów została

pozytywnie oceniona przed dopuszczeniem do użycia, obrotu

i sprzedaży. Każda reklamacja dotycząca wady produktu powinna zostać

zarejestrowana oraz dokładnie wyjaśniona według obowiązujących

procedur. Inspekcje wewnętrzne są prowadzone w celu kontrolowania

wprowadzenia oraz przestrzegania wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania,

jak również w celu wskazania koniecznych działań korygujących. Wytwórca

powinien posiadać program regularnego weryfikowania zgodności pracy

pracowników, funkcjonowania pomieszczeń, urządzeń, produkcji,

dystrybucji produktów, kontroli jakości, dokumentacji i systemu inspekcji

wewnętrznych z zasadami Zapewnienia Jakości [3].

Mikrobiologiczna jakość produktów leczniczych

Jakość produktów leczniczych i surowców stosowanych w produkcji leków,

a także metody stosowane w badaniach jakości mikrobiologicznej leków są

opisane w opracowaniach farmakopealnych. W związku z przystąpieniem

Polski do Konwencji o Opracowywaniu Farmakopei Europejskiej obowiązuje

nas Farmakopea Europejska, która jest tłumaczona na język polski i

publikowana jako Farmakopea Polska. Obecnie obowiązuje FP X 2014,

która zawiera polską wersję wszystkich materiałów opublikowanych w

części podstawowej Farmakopei Europejskiej (Ph. Eur.) 8.0 oraz w

Suplementach 8.1 i 8.2, a także działy narodowe, tj. nieposiadające

odpowiedników w Ph. Eur.

Zagadnienia mikrobiologiczne dotyczące produktów leczniczych poruszane

są w Farmakopei w wielu monografiach. Zasadniczo farmakopealne metody

mikrobiologiczne stosowane w badaniu jakości produktów leczniczych

można podzielić na 4 klasy:

· liczenie komórek drobnoustrojów w badanej próbie,

· wykrywanie obecności drobnoustrojów w badanej próbie,

· identyfikacja i charakterystyka drobnoustrojów obecnych w badanej

próbie lub wyhodowanych z przesiewów,

· określenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej substancji

czynnych (antybiotyki, środki konserwujące, antyseptyczne) w stosunku

do testowych szczepów bakterii lub grzybów.

Pod względem mikrobiologicznym produkty lecznicze dzielimy na jałowe

oraz niejałowe. Do produktów leczniczych jałowych zalicza się preparaty do

podawania pozajelitowego, preparaty do oczu, preparaty na rozległe rany i

oparzenia, niektóre preparaty do uszu i irygacji oraz preparaty

weterynaryjne stosowane domacicznie lub dowymieniowo. Wszystkie

pozostałe produkty lecznicze dopuszczone do obrotu oraz substancje

stosowane do celów farmaceutycznych muszą spełniać odpowiednie

kryteria czystości mikrobiologicznej [4].

Badanie czystości mikrobiologicznej niejałowych produktów

leczniczych

Badanie czystości mikrobiologicznej ma na celu oznaczenie w 1g lub w 1 ml

badanej próby liczby żywych drobnoustrojów tlenowych (bakterie i grzyby)

oraz wykluczenie obecności wybranych drobnoustrojów chorobotwórczych.

Badanie czystości mikrobiologicznej produktów niejałowych jest omówione

w 2 kluczowych monografiach farmakopealnych: 2.6.12. Badanie czystości

mikrobiologicznej produktów niejałowych (mikrobiologiczne badania

ilościowe) oraz 2.6.13. Badanie czystości mikrobiologicznej produktów

niejałowych (badanie obecności określonych drobnoustrojów). Opisano w

nich metody ilościowe i jakościowe stosowane do kontroli jakości

mikrobiologicznej produktów leczniczych wytwarzanych w różnych

formach farmaceutycznych. Ze względu na możliwe duże zanieczyszczenie

mikrobiologiczne surowców roślinnych oraz specyfikę procesu wytwarzania

leczniczych produktów roślinnych do podania doustnego zostały one

opisane w specjalnej monografii: 2.6.31. Badanie mikrobiologiczne

produktów leczniczych roślinnych do podania doustnego [4].

