Biochemia: skrypt do ćwiczeń laboratoryjnych, Skrypty z Inżynieria biochemiczna

Pobierz Biochemia: skrypt do ćwiczeń laboratoryjnych i więcej Skrypty w PDF z Inżynieria biochemiczna tylko na Docsity!

Skrypt do ćwiczeń laboratoryjnych

z BIOCHEMII

SPIS TREŚCI

• Regulamin ćwiczeń laboratoryjnych z Biochemii
• Literatura
• agarozowym 1. Izolacja plazmidowego DNA Escherichia coli metodą lizy alkalicznej oraz elektroforeza DNA w żelu
• 2. Elektroforeza białek i reakcje charakterystyczne aminokwasów
• 3. Chromatografia kolumnowa na żelu Sephadex G-
• 4. Oznaczanie aktywności kwaśnej fosfatazy w homogenacie z kiełków roślinnych
• 5. Hamowanie kompetycyjne i niekompetycyjne aktywności dehydrogenazy bursztynianowej
• 6. Chromatografia cienkowarstwowa i ilościowe oznaczanie cukrów
• 7. Lipidy
• Wzory

% uzyskanych punktów w stosunku do całkowitej ilości punktów możliwych do uzyskania ocena 0 - 50 2. 50,1- 60 3. 60,1- 70 3. 70,1- 80 4. 80,1- 90 4. 90,1- 100 5.

10. W przypadku nieobecności usprawiedliwionej Student ma obowiązek napisać sprawdzian z danego ćwiczenia w terminie ustalonym po konsultacji z Prowadzącym. Student nie otrzymuje punktów za sprawozdanie, a suma punktów liczona do oceny końcowej zostaje pomniejszona o 2p.
11. W przypadku nieobecności nieusprawiedliwionej Student nie ma możliwości napisania sprawdzianu z danego ćwiczenia i za ćwiczenie otrzymuje 0p. Suma punktów liczona do oceny końcowej nie zmienia się.
12. Podstawą zaliczenia przedmiotu na ocenę pozytywną jest uzyskanie minimum 50,1% możliwych punktów (uzyskanie min. oceny 3.0) oraz oddanie kompletu poprawnie wykonanych sprawozdań (zaakceptowanych przez Prowadzącego). Nie oddanie co najmniej jednego sprawozdania lub nie poprawienie błędnie wykonanego sprawozdania uniemożliwia zaliczenie przedmiotu na ocenę pozytywną.
13. Jeżeli Student nie otrzymał min. 50,1% punktów może przystąpić do kolokwium zaliczeniowego, obejmującego całość materiału (warunkiem przystąpienia do kolokwium zaliczeniowego jest oddanie kompletu poprawnie wykonanych sprawozdań). Termin kolokwium będzie ustalany przez Koordynatora zajęć. Uzyskanie min. 50,1% punktów z kolokwium zaliczeniowego jest równoznaczne z zaliczeniem przedmiotu na ocenę 3,0.
14. Zaliczenie przedmiotu na ocenę pozytywną uprawnia Studenta do przystąpienia do egzaminu końcowego z Podstaw Biochemii.
15. Po zakończonych zajęciach obowiązkiem każdego Studenta jest uporządkowanie stanowiska pracy.
16. Student może opuścić salę laboratoryjną tylko na wyraźną zgodę Prowadzącego. Opuszczając salę ćwiczeń Student powinien zdjąć fartuch laboratoryjny.
17. Wszelkie pytania dotyczące organizacji ćwiczeń proszę kierować do Koordynatora.

LITERATURA

Literatura pomocna w przygotowaniu się do zajęć laboratoryjnych:

1. Tymoczko J.L., Berg J.M., Stryer L., Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009 (lub wcześniejsze wydania pod redakcją L. Stryera, PWN, Warszawa, 1999, 2003)
2. Tymoczko J.L., Berg J.M., Stryer L., Biochemia Krótki Kurs, Wydawnictwo Naukowe PWN, 2013.
3. Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z biochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 200 5
4. red. Minakowski W, Weidner S., Biochemia kręgowców, wydanie II, Wydawnictwo naukowe PWN SA, Warszawa 1998 lub 2005.

