Chemia Lipidów i Białek, Prezentacje z Chemia

Pobierz Chemia Lipidów i Białek i więcej Prezentacje w PDF z Chemia tylko na Docsity! 1 Instrukcje do ćwiczeń Chemia Lipidów i Białek Laboratorium Specjalizacja CHEMIA ŻYWNOŚCI I rok CHEMII II stopnia Opracowanie dr hab. Agnieszka Wojtkielewicz, dr Agnieszka Hryniewicka Białystok 2015 2 Wymagania AMINOKWASY i BIAŁKA (ćw.1 i 2) 1. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne (w tym reakcje charakterystyczne) aminokwasów. 2. Budowa, podział, właściwości fizyczne i chemiczne białek. 3. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych. LIPIDY I (ćw. 3 i 4) 1. Budowa oraz właściwości fizyczne i chemiczne kwasów tłuszczowych i triacylogliceroli: a) reakcja hydrolizy b) reakcja autooksydacji c) reakcja uwodornienia d) addycja halogenów 2. Proces jełczenia. Liczba kwasowa i nadtlenkowa – wyznaczanie i zastosowanie 3. Metody izolacji tłuszczów. LIPIDY II (ćw. 5, 6, 7) 1. Definicja, budowa, podział lipidów ze szczególnym uwzględnieniem steroidów 2. Liczba jodowa – wyznaczanie i zastosowanie. 3. Zmydlanie tłuszczów. Mydła i detergenty – budowa i działanie. 4. Budowa i rola biologiczna cholesterolu 5 5. Wykrywanie pierścienia indolowego w tryptofanie W środowisku kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami, między innymi z kwasem glioksalowym lub aldehydem mrówkowym dając barwne produkty kondensacji. Do trzech probówek odmierzyć kolejno po 1 ml roztworów: tryptofanu, glicyny, albuminy, następnie dodać 0,5 ml formaliny i wymieszać. Do każdej probówki dodać powoli po ściance lekko pochylonej probówki – 1 ml stężonego H2SO4 (nie wstrząsać!) i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Pojawienie się ciemnoczerwono-brunatnego pierścienia na granicy faz oznacza dodatni wynik na obecność tryptofanu. 6. Reakcja biuretowa Biuret (dimocznik, H2N-CO-NH-CO-NH2) tworzy w środowisku zasadowym fioletowy kompleks z solami miedzi(II). Reakcja ta jest charakterystyczna dla związków zawierających więcej niż jedno wiązanie peptydowe w cząsteczce (peptydy i białka). Do suchej probówki nr 1 wsypać szczyptę mocznika, ogrzać nad palnikiem gazowym. Mocznik topi się, a następnie rozkłada. Po skrzepnięciu otrzymanej masy probówkę należy ochłodzić i dodać około 1 ml wody destylowanej. Poczekać aż skrzepnięta masa się rozpuści, do kolejnych dwóch probówek dodać po 1 ml roztworów: albuminy oraz glicyny. Do roztworów: biuretu (probówka nr 1), albuminy i glicyny dodać po 1 ml roztworu NaOH, wymieszać starannie, wkraplać wodny roztwór siarczanu miedzi(II), w wyniku czego powstaje związek kompleksowy o fioletowym zabarwieniu. W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich obserwacji i schematu reakcji. 6 Ćwiczenie 2 Oznaczanie i właściwości fizykochemiczne białek. Enzymy. 1. Oznaczanie kazeiny w metodą formylkową Wolkera Sprzęt: kolba stożkowa 100 ml pipety biureta 50 ml Odczynniki: mleko (śmietanka lub jogurt) 10 ml formaldehyd, roztwór 20% (v/v) 0,1 M roztwór NaOH fenoloftaleina, roztwór alkoholowy 2% W I etapie oznaczenia zobojętnia się próbkę roztworem wodorotlenku sodu wobec fenoloftaleiny (do pH > 8,3). Zobojętnieniu ulegają wówczas wolne grupy -aminowe aminokwasów w łańcuchu białkowym. W II etapie oznaczenia dodaje się formaldehyd, który blokując grupy -aminowe lizyny (przemiana grup –NH2 do –N=CH2) powoduje uwalnianie z nich jonów H + . Uwolnione jony H + odmiareczkowuje się roztworem wodorotlenku sodu. Do kolby stożkowej odmierzyć pipetą 10 ml mleka (śmietanki lub jogurtu), dodać 0,5 ml fenoloftaleiny (12 kropli) i miareczkować 0,1 M roztworem NaOH do uzyskania lekko różowego zabarwienia. Następnie dodać 2 ml formaldehydu i miareczkować ponownie 0,1 M roztworem NaOH do momentu uzyskania lekko różowego zabarwienia próbki, utrzymującego się przez 30 sekund. Procentową zawartość kazeiny w mleku (X) obliczyć wg wzoru: gdzie: 1.57 – współczynnik przeliczeniowy dla kazeiny, VNaOH – objętość NaOH zużytego do miareczkowania po dodaniu formaldehydu [ml]. 