▪ Mikrobiologiczne badania ilościowe

Mikrobiologiczne badanie ilościowe produktów niejałowych można

wykonać metodą z użyciem sączków membranowych lub bezpośredniego

posiewu. Dopuszczalna jest także metoda oznaczania najbardziej

prawdopodobnej liczby (NPL), która jest stosowana dla niektórych grup

PN-EN ISO 7218: 2008 „Mikrobiologia żywności i pasz. Wymagania ogólne i

zasady badań mikrobiologicznych”.

▪ Badanie obecności określonych drobnoustrojów

Mikrobiologiczne badanie obecności określonych drobnoustrojów pozwala

na stwierdzenie braku lub obecności niewielkiej liczby określonych

drobnoustrojów. W badaniach tych poszukuje się bakterii Gram-ujemnych,

tolerujących żółć, Escherichia coli, Salmonella , Pseudomonas

aeruginosa , Staphylococcus aureus, Candida albicans oraz w niektórych

przypadkach beztlenowców z rodzaju Clostridium. Badania należy wykonać

używając podłoży namnażających a następnie wybiórczych. W razie

potrzeby należy potwierdzić wynik badania dodatkowymi testami

identyfikacyjnymi [4].

Badanie obecności bakterii Gram-ujemnych, tolerujących żółć. W pierwszym

etapie badania należy pobrać odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu

z hydrolizatem kazeiny i soi. Tak przygotowaną próbkę należy inkubować w

temperaturze 20- 25

o

C przez 2-5 h. Jest to okres wystarczający na ożywienie

bakterii lecz niewystarczający na rozpoczęcie namnażania drobnoustrojów.

W kolejnym etapie należy pobrać objętość odpowiadającą 1g produktu z

uprzednio przygotowanej próby i dodać do bulionu Mossela wzbogaconego

dla pałeczek jelitowych. Próbę należy inkubować 24- 4 8h w temperaturze 30-

o C. Po okresie inkubacji należy przenieść 0,1 ml próby na płytki agaru z

fioletem krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą. Płytki należy

inkubować 18-24h w temperaturze 30- 35

o

C. Produkt spełnia wymagania

badania, jeżeli nie obserwuje się wzrostu kolonii. Wzrost czerwonych,

dobrze rozwiniętych kolonii świadczy o obecności bakterii Gram-ujemnych,

tolerujących żółć. Wówczas należy wykonać badanie ilościowe. W tym celu

do odpowiedniej ilości bulionu Mossela wzbogaconego dla pałeczek

jelitowych należy dodać preparat oraz jego rozcieńczenia zawierające

odpowiednio 0,1g, 0,01g, 0,001g badanego produktu. Podobnie jak

poprzednio płytki należy inkubować 24-48h w temperaturze 30- 35

o

C a

następnie przenieść każdą z hodowli na płytkę agaru z fioletem

krystalicznym, czerwienią obojętną, żółcią i glukozą i inkubować 18-24h w

temperaturze 30 - 35

o C. Wzrost kolonii świadczy o dodatnim wyniku.

Wówczas należy odnotować najmniejszą ilość produktu, dla której

otrzymano wynik dodatni oraz największą ilość produktu, dla której

otrzymano wynik ujemny. Odczytać z tabeli 1 prawdopodobną ilość bakterii

[4].

Tabela 1. Interpretacja wyników [4].

Wyniki dla każdej ilości produktu Prawdopodobna

liczba bakterii 0,1 g lub 0,01 g lub 0,001 g lub

0,1 ml 0,01 ml 0,001 ml w g lub ml

produktu

3

3

i > 10

2

2

i > 10

Badanie obecności Escherichia coli. W pierwszym etapie badania należy

pobrać odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu z hydrolizatem

kazeiny i soi. Tak przygotowaną próbkę należy inkubować w temperaturze

o C przez 18-24 h. Następnie należy przenieść bulion z hydrolizatem

kazeiny i soi do bulionu MacConkeya i inkubować 24-48h w temperaturze

o

C. Po okresie inkubacji należy przenieść 0,1 ml próby na płytkę z

agarem MacConkeya i inkubować 18-72h w temperaturze 30- 35

o C. Wzrost

czerwonych kolonii, nie wytwarzających śluzu świadczy o możliwej

obecności E.coli [4].