Komórki bateryjne mogą zawierać dodatkowe, niewielkie cząsteczki DNA, nazywane plazmidami, które replikują się niezależnie od chromosomu. Mogą one występować w kilku (niskokopijne) lub w wielu (wysokokopijne) kopiach w komórce. Zazwyczaj zawierają one kilka genów, w tym gen (geny) warunkujący(e) oporność na antybiotyk(i). Plazmidy są często wykorzystywane w inżynierii genetycznej jako wektory w klonowaniu molekularnym. Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA przyjmującymi formę superhelisy (Rys. 1). Superzwinięta, kowalencyjnie zamknięta, kolista cząsteczka DNA nazywana jest formą CCC (ang. Covalently Closed Circular DNA ). Jeśli jedna z nici DNA zostanie przerwana, znikają superskręty i powstaje forma OC (ang. Open Circular ), natomiast w wyniku pęknięciu obu nici DNA w tym samym miejscu powstaje cząsteczka w formie liniowej L (ang. Linear ) plazmidu (Rys. 1). Rys. 1 Formy plazmidowego DNA. Izolacja plazmidowego i chromosomalnego DNA z komórek prokariotycznych i eukariotycznych wymaga zastosowania odmiennych technik. Obecnie istnieje wiele metod pozyskiwania DNA, których celem jest odseparowanie materiału genetycznego od innych składników komórki i jego ochrona przed degradacją przez enzymy komórkowe. Techniki oczyszczania DNA muszą być wystarczająco łagodne, aby nie spowodować uszkodzeń mechanicznych łańcucha polinukleotydowego DNA. Różnice w procedurach izolacji plazmidowego i genomowego DNA wynikają przede wszystkim z superzwinięcia plazmidowego DNA, jak również z różnych mas cząsteczkowych i konformacji DNA. Metody izolacji plazmidowego DNA są znane od ponad 35 lat i do dziś powstało ich kilkanaście. Mimo to większość z nich składa się z podobnych etapów: namnożenia bakterii, lizy komórek bakteryjnych i oczyszczania plazmidowego DNA. Najlepsze są te metody, które charakteryzują się dużą efektywnością, pozwalającą na uzyskanie czystego preparatu o wysokim stężeniu i pochłaniają stosunkowo niewiele czasu. Jednym z najbardziej popularnych sposobów izolacji plazmidowego DNA jest metoda lizy alkalicznej znana od 1979 roku (Birnboim i Doly, Nucleic Acids Res 1979;7:1513- 23 ). Metoda ta wykorzystuje fakt występowania plazmidowego DNA w formie superzwiniętej (CCC). W metodzie tej można wyróżnić trzy podstawowe etapy:  zawieszenie komórek w buforze obniżającym wytrzymałość ściany komórkowej i hamującym działanie DNaz;

