budowa i właściwości aminokwasów, Publikacje z Chemia

Pobierz budowa i właściwości aminokwasów i więcej Publikacje w PDF z Chemia tylko na Docsity! BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI AMINOKWASÓW 1.1. Aminokwasy białkowe Aminokwasy są związkami organicznymi, zawierającymi co najmniej jedną grupę karboksylową COOH oraz co najmniej jedną grupę aminową NH2. W zależności od położenia grupy aminowej względem karboksylowej wyróżniamy α- , β-, i γ-aminokwasy. W przyrodzie występuje ponad 300 różnych aminokwasów, ale tylko 20 z nich wchodzi w skład białek. Wszystkie aminokwasy białkowe są α-aminokwasami (tzn. grupa aminowa występuje przy pierwszym atomie węgla oznaczonym jako α). Wyjątek stanowi prolina. Ogólna struktura chemiczna a-aminokwasów została przedstawiona na rys. 1.1. Wśród białkowych aminokwasów tylko glicyna (R = H) jest achiralna. Wszystkie pozostałe aminokwasy mają cztery różne podstawniki przy węglu α (asymetrycznym), są zatem cząsteczkami chiralnymi, mogącymi występować jako enancjomery L i D, które są fizycznie i chemicznie nierozróżnialne, z wyjątkiem różnic w kierunku skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego. Większość białkowych aminokwasów należy do szeregu aldehydu L-glicerynowego. D-aminokwasy (nieprzyswajalne przez organizmy) występują w stanie wolnym w ścianie komórkowej bakterii oraz w antybiotykach peptydowych. Synteza chemiczna prowadzi do powstawania racematów, czyli mieszanin o jednakowej zawartości stereoizomerów L i D. Mieszanina taka me skręca płaszczyzny światła spolaryzowanego w wyniku kompensacji obu skręcalności. α-aminokwasy wykazują właściwości amfoteryczne (zachowują się jak kwasy i jak zasady). W roztworach wodnych występuje równowaga kwasowo-zasadowa aminokwasów (rys. 1.2). Sumaryczny ładunek cząsteczki aminokwasu zależy od pH środowiska. Wartość pK grup ulegających dysocjacji można wyznaczyć z krzywej miareczkowania. W punkcie izoelektrycznym pI dla danego aminokwasu maksymalna liczba jego cząsteczek występuje w postaci jonów obojnaczych (sumaryczny ładunek równa się zeru). Wartości pI dla większości aminokwasów białkowych są bliskie 6. Wyższe pI mają aminokwasy zasadowe: arginina — 10,76; histydyna — 7,59 i lizyna — 9,74, natomiast aminokwasy kwasowe charakteryzują się mniejszymi wartościami pI: kwas asparaginowy — 2,77; kwas glutaminowy — 3,22. Stosuje się różne kryteria klasyfikacji aminokwasów. Biorąc pod uwagę budowę łańcuchów bocznych, aminokwasy można podzielić na: alifatyczne obojętne, alifatyczne hydroksyaminokwasy, siarkowe, zasadowe, kwasowe i ich monoamidy oraz aminokwasy z pierścieniem aromatycznym. Poza wymienionymi grupami podziału znajduje się pozbawiona łańcucha bocznego glicyna. 1.1.1. Aminokwasy alifatyczne obojętne Do tej grupy należą: alanina, walina, leucyna, izoleucyna oraz prolina, których wzory strukturalne przedstawione są na rys. 1.3. Aminokwasy te zawierają alifatyczny, niepolarny, a zatem hydrofobowy łańcuch boczny (R). 1.1.2. Alifatyczne hydroksyaminokwasy Alifatyczne hydroksyaminokwasy to seryna i treonina (rys. 1.4). Ich łańcuchy boczne są neutralne (pozbawione ładunku) i polarne dzięki obecności grupy hydroksylowej. 1.1.3. Aminokwasy siarkowe Do aminokwasów siarkowych (rys. 1.5) należą: cysteina (zawierająca grupę tiolową SH) i metionina (zawierająca grupę tiometylową SCH3). Cysteina pod wpływem łagodnych czynników utleniających dimeryzuje do cystyny (Cys)2 z utworzeniem wiązania disiarczkowego. 