Badanie obecności Salmonella. W pierwszym etapie badania należy pobrać

odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu z hydrolizatem kazeiny i soi.

Tak przygotowaną próbkę należy inkubować w temperaturze 30- 35

o C przez

18 - 24 h. Następnie należy przenieść bulion z hydrolizatem kazeiny i soi do

bulionu Rappaparta Vassiliadisa wzbogaconego dla Salmonella i inkubować

18 - 24h w temperaturze 30- 35

o

C. Po okresie inkubacji należy przenieść 0,

ml próby na płytkę z agarem z ksylozą, lizyną i deoksycholanem i inkubować

18 - 48h w temperaturze 30 - 35

o

C. Wzrost dobrze wykształconych,

czerwonych kolonii z czarnymi środkami lub bez nich świadczy o możliwej

obecności Salmonella [4].

Badanie obecności Pseudomonas aeruginosa. W pierwszym etapie badania

należy pobrać odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu z hydrolizatem

kazeiny i soi. Tak przygotowaną próbkę należy inkubować w temperaturze

o

C przez 18-24 h. Po okresie inkubacji należy przenieść 0,1 ml próby

na płytkę z agarem z cetrymidem i inkubować 18-72h w temperaturze 30-

o

C. Wzrost zieleniejących, wykazujących fluorescencję koloni świadczy o

możliwej obecności P.aeruginosa [4].

Badanie obecności Staphylococcus aureus. W pierwszym etapie badania

należy pobrać odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu z hydrolizatem

kazeiny i soi. Tak przygotowaną próbkę należy inkubować w temperaturze

o

C przez 18-24 h. Po okresie inkubacji należy przenieść 0,1 ml próby

na płytkę z agarem z mannitolem i chlorkiem sodu i inkubować 18-72h w

temperaturze 30- 35

o

C. Wzrost żółto-białych kolonii otoczonych żółtą strefą

świadczy o możliwej obecności S.aureus [4].

Badanie obecności Candida albicans. W pierwszym etapie badania należy

pobrać odpowiednią ilość produktu i dodać do bulionu Sabouraud z

Podanie na śluzówkę

jamy ustnej

Podanie na dziąsła

Podanie na skórę

Podanie donosowe

Podanie do ucha

2

1

Nieobecność Staphylococcus

aureus w 1g lub 1ml.

Nieobecność Pseudomonas

aeruginosa w 1g lub 1ml.

Podanie dopochwowe 10

2

1

Nieobecność Pseudomonas

aeruginosa w 1g lub 1ml.

Nieobecność Staphylococcus

aureus w 1g lub 1ml.

Nieobecność Candida

albicans w 1g lub 1ml.

Systemy transdermalne

(wartość graniczna dla

plastra łącznie z warstwą

adhezyjną i zewnętrzną

warstwą nośną)

2

1

Nieobecność Staphylococcus

aureus w 1 plastrze.

Nieobecność Pseudomonas

aeruginosa w 1 plastrze.

Podanie wziewne

(specjalne wymagania

odnoszą się do płynnych

preparatów do

nebulizacji)

2

1

Nieobecność Staphylococcus

aureus w 1g lub 1ml.

Nieobecność Pseudomonas

aeruginosa w 1g lub 1ml.

Nieobecność bakterii Gram-

ujemnych, tolerujących żółć w

1g lub 1 ml.

Szczególne

postanowienia

Farmakopei dotyczące

doustnych postaci leku

zawierających surowce

pochodzenia naturalnego

(zwierzęcego, roślinnego

lub mineralnego), których

nie poddaje się wstępnej

obróbce zmniejszającej

liczbę drobnoustrojów i

dla których organ

upoważniony dopuszcza

użycie surowców o

TAMC powyżej 10

3

CFU

w 1g lub 1ml.

4

2

Nie więcej niż 10

2

CFU bakterii

Gram-ujemnych, tolerujących

żółć w 1g lub 1 ml.

Nieobecność Salmonella w 10 g

lub 10 ml.