 zniszczenie komórek, degradację RNA, odwracalną denaturację kwasów nukleinowych i nieodwracalną denaturację białek;  denaturację plazmidowego DNA oraz oddzielenie go od chromosomalnego DNA i wytrąconych białek. W pierwszej kolejności niszczy się ścianę komórkową, następnie doprowadza się do lizy komórek bakteryjnych poprzez dodanie do nich roztworu zawierającego detergent SDS (dodecylosiarczan sodu) i NaOH. SDS powoduje zniszczenie błon komórkowych i denaturację białek, natomiast wysokie pH (ok. 12) powoduje denaturację DNA do pojedynczych nici, przy czym forma CCC plazmidowego DNA jest nadal spleciona (nici podwójnej helisy nie oddalają się za bardzo od siebie). Obniżenie pH (neutralizacja) poprzez dodanie stężonego roztworu octanu potasu prowadzi do precypitacji, czyli wytrącania genomowego DNA, ponieważ w tych warunkach renaturacja tak długich fragmentów DNA nie jest możliwa (przypadkowa hybrydyzacja dwóch komplementarnych nici prowadzi do powstania strątów). Ponadto w tych warunkach następuje również precypitacja białek i RNA, które nie uległo hydrolizie z udziałem RNAzy obecnej w buforze do zawieszania komórek. Superzwinięty plazmidowy DNA bardzo szybko ulega renaturacji ze względu na bliskość komplementarnych nici, dlatego też pozostaje w roztworze. Odwirowanie próby umożliwia oddzielenie supernatantu zawierającego plazmidy od wytrąconego kompleksu. W celu pozbycia się pozostałych białek stosuje się ekstrakcję mieszaniną fenol: chloroform: alkohol izoamylowy lub wykorzystuje się wyłącznie chloroform. Plazmidowy DNA zagęszcza się poprzez wytrącenie 96% etanolem (tzw. precypitacja DNA). Uzyskany osad przepłukuje się 70% roztworem etanolu aby pozbyć się soli. Po odwirowaniu osad DNA rozpuszcza się w buforze TE, zawierającym EDTA, który chelatuje jony Mg2+ niezbędne do aktywności nukleaz degradujących DNA. Wyizolowany plazmidowy DNA zazwyczaj analizuje się wykorzystując elektroforezę w żelu agarozowym. Elektroforeza jest techniką wykorzystującą przemieszczanie się cząsteczek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym. Technika ta, wykorzystywana przez biochemików i biologów molekularnych od ponad 50 lat, jest szczególnie przydatna do rozdziału, charakterystyki, analizy i oczyszczania kwasów nukleinowych. Fragmenty DNA rozdzielone w żelu agarozowym można też wykorzystać na różnych etapach klonowania molekularnego, np. ligacji. Żele agarozowe stosuje się najczęściej w zakresie stężeń od 0,3% do 2%. Procentowość żelu dobiera się do wielkości rozdzielanych cząsteczek DNA. Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 500 pz (par zasad) zazwyczaj rozdziela się w żelach poliakryloamidowych. Najczęściej stosowanymi buforami w elektroforezie agarozowej są: TAE (ang. Tris-acetate-EDTA ), TBE (ang. Tris-borate-EDTA ), TPE (ang. Tris-phosphate- EDTA ). Próbę nanosi się w studzienki odpowiednio uformowanego żelu, który jest umieszczony w buforze do prowadzenia elektroforezy. Przed nałożeniem, próbę miesza się z tzw. buforem obciążającym, zwiększającym jej gęstość, dzięki czemu nie dyfunduje ona do buforu, w którym prowadzi się elektroforezę, lecz opada na dno studzienki. Dodatkowo bufor obciążający nadaje próbkom zabarwienie, umożliwiając obserwację ich migracji podczas rozdziału w żelu. Najczęstszym składnikiem buforów do nanoszenia jest błękit bromofenolowy, nadający niebieskie zabarwienie, a czynnikiem zwiększającym gęstość sacharoza lub glicerol.

2. R2: 0, 2 N NaOH, 1 % SDS UWAGA! Roztwór przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem.
3. R3: 3 M K+, 5 M CH3COO-
4. Chloroform
5. 96 % i 70 % roztwory etanolu
6. Bufor TE o składzie: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
7. Agaroza
8. TAE o składzie: 40 mM Tris-octan pH 8,0, 1 mM EDTA
9. Bufor obciążający do elektroforezy DNA o składzie: 0, 25 % błękit bromofenolowy, 40 % sacharoza
10. Wodny roztwór bromku etydyny (5 mg/ml)
11. Roztwór plazmidu wzorcowego