1.1.4. Aminokwasy zasadowe Aminokwasami zasadowymi (rys. 1.6) są: lizyna (zawierająca na końcu łańcucha bocznego grupę aminową), arginina (zawierająca grupę guanidynową) oraz histydyna (mająca silnie zasadowy pierścień imidazolowy). Odczynniki i aparatura 1) 1% roztwory aminokwasów: glicyny (Gly), cystyny ([Cys]2), fenyloalaniny (Phe), tyrozyny (Tyr), tryptofanu (Trp), histydyny (His), argininy (Arg); 2) 1% roztwór białka (albuminy lub kazeiny); 3) 0,2M bufor fosforanowy pH 6,0; 4) 6M NaOH; 5) 10% NaOH; 6) 1% α-naftol w etanolu; 7) l% NaBrO; 8) 20% kwas trichlorooctowy (TCA); 9) HNO3 stężony; 10) H2SO4 stężony; 11) 0,5% roztwór CuSO4; 12) 2% roztwór octanu ołowiu(H) (Uwaga! Silna trucizna!); 13) odczynnik Miliona: 10 g rtęci metalicznej rozpuścić w 14 ml stężonego HNO3 i rozcieńczyć dwukrotną objętością wody (Uwaga! Silna trucizna!); 14) roztwór kwasu glioksalowego: roztwór a - 1g pyłu magnezowego zalać 20 ml wody; roztwór b — 2,5 g kwasu szczawiowego rozpuścić w 25 ml wody; w celu sporządzenia roztworu kwasu glioksalowego należy do roztworu b wlać roztwór a, po czym ochłodzić, przesączyć, dodać 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i dopełnić wodą do 100 ml; 15) 5% roztwór NaNO2; 16) 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1 M HC1; 17) 10% roztwór Na2CO3; 18) 1% roztwór ninhydryny w etanolu (96%); 19) probówki chemiczne 20 ml (20 szt.); 20) pipety serologiczne o pojemności 5 ml (2 szt.); 21) łaźnia wodna ze statywem do probówek; 22) mikropalnik; 23) łapy drewniane (2 szt.). A. Reakcja z ninhydryną Ninhydryna (wodzian triketohydryndenu) w reakcji z amoniakiem i aminami (również z białkami) daje produkty barwne (rys. 1.11). W przypadku reakcji z α-aminokwasami istotną rolę odgrywa grupa karboksylową. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu. W roztworach o pH wyższym niż 4, amoniak reaguje dalej z ninhydryną i z utworzoną hydryndantyną, dając związek o barwie fioletowe (purpura Rühemana), której natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Reakcja ta znalazła liczne zastosowania zarówno w próbach jakościowych jak i w metodach ilościowego oznaczania aminokwasów. Dodatni wynik reakcji z ninhydryną (oprócz aminokwasów, peptydów i białek) dają także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Z tego względu oznaczana próba musi być wolna od tych związków. Wykonanie Do probówki należy odpipetować 1 ml buforu fosforanowego o pH 6, dodać 5 kropli roztworu badanego, 2 krople roztworu ninhydryny i ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Wykonać próby z roztworem dowolnego aminokwasu, białka i z wodą destylowaną. Zanotować wyniki. B. Reakcja z kwasem azotowym(III) Aminokwasy wydzielają azot cząsteczkowy w reakcji z kwasem azotowym(III) w wyniku deaminacji (rys. 1.12). Reakcję tę wykorzystuje się w gazometrycznej metodzie ilościowego oznaczania α-aminokwasów metodą van Slyke'a. Wykonanie Do 2 ml 10% roztworu NaNO2 dodać 2 ml 2 M roztworu CH3COOH i 0,5 ml 0,5% roztworu glicyny. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o powstawaniu azotu cząsteczkowego. 