Nieobecność Escherichia coli w

1g lub 1ml.

Nieobecność Staphylococcus

aureus w 1g lub 1ml.

Tabela 3.Kryteria akceptacji mikrobiologicznej dla niejałowych substancji do

celów farmaceutycznych [4].

TAMC

(CFU/g lub

CFU/ml)

TYMC

(CFU/g lub

CFU/ml)

Substancje do celów

farmaceutycznych

3

2

Ze względu na specyfikę produktów leczniczych roślinnych do podawania

doustnego opracowano odrębne kryteria, wyodrębniając 3 kategorie

produktów z uwzględnieniem dodawanych substancji pomocniczych, metod

przetwarzania, a także poddawania działaniu wrzącej wody. Kryteria

akceptacji dla poszczególnych kategorii produktów leczniczych roślinnych

do podawania doustnego przedstawiono w tabeli 4, 5 i 6 [4].

Tabela 4. Produkty lecznicze roślinne zawierające substancje roślinne, z

dodatkiem lub bez substancji pomocniczych, przeznaczone do

przygotowywania naparów i odwarów z użyciem wrzącej wody (np. zioła do

zaparzania z dodatkiem lub bez substancji poprawiających smak i zapach)

[4].

TAMC

Kryterium akceptacji: 10

7

cfu/g

Maksymalna dopuszczalna liczba:

50 000 000 cfu/g

TYMC

Kryterium akceptacji: 10

5

cfu/g

Maksymalna dopuszczalna liczba:

500 000 cfu/g

Escherichia coli Kryterium akceptacji: 10

3

cfu/g

Salmonella Nieobecność (25g)

Tabela 5. Produkty lecznicze roślinne zawierające np. wyciągi i/lub

substancje roślinne, z dodatkiem lub bez substancji pomocniczych, dla

których metoda wytwarzania (np. ekstrakcja) lub, jeżeli dotyczy, substancje

roślinne, dla których przeprowadzenie wstępnego postępowania, prowadzi

do obniżenia poziomu drobnoustrojów do niższego niż ustalony dla tej

kategorii [4].

TAMC

Kryterium akceptacji: 10

4

cfu/g lub

cfu/ml

Maksymalna dopuszczalna liczba: 50 000

cfu/g lub cfu/ml

TYMC

Kryterium akceptacji: 10

2

cfu/g lub

cfu/ml

mikrobiologiczne kosmetyków powinny obejmować określenie ogólnej

ilości bakterii tlenowych mezofilnych, oznaczenie ilości drożdży i pleśni oraz

wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i

Candida albicans. Dodatkowym badaniem, na podstawie, którego możliwa

jest ocena higieny procesu produkcji, jest wykrywanie obecności Escherichia

coli [5].