V. WYKONANIE ĆWICZENIA

Izolacja plazmidowego DNA

1. Osad z 3 ml hodowli bakteryjnej E. coli zawierających plazmid zawiesić w 0, l ml buforu R1.
2. Inkubować w lodzie przez 5 min.
3. Dodać 0,2 ml schłodzonego w lodzie roztworu R2.
4. Delikatnie wymieszać przez 3- 4 - krotne odwrócenie probówki.
5. Inkubować w lodzie przez 5 min.
6. Dodać 0,15 ml schłodzonego w lodzie roztworu R3.
7. Delikatnie wymieszać jak w p.5.
8. Inkubować w lodzie przez 5 min.
9. Odwirować przez 10 min w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach/min.
10. Przenieść supernatant do nowej probówki typu Eppendorf, osad wyrzucić.
11. Dodać równą objętość chloroformu.
12. Ekstrahować 2-3 min odwracając probówkę.
13. Próby odwirować przez 5 min w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach/min.
14. Zebrać górną fazę i przenieść do nowej probówki. Uważać, aby nie pobrać zdenaturowanych białek z interfazy.
15. Dodać 2-krotną objętość 96 % roztworu etanolu.
16. Dokładnie wymieszać przez 3- 4 - krotne odwrócenie probówki.
17. Inkubować przez 10 min w - 70°C.
18. Próbę odwirować w mikrowirówce przez 15 min. przy maksymalnych obrotach/min.
19. Supernatant odrzucić.
20. Osad zawierający DNA przemyć 1 ml 70 % roztworu etanolu.
21. Odwirować 10 min w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach/min.
22. Ostrożnie usunąć supernatant.
23. Osad wysuszyć i rozpuścić w 20 μl buforu TE.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

1. Przygotować aparat do elektroforezy.
2. Przygotować 1 % roztwór agarozy w buforze TAE (rozpuścić przez ogrzanie do wrzenia).
3. Do przestudzonego roztworu agarozy dodać bromek etydyny do stężenia 0,5 μg/ml.
4. Schłodzony do 45-50°C roztwór agarozy wlać do aparatu i pozostawić do zastygnięcia.
5. Do preparatu DNA dodać 4 μl buforu obciążającego.
6. 15 μl próbki nanieść w studzienkę żelu.
7. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny DNA przy napięciu 70 - 80V przez 30-40 min.
8. Oglądać żel w świetle UV. Uwaga! Bromek etydyny jest bardzo silnym środkiem mutagennym, wszystkie czynności powinny być wykonywane w rękawiczkach.

VI. WYNIKI I WNIOSKI - SPRAWOZDANIE

1. Temat ćwiczenia
2. Cel
3. Opisać wynik rozdziału elektroforetycznego plazmidowego DNA (zaznaczyć kierunek migracji DNA w żelu, biegun dodatni i ujemny; opisać poszczególne ścieżki, wskazać plazmid wzorcowy, opisać różne formy plazmidowego DNA plazmidu wzorcowego).
4. Zinterpretować obraz rozdziału elektroforetycznego plazmidowego DNA izolowanego na ćwiczeniach - wskazać formy plazmidowego DNA, które widoczne są na obrazie elektroforetycznym (uzyskany preparat DNA). Porównać rozdział i formy oczyszczonego na ćwiczeniach plazmidu z preparatem wzorcowym. Czy wyniki rozdziału preparatu DNA uzyskanego na ćwiczeniach i próby wzorcowej są zgodne? Czy występują artefakty (dodatkowe prążki, niewystępujące w próbie wzorcowej), dodatkowe plamy lub zanieczyszczenia? Jeśli tak to dlaczego?