1.2.2. Reakcje charakterystyczne niektórych aminokwasów A. Reakcja na obecność aminokwasów siarkowych Związki posiadające grupy sulfhydrylowe (utlenione lub zredukowane), jak cysteina i cystyna, ogrzewane w środowisku zasadowym ulegają rozkładowi, a powstały anion siarczkowy daje z solami ołowiu(II) czarny lub szary osad siarczku ołowiu(II). Metionina, której atom siarki uczestniczy w utworzeniu wiązania tioeterowego, nie daje tej reakcji. Schematyczny przebieg reakcji cysteiny z jonami ołowiu(II) przedstawiono na rys. 1.13. Wykonanie Do 2 kropli roztworu badanego dodać 4 krople 6 M NaOH i 1 kroplę roztworu (CH3COO)2Pb. Próbkę podgrzać. Wykonać próby z roztworami: a) cystyny, b) innego aminokwasu, c) białka. Zanotować wyniki. B. Reakcja ksantoproteinowa na obecność pierścienia benzenowego Pierścienie benzenowe różnych związków ulegają nitrowaniu (rys. 1.14) pod wpływem tzw. mieszaniny nitrującej (stężony kwas azotowy i stężony kwas siarkowy w stosunku 1:3). Produkty nitrowania mają barwę od jasnożółtej do brązowej, znacznie intensywniejszą po zalkalizowaniu próby. Reakcja zachodzi z różną szybkością i wydajnością w zależności od budowy związku i warun¬ków reakcji. Tyrozyna, tryptofan i białka zawierające te aminokwasy ulegają łatwo nitrowaniu, natomiast fenyloalanina-wymaga intensywnego ogrzewania. Wykonanie Do około 0,5 ml roztworu badanego dodać 2 krople stężonego kwasu azotowego i 6 kropli stężonego kwasu siarkowego. Mieszaninę ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej, a następnie ostudzić i ostrożnie dodać 2 ml 6 M roztworu NaOH (wlot probówki skierować pod wyciąg). Gdyby zabarwienie nie wystąpiło, reakcję powtórzyć, ogrzewając próbę w płomieniu mikropalnika do momentu pojawienia się brązowych par tlenków azotu (kilka minut). Wykonać próby z roztworami: tyrozyny, tryptofanu, glicyny i białka. Zanotować wyniki. C. Reakcja Miliona na obecność fenoli Związki zawierające grupy fenolowe tworzą w środowisku kwasu azotowego w temperaturze 40°C czerwone kompleksy nitrofenoli z jonami rtęci(II) i rtęci(I). Jest to reakcja charakterystyczna dla monofenoli, a więc spośród aminokwasów tylko dla tyrozyny. Służy do ilościowego oznaczania tyrozyny metodą fotometryczną. Wykonanie Do 4 kropli roztworu badanego dodać 2 krople odczynnika Miliona i ogrzać w łaźni wodnej. Wykonać próby z roztworami: tyrozyny, innego aminokwasu i białka. Zanotować wyniki. D. Reakcja Hopkinsa i Cole na obecność tryptofanu Pochodne indolu tworzą w środowisku kwaśnym barwne produkty kondensacji. Hopkins i Cole zastosowali do tej reakcji kwas glioksalowy (OHC—COOH). W obecności kwasu glioksalowego dwa pierścienie indolowe tryptofanu ulegają kondensacji z aldehydem, dając barwny produkt. Wykonanie Do 5 kropli badanego roztworu dodać 2 krople roztworu kwasu glioksalowego, a następnie wprowadzić ostrożnie po wewnętrznej ściance probówki około 0,5 ml stężonego kwasu siarkowego w taki sposób, aby nie wymieszać kwasu z roztworem wodnym. W obecności pochodnych indolu na granicy faz powstanie fioletowe zabarwienie. Wykonać próby z roztworami: tryptofanu, innego aminokwasu i białka. Zanotować wyniki. E. Reakcja Pauly'ego na obecność histydyny Pochodne imidazolu, jak również fenole i aminy aromatyczne, dają z solami diazoniowymi w środowisku zasadowym barwne produkty sprzęgania. Pauly zastosował w tym celu kwas diazobenzenosulfonowy, który przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem przez diazowanie kwasu sulfanilowego kwasem azotowym(III) na zimno. Histydyna, tyrozyna i białka dają w reakcji Pauly'ego jednakowe, krwistoczerwone zabarwienie.