Oznaczanie ilości tlenowych bakterii mezofilnych jest wykonywane wg

normy PN–EN ISO 21149 : 2009 „Mikrobiologia. Zliczanie i wykrywanie

aerobic mesophilic bacteria”. Natomiast oznaczanie liczby drożdży i pleśni

wg normy PN–EN ISO 16212 : 2011 „Mikrobiologia. Oznaczanie liczby

drożdży i pleśni”. Według niniejszych norm badania te można wykonać

metodą z użyciem sączków membranowych oraz bezpośredniego posiewu

podobnie jak to miało miejsce podczas badań czystości mikrobiologicznej

niejałowych produktów leczniczych. Metoda z użyciem sączków

membranowych polega na przesączeniu przez sączek membranowy o

nominalnej wielkości porów 0,45 μm próbki odpowiadającej 1g lub 1ml

kosmetyku. W celu określenia ilości tlenowych bakterii mezofilnych sączek

należy umieścić na powierzchni agaru z hydrolizatem kazeiny i

soi. Natomiast w celu określenia ogólnej liczby drożdży i pleśni na

powierzchni agaru Sabouraud z dekstrozą z dodatkiem lub bez

chloramfenikolu, jako antybiotyku hamującego wzrost bakterii. Badanie

metodą bezpośredniego posiewu można wykonać na dwa sposoby metodą

płytek lanych oraz posiewu powierzchniowego. W tym celu należy

przygotować szereg rozcieńczeń badanej próby, odmierzyć po 1ml do Płytek

Petriego i dodać około 15-20 ml odpowiedniego podłoża agarowego bądź

rozprowadzić po powierzchni podłoży agarowych odmierzoną objętość

próbki. Następnie podłoża należy poddać stosownej inkubacji. Płytki z

agarem z hydrolizatem kazeiny i soi należy inkubować 72 +- 6 godzinach w

temperaturze 32,5 +- 2,

o

C. Natomiast płytki z podłożem Sabouraud z

dekstrozą należy inkubować 5-7 dni w temperaturze 22,5 do 27,

o C. Po

okresie inkubacji zlicza się wyrastające kolonie przeliczając wynik na cfu/ml

lub cfu/g [6,7].

Badania wykrywania obecności S.aureus, P.aeruginosa,

C.albicans oraz E.coli wykonywane są wg norm ISO, odpowiednio PN-EN ISO

22718 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Staphylococcus

aureus" , PN-EN ISO 22717 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie

obecności Pseudomonas aeruginosa” , PN-EN ISO 18416 : 2009

„Mikrobiologia. Wykrywanie Candida albicans” oraz PN-EN ISO 21150 : 2010

„Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Escherichia coli”. Pierwszy etap tych

badań polega na wzbogaceniu próbki z wykorzystaniem nieselektywnej

pożywki bulionowej. Ma to na celu wzrost liczby mikroorganizmów, przy

jednoczesnym uniknięciu ryzyka zahamowania wzrostu jakie wywołują

selektywne składniki pożywek wybiórczych/różnicujących. Drugi etap

badania (izolowanie) jest prowadzony na selektywnych pożywkach, na

których rośnie ograniczona ilość drobnoustrojów, a wzrost innych jest

hamowany. Badania wykrywania obecności określonych drobnoustrojów

mają na celu wykrycie w próbkach kosmetyków drobnoustrojów uznanych

za patogenne. Obecność któregokolwiek z tych drobnoustrojów ( S.aureus,

P.aeruginosa, C.albicans ) dyskwalifikuje skażony nimi kosmetyk. Natomiast

wykrywanie obecności E.coli ma na celu stwierdzenie, czy produkcja

badanego kosmetyku odbywała się w warunkach odpowiedniej czystości

mikrobiologicznej. Stwierdzenie obecności E.coli w produkcie uważa się za

skażenie mikroflorą kałową [8,9,10,11].

Badanie skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej

Obowiązujące wydanie Farmakopei Polskiej i Farmakopei Europejskiej

informuje o konieczności wykonywania badań skuteczności ochrony

przeciwdrobnoustrojowej. Badanie to jest szczegółowo omówione w

monografii farmakopealnej 5.1.3. Skuteczność ochrony

przeciwdrobnoustrojowej. Wyniki tego badania powinny się znaleźć w

pełnej dokumentacji badań mikrobiologicznych zarówno produktów

leczniczych jak i kosmetycznych [4].

Badanie skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej polega na

zmieszaniu preparatu z określonym inokulum odpowiednich

drobnoustrojów, pozostawienia zaszczepionego preparatu w odpowiedniej

temperaturze, a następnie pobrania próbki preparatu w ściśle określonych

odstępach czasu i oznaczenia liczby żywych komórek drobnoustrojów.

Właściwości konserwujące preparatu są odpowiednie, jeżeli w warunkach

badania po określonym czasie i w określonej temperaturze następuje w

zaszczepionym preparacie znaczący spadek lub nie dochodzi do wzrostu

liczby żywych komórek drobnoustrojów [4].

Pierwszym etapem badania skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej

jest przygotowanie inokulum. W tym celu należy posiać na powierzchnie

agaru z hydrolizatem kazeiny i soi (TSA) dla bakterii lub na powierzchnię

agaru Sabouraud z dekstrozą (SDA) bez dodatku antybiotyków dla grzybów,

świeżą hodowlę każdego z drobnoustrojów: Pseudomonas aeruginosa ATCC

9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Candida albicans ATCC 10231

oraz Aspergillus brasiliensis ATCC 16404. Dodatkowo można zastosować

drobnoustroje innych gatunków, które mogą reprezentować

prawdopodobne zanieczyszczenie preparatu, Escherichia coli ATCC 8739 (w

badaniu preparatów doustnych) oraz Zygosaccharomyces rouxii NCYC 381

(w badaniu preparatów doustnych zawierających duże ilości cukru).