W związku ze złożoną strukturą białek, wprowadzono pojęcie rzędowości ich struktury (Linderstrom- Lang, 1952). Liniowa sekwencja aminokwasów, czyli kolejność aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym jest nazywana pierwszorzędową strukturą białka. Struktura drugorzędowa odnosi się do regularnego pofałdowania rejonów łańcucha polipeptydowego. Najczęściej występującymi typami struktury drugorzędowej są helisa α i harmonijka β. Struktura trzeciorzędowa oznacza przestrzenne ułożenie wszystkich aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Odpowiada ona natywnej, biologicznie aktywnej konformacji białka. Struktura czwartorzędowa dotyczy białek zbudowanych z co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych i oznacza przestrzenne ułożenie podjednostek polipeptydowych oraz określa oddziaływania między nimi. Białka ze względu na swoją złożoną budowę, a przede wszystkim strukturę czwartorzędową, ulegają łatwo zmianom przestrzennym, wykazując allosteryczność. Allosteryczność odgrywa istotną rolę w przypadku katalizy enzymatycznej. Własności chemiczne wspólne wszystkim aminokwasom są uwarunkowane obecnością grupy karboksylowej i aminowej. Natomiast różnice w budowie łańcucha bocznego decydują o specyficznych własnościach fizykochemicznych i reaktywności aminokwasów. Dzięki temu niektóre aminokwasy dają charakterystyczne reakcje barwne, umożliwiające ich wykrywanie nawet w mieszaninie z innymi aminokwasami. Białka oprócz reakcji charakterystycznych dla łańcuchów bocznych wchodzących w ich skład aminokwasów mogą dawać specyficzne reakcje dzięki obecności wiązań peptydowych.

Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek

1. Reakcja na obecność cysteiny i cystyny – aminokwasy z grupami - SH (cysteina) lub S-S (cystyna) (zarówno w stanie wolnym, jak i związanym w białkach) podczas ogrzewania w środowisku silnie zasadowym, przekształcając się w kwas pirogronowy, uwalniają siarkę w postaci jonów siarczkowych. Jony siarczkowe reagują z jonami ołowiu, dając czarny osad siarczku ołowiu (PbS). Dodatkowym produktem reakcji jest amoniak. Metionina nie daje dodatniego wyniku tej reakcji.
2. Reakcja ksantoproteinowa - aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny (fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna) zarówno wolne, jak i związane w białku ulegają nitrowaniu podczas ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym. Żółte pochodne nitrowe w środowisku zasadowym tworzą sole o intensywnym zabarwieniu pomarańczowym.
3. Reakcja Hopkinsa i Cole'a - reakcja na obecność układu indolowego (w tryptofanie). W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami (np. kwasem glioksalowym) dając barwny produkt kondesacji. W kwaśnych hydrolizatach peptydów i białek wynik reakcji jest ujemny, ponieważ podczas kwaśnej hydrolizy tryptofan ulega zniszczeniu.
4. Reakcja na obecność histydyny - pierścień imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega sprzęganiu z jonem p-sulfobenzodiazoniowym. Produktem reakcji jest pomarańczowy barwnik azowy.
5. Reakcja ninhydrynowa - służy do wykrywania wolnych aminokwasów (peptydy i białka dają bardzo słaby odczyn). W pH>4 aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają najpierw utlenieniu a następnie dekarboksylacji i deaminacji. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka ninhydryny ulega kondesacji z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje charakterystyczny fioletowoniebieski produkt. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia aminokwasu. W przypadku

aminokwasów - proliny i hydroksyproliny, które nie zawierają grupy α aminowej produkt reakcji kondensacji ma barwę żółtą.

6. Reakcja biuretowa - pozwala na odróżnienie białek od aminokwasów. W środowisku zasadowym następuje tautomeryzacja grup przy wiązaniu peptydowym (-CO-NH-  - C(OH)=N-). Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jony miedziowe tworzą kompleksy o barwie fioletowej. Wolne aminokwasy tworzą również kompleksy z jonami miedziowymi, ale produkty takiej reakcji mają barwę niebieską.

Elektroforeza białek

Dzięki obecności grup dysocjujących aminokwasy i białka posiadają ładunek elektryczny, co jest podstawą ich rozdziału w procesie elektroforezy. Elektroforeza polega na ruchu naładowanych cząsteczek umieszczonych w polu elektrycznym w środowisku przewodzącym w kierunku odpowiednich elektrod. Szybkość migracji białka w polu elektrycznym zależy od natężenia pola elektrycznego, wypadkowego ładunku cząsteczki i współczynnika tarcia. Elektroforezę białek można przeprowadzić w żelach poliakryloamidowych (ang. PAGE- PolyAcrylamide Gel Electrophoresis ), które działają jak sito molekularne. Cząsteczki o wymiarach małych w stosunku do wielkości porów żelu migrują łatwo, natomiast bardzo duże cząsteczki pozostają prawie nieruchome. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) umożliwia rozdział białek na podstawie różnic w ich masach cząsteczkowych. Białka przed naniesieniem w studzienki żelu denaturuje się poprzez dodanie SDS-u i czynnika redukującego. SDS (sól sodowa siarczanu dodecylu) jest anionowym detergentem, który zrywa prawie wszystkie wiązania niekowalencyjne występujące w białku oraz wiąże się z białkami nadając im wypadkowy ładunek ujemny, proporcjonalny do masy cząsteczkowej. Wiązania dwusiarczkowe są zrywane dzięki działaniu czynnika redukującego (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Ruchliwość elektroforetyczna jest liniowo odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy: białka o mniejszej masie cząsteczkowej migrują szybciej. Najczęściej stosowaną metodą detekcji białek w żelach poliakryloamidowych jest barwienie kwaśnym alkoholowym roztworem Coomassie Brilliant Blue R-250. Zastosowanie kwaśnego alkoholowego roztworu powoduje utrwalenie białek w żelu, co zapobiega ich wymywaniu. W wiązaniu barwnika z białkami uczestniczą wiązania van der Waalsa i wiązania jonowe. Dzięki tej metodzie można wykryć 0,1-1 μg białka. Znacznie czulszą metodą jest barwienie przy użyciu AgNO 3. SDS-PAGE jest szeroko stosowaną techniką rozdziału białek. Można ją stosować m. in. do badania czystości preparatu lub wyznaczania masy cząsteczkowej białek.

III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE

1. Aparat do elektroforezy poliakryloamidowej białek z kompletem szklanych płytek, przekładek i grzebieniem
2. Zasilacz prądu stałego
3. Plastikowe pudełko do barwienia żelu
4. Mikropipety automatyczne: 20 - 200 μl, 2-20 μl, 20-200 μl, 200 - 1000 μl (1 komplet / grupa / stanowisko do przygotowania żelu).

19. 2 % roztwór octanu ołowiawego
20. Roztwór kwasu glioksalowego w 2, 5 % kwasie octowym
21. 5 % roztwór azotynu sodu
22. 1 % roztwór kwasu sulfanilowego w 1 N HCl
23. 10 % roztwór węglanu sodu