Hodowle bakteryjne należy inkubować 18-24h w temperaturze 30- 35

o C,

Tabela 8. Preparatu do uszu, preparatu do nosa, preparaty do stosowania na

skórę i preparatu do inhalacji [4].

Log redukcji

2 dni 7 dni 14 dni 28 dni

Bakterie

A

B

BN

BN

Grzyby

A

B

BN

BN

BN – liczba zdolnych do życia drobnoustrojów nie zwiększa się w

porównaniu z poprzednim odczytem

Tabela 9. Preparaty doustne, preparaty do stosowania w jamie ustnej i

preparaty doodbytnicze [4].

Log redukcji

14 dni 28 dni

Bakterie 3 BN

Grzyby 1 BN

BN – liczba zdolnych do życia drobnoustrojów nie zwiększa się w

porównaniu z poprzednim odczytem

Kryterium A wyraża zalecaną skuteczność przeciwdrobnoustrojową. W

uzasadnionych przypadkach, gdy kryterium A nie może być przyjęte np. z

przyczyn zwiększonego ryzyka działań niepożądanych, musi być przyjęte

kryterium B. Środek konserwujący jest skuteczny, jeśli odpowiada kryteriom

dotyczącym odpowiedniej redukcji drobnoustrojów [4].

Badanie skuteczności ochrony przeciwdrobnoustrojowej produktów

kosmetycznych można także przeprowadzić metodą opisaną w ISO 11930

„Cosmetics – Microbiology – Evaluation of the antimicrobial protection of a

cosmetics product”. Niniejsza norma jest przeznaczona przede wszystkim

dla produktów kosmetycznych rozpuszczalnych w wodzie lub mieszających

się z wodą.

Podsumowanie

Dopuszczone do stosowania produkty lecznicze oraz kosmetyczne mogą

zawierać określoną liczbę drobnoustrojów i nie powinny zawierać

zdefiniowanych bakterii oraz grzybów. Obecność niektórych

drobnoustrojów może mieć wpływ na obniżenie lub nawet zniesienie

leczniczego działania preparatu. Ponadto posiada potencjalnie niekorzystne

działanie na zdrowie pacjenta. W związku z tym, wytwórcy preparatów

leczniczych oraz kosmetycznych powinni zapewnić jak najmniejszy poziom

zanieczyszczenia mikrobiologicznego końcowej postaci produktu poprzez

wprowadzenie aktualnych wytycznych Dobrej Praktyki Wytwarzania w

trakcie wytwarzania, przechowywania oraz dystrybucji.

Literatura

1. Parnowska W. Mikrobiologia farmaceutyczna. Problemy produkcji i kontroli leków. red. W.

Parnowska. Wyd. lekarskie PZWL. 1998, 13-28.

2. Szarmański A. Zrozumieć GMP. Polpharma S.A. 2007. 19, 1-3.
3. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 1.10.2008 r. w sprawie wymagań Dobrej Praktyki

Wytwarzania (Dz. U. 2008 nr 184 poz. 1143, z późn. zm.).

4. Farmakopea Polska IX Tom I, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne, 2011.
5. Starościak B.J. Badania mikrobiologiczne kosmetyków w świetle norm EN–PN ISO. Świat przemysłu

kosmetycznego. 2012. 3, 14-15.

6. PN-EN ISO 21149 : 2009 „Mikrobiologia. Zliczanie i wykrywanie aerobic mesophilic bacteria”.
7. PN-EN ISO 16212 : 2011 „Mikrobiologia. Oznaczanie liczby drożdży i pleśni”.
8. PN-EN ISO 22718 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus”.
9. PN-EN ISO 22717 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa”.
10. PN-EN ISO 18416 : 2009 „Mikrobiologia. Wykrywanie Candida albicans”.
11. PN-EN ISO 21150 : 2010 „Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Escherichia coli”.