V. WYKONANIE ĆWICZENIA

Elektroforeza białek

Przygotowanie żelu poliakryloamidowego Przygotować żel rozdzielający, dolny: wymieszać roztwory wg Tabeli 2 i wlać mieszaninę między szklane płytki (katalizatory polimeryzacji: nadsiarczan amonu i TEMED dodać tuż przed wlaniem mieszaniny między płytki szklane). Roztworu powinno być tyle, aby pozostało miejsce na grzebień i żel górny (ok. 1 cm wysokości). Na żel nawarstwić ostrożnie 0,2-0,5 ml wody (aby uniemożliwić dostęp tlenu - inhibitora polimeryzacji) i pozostawić do polimeryzacji na ok. 10-15 min. W tym czasie przygotować żel zagęszczający, górny wg Tabeli 3 (nadsiarczan i TEMED dodać tuż przed wlaniem żelu między płyty). Tabela 2. Skład żelu rozdzielającego (dolnego). Składnik Ilość H 2 O 3,3 ml 30 % roztwór akryloamidów 4,0 ml l ,5 M Tris (pH 8,8) 2,5 ml 10 % SDS 0,1 ml 10 % nadsiarczan amonu 0,1 ml TEMED 0,004 ml Tabela 3. Skład żelu zagęszczającego (górnego). Składnik Ilość H 2 O 3,4 ml 30 % roztwór akrylamidów 0,83 ml 1M Tris (pH 6,8) 0,63 ml 10 % SDS 0,05 ml 10 % nadsiarczan amonu 0,05 ml TEMED 0,005 ml Po spolimeryzowaniu żelu dolnego wodę należy usunąć i wlać roztwór żelu górnego. Natychmiast włożyć grzebień tak, aby nie pozostawić pęcherzy powietrza w żelu. Po spolimeryzowaniu żelu wyjąć grzebień i umieścić płyty w aparacie do elektroforezy. Górny i dolny zbiornik aparatu wypełnić buforem elektrodowym (1x stężonym). Aparat podłączyć do zasilacza (górny zbiornik do katody [-], dolny do anody [+]). Po

przepłukaniu studzienek buforem elektrodowym nanieść przygotowane wcześniej próby (objętość ustalić z prowadzącym ćwiczenie). Przygotowanie prób do elektroforezy i rozdział elektroforetyczny Do próby (osad, ekstrakt bakteryjny lub oczyszczone białko) dodać równą objętość buforu do lizy (2x stężony), probówkę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Próby odwirować (5.000 obr./min, 30 sec) i nanieść do studzienek w żelu. Włączyć zasilacz i prowadzić rozdział elektroforetyczny przy 100 V do momentu, gdy czoło barwnika znajdzie się na granicy żelu górnego i dolnego. Następnie zwiększyć napięcie do 150- 180 V. Elektroforezę zakończyć, gdy barwnik będzie znajdował się przy końcu żelu. Wizualizacja białek rozdzielonych w żelu poliakryloamidowym roztworem Coomassie Brilliant Blue R- 250 Żel inkubować z wytrząsaniem w roztworze Coomassie przez ok. 30 min. Następnie żel odbarwiać w roztworze metanol : kwas octowy : H 2 O (w stosunku obj. 2:1:7) do uzyskania wyraźnych prążków. W odbarwiaczu można umieścić kawałek gąbki, która będzie pochłaniała barwnik.

Reakcje charakterystyczne aminokwasów

a. Reakcja na obecność cysteiny i cystyny Do sześciu ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno po 100 μl roztworów: (1) cystyny, (2) cysteiny, (3) glicyny, (4) żelatyny, (5) plazmy krwi oraz (6) próby X, a następnie do wszystkich probówek dodać po 4 krople 6N NaOH i po kropli octanu ołowiawego. Ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. b. Reakcja na obecność pierścienia aromatycznego (ksantoproteinowa) Do ośmiu ponumerowanych probówek odmierzyć po 2 krople stężonego kwasu azotowego, a następnie dodać po 100 μl roztworów (1) glicyny, (2) fenyloalaniny, (3) tyrozyny, (4) tryptofanu, (5) cysteiny, (6) żelatyny, (7) plazmy krwi oraz (8) próby X. Probówki ogrzewać nad palnikiem do chwili wydzielania się brązowych par tlenku azotu (OSTROŻNIE, otwór probówki skierować od siebie). Po ostygnięciu do każdej probówki dodać powoli kroplami, mieszając, po około 1,5 ml 6N roztworu NaOH (OSTROŻNIE reakcja egzotermiczna!). c. Reakcja na obecność tryptofanu (Hopkins’a i Cole’a) Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyć po 200 μl roztworów: (1) glicyny, (2) tryptofanu, (3) żelatyny, (4) plazmy krwi oraz (5) próby X. Do wszystkich probówek dodać po 2 krople roztworu kwasu glioksalowego, a następnie do każdej probówki dodawać ostrożnie stężony kwas siarkowy po ściance próbówki, nie mieszając. Objętość dodanego kwasu powinna być zbliżona do objętości roztworu wodnego w probówce. Należy zwrócić uwagę na zabarwienie na granicy obu warstw. d. Reakcja na obecność histydyny Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 μl roztworów: (1) glicyny, (2) histydyny, (3) żelatyny (4) plazmy krwi oraz (5) próby X. Do wszystkich probówek dodać po 100 μl świeżo przyrządzonej mieszaniny równych objętości roztworu azotynu sodu i roztworu kwasu sulfanilowego, a następnie po 200 μl roztworu węglanu sodu.

Próba X zawiera……………………………………..

3. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU SEPHADEX G- 75

I. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:

1. Technika chromatografii kolumnowej (formowanie i równoważenie kolumny, nanoszenie próby, rozwijanie chromatogramu, regulacja przepływu rozpuszczalników).
2. Sączenie molekularne: charakterystyka żeli typu Sephadex, inne rodzaje żeli filtracyjnych m.in. Sepharose, Sephacryl, mechanizm sączenia molekularnego, pojęcia charakteryzujące stosowaną w doświadczeniu kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielanych związków (Vt, V 0 , Vi, Vg, Ve, Kd, Kav), zastosowanie metody sączenia molekularnego.
3. Inne rodzaje metod chromatograficznych (chromatografia jonowymienna, powinowactwa, oddziaływań hydrofobowych i fazy odwróconej): mechanizm oraz zalety i ograniczenia każdej z chromatografii.
4. Budowa związków rozdzielanych na żelu Sephadex G-75 (Blue Dextran, cytochrom c, dwuchromian potasu).
5. Dokładna znajomość części doświadczalnej oraz umiejętność sprawnego przeliczania stężeń.

II. WSTĘP

Chromatografia na żelu Sephadex, określana też jako sączenie molekularne, jest techniką umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową. Sephadex jest handlową nazwą preparatu uzyskiwanego przez wytworzenie wiązań poprzecznych pomiędzy łańcuchami dekstranu. Preparaty żelu, mające postać granulek o średnicy 10-300 μm w zależności od stopnia usieciowania, różnią się zdolnością wchłaniania wody, co służy za kryterium ich podziału i decyduje o rozdzielczych właściwościach żelu. Separacja makrocząsteczek przy zastosowaniu techniki filtracji żelowej polega na wykorzystaniu porowatej struktury ziaren żelu oraz zjawiska dyfuzji, któremu podlegają zarówno molekuły solwentu, jak i separowane makromolekuły. Duże cząsteczki takie jak np. Blue Dextran, które są większe niż pory napęczniałych ziaren żelu nie mogą penetrować do ich wnętrza, a więc przechodzą wyłącznie poprzez fazę wodną złoża i są eluowane jako pierwsze. Mniejsze cząsteczki z kolei wnikają w rożnym stopniu do wnętrza ziaren (w zależności od swego kształtu i rozmiaru) i są eluowane w kolejności zmniejszania się ich masy cząsteczkowej (tj. w pierwszej kolejności eluowane będą cząsteczki o największej masie/kształcie/rozmiarze, następnie średnim a na końcu najmniejszym). Charakteryzując kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielonych substancji, stosuje się następujące pojęcia:  objętość swobodna (zerowa) (V 0 ) – objętość rozpuszczalnika znajdującego się pomiędzy ziarnami żelu  objętość wewnętrzna (Vi) - objętość rozpuszczalnika wypełniającego ziarna żelu  objętość matrycy żelu (Vg)  objętość całkowita złoża (Vt) Vt= V 0 +Vi+Vg oraz  objętość elucyjna (Ve), charakterystyczna dla danej substancji.