2. Denaturacja białek Sprzęt: probówki Odczynniki: roztwór albuminy 1% roztwór FeCl3 2% roztwór Pb(CH3COO)2 2% roztwór CuSO4 1% roztwór kwasu octowego NaCl etanol 96% 7 a) Strącanie białek za pomocą kationów (soli metali ciężkich) Do 3 probówek zawierających po 2 ml roztworu albuminy o pH zasadowym dodać po 15 kropli: - 1% roztworu FeCl3 (do pierwszej probówki), - 2% roztworu Pb(CH3COO)2 (do drugiej probówki), - 2% roztworu CuSO4 (do trzeciej probówki). Obserwować strącający się osad. b) Denaturacja cieplna Do 1 ml roztwory albuminy dodać 1 kroplę 1% roztworu kwasu octowego i ogrzewać do wrzenia. Tworzy się biały kłaczkowaty osad, który staje się wyraźny po dodaniu niewielkiej ilości (około 6 kropli) roztworu NaCl. c) Działanie alkoholu Do dwóch probówek nalać po 1 ml roztworu albuminy i dodać po 2 ml 96% etanolu. Sprawdzić rozpuszczalność osadu otrzymanego w pierwszej probówce w wodzie, przez dodanie ok. 5 ml wody i wstrząśnięcie probówki. Po około 40 min. sprawdzić rozpuszczalność osadu tylko w drugiej probówce. 3. Enzymy Sprzęt: probówki pipetki plastikowe tarka, nóż zlewka Odczynniki: 3% nadtlenku wodoru H2O2 (czyli wody utlenionej) 0,3% nadtlenku wodoru H2O2 0,5% pirogalol sok z ziemniaka sok z korzenia imbiru lub chrzanu a) Wykrywanie obecności katalazy w ziemniaku Przygotować dwie probówki. Do pierwszej nalać 1 ml 3% roztworu H2O2, a następnie dodać kilka kropli wyciśniętego soku z ziemniaka. Katalaza ziemniaka powoduje szybki rozkład 1 0 MKOH – masa molowa wodorotlenku potasu (56,1 mg/mmol) m – masa tłuszczu [g] Oznaczanie liczby nadtlenkowej (wg normy PN-ISO 3960) Liczba nadtlenkowa LOO oznaczana dla tłuszczu informuje o zawartości w próbce pierwotnych produktów utlenienia lipidów, tj. wodoronadtlenków. Liczba nadtlenkowa jest to ilość cm 3 mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 kg tłuszczu. Ilość nadtlenków w próbce, która utlenia jodek potasu w warunkach oznaczenia, wyraża się jako miliekwiwalenty aktywnego tlenu zawarte w kilogramie tłuszczu [mEq O/kg tłuszczu] dokładnie w chwili pomiaru. Badane tłuszcze stałe podgrzać do temperatury nieco wyższej od punktu zestalenia. Odważyć 2 g tłuszczu do kolby stożkowej i dodać 10 ml chloroformu, rozpuścić przez mieszanie. Dodać 15 ml CH3COOH lodowatego oraz 1 ml nasyconego KI. Kolbę natychmiast zamknąć korkiem, mieszać 1 minutę, a następnie odstawić w ciemne miejsce na 5 minut. Dodać 75 ml wody i 5 kropli roztworu skrobi. Zawartość kolby natychmiast miareczkować roztworem tiosiarczanu sodu do uzyskania odbarwienia trwającego co najmniej pół minuty. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu). Liczbę nadtlenkową, wyrażoną w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kg tłuszczu, obliczyć wg wzoru: gdzie: 1000 - współczynnik przeliczeniowy liczby cm 3 zużytego Na2S2O3 na milirównoważniki tlenu w 1 kg tłuszczu VNa2S2O3 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm 3 ] V0 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu użytego do oznaczenia [cm 3 ] CNa2S2O3 - stężenie molowe tiosiarczanu sodu [mol/dm 3 ] m - masa tłuszczu [g] W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać prawdopodobne produkty powstające podczas jełczenia oksydatywnego. 1 1 Ćwiczenie 4 Hydroliza oleju roślinnego Sprzęt: mieszadło magnetyczne element mieszający łaźnia olejowa kolba okrągłodenna 250 ml kolba okrągłodenna 100 ml rozdzielacz 250 ml cylinder miarowy 100 ml lejek Buchnera kolba ssawkowa erlenmajerka 100 ml Hydroliza oleju roślinnego W kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml umieścić 15 g oleju roślinnego, 3.45 g wodorotlenku potasu i 30 ml gliceryny. Kolbę ogrzewać przez 5 minut w łaźni olejowej w temperaturze 160 °C zapewniając mieszanie. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej (mieszanina zaczyna krzepnąć) dodać 90 ml rozcieńczonego HCl (75 ml wody i 15 ml stężonego HCl), doprowadzając do pH = 1. Wytrącony osad wraz z roztworem przenieść do rozdzielacza, kolbę przemyć eterem dietylowym. Mieszaninę ekstrahować eterem dietylowym (3 x 30 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu. Po odsączeniu odparować rozpuszczalnik. Zważyć surowy kwas oleinowy zanieczyszczony kwasami wielonienasyconymi (linolowym, linolenowym). Wyodrębnienie kwasu oleinowego Otrzymany produkt przenieść do kolby 100 ml, dodać 16.5 g mocznika i 75 ml metanolu. Mieszaninę ogrzać do rozpuszczenia osadu, przesączyć, roztwór pozostawić do krystalizacji. Otrzymane kryształy (kompleks kwasu oleinowego z mocznikiem) odsączyć, a następnie rozpuścić w 35 ml wody i ekstrahować eterem naftowym (3 x 20 ml). Warstwę organiczną przemyć nasyconym roztworem NaCl, osuszyć nad siarczanem sodu, odsączyć, odparować. Zważyć produkt (gęstniejący olej o t.t. 16 °C i obliczyć wydajność procesu). W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Odczynniki: olej rzepakowy 15 g gliceryna 30 ml KOH eter dietylowy 90 ml stężony HCl 15 ml NaCl Na2SO4 mocznik – metanol eter naftowy 1 2 Ćwiczenie 5 Izolacja kwasów tłuszczowych z migdałów/ wiórków kokosowych Sprzęt: zestaw do destylacji z parą wodną kolba okrągłodenna 250 ml x 2 chłodnica zwrotna lejek rozdzielacz 250 ml Pozyskanie olejku migdałowego lub kokosowego można dokonać macerując materiał roślinny eterem naftowym (metoda A) lub destylując go z parą wodną (metoda B). Metoda A Rozdrobnione migdały (w płatkach, 15 g) lub wiórki kokosowe oraz 100 ml eteru naftowego umieścić w kolbie 250 ml zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w temperaturze wrzenia przez godzinę. Następnie ochłodzić mieszaninę, przesączyć. Kolbę przepłukać octanem etylu w celu wymycia wszystkich tłuszczowych pozostałości i dołączyć do przesączu. Całość odparować, zważyć. Metoda B Zmontować zestaw do destylacji z parą wodną. W kolbie umieścić 15 g migdałów w płatkach lub wiórków kokosowych. Destylację (pod wyciagiem) kontynuować do uzyskania 150 ml destylatu o mleczobiałej barwie. Destylat ekstrahować chloroformem (4 x 50 ml). Warstwę organiczną osuszyć nad Na2SO4, odparować i zważyć. Odczynniki: 15 g migdałów lub wiórków kokosowych chloroform eter dietylowy eter naftowy octan etylu metanol etanol Na2SO4 1 5 miareczkowanie gdy roztwór uzyska mleczną barwę. Analogiczne oznaczenie przeprowadzić dla próby ślepej (powtórzyć wszystkie czynności bez dodawania tłuszczu w metanolu). Liczbę jodową obliczyć wg wzoru: gdzie: 1,269 – wartość gramorównoważnika jodu (126,92 g) w odniesieniu do 100 g tłuszczu V0 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w próbie kontrolnej V1 – liczba ml Na2S2O3 zużyta w oznaczeniu właściwym m – masa tłuszczu [g] W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych doświadczeń, z uwzględnieniem celu doświadczenia, celu doświadczenia, swoich obserwacji i wniosków. Podać schemat reakcji otrzymywania mydła z kwasu laurynowego i oleinowego oraz addycji jodu do kwasu oleinowego. 1 6 Ćwiczenie 7 Izolacja i wykrywanie cholesterolu z żółtka jaja kurzego Sprzęt: zlewka 100 ml 2x bagietka kolba okrągłodenna 250 ml lejek płytki chromatograficzne komory chromatograficzne probówki Odczynniki: jajo kurze etanol-eter dietylowy (2:1, v/v) eter dietylowy aceton chloroform cholesterol - wzorzec kwas siarkowy stężony bezwodnik octowy roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym Izolacja cholesterolu Dokładnie oddzielić żółtko od białka i zalać je w zlewce 75 ml mieszaniny etanol-eter dietylowy (2:1, v/v). Rozmieszać żółtko szklaną bagietką i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na ok. 10 min., od czasu do czasu mieszając. Mieszaninę odsaczyć na sączku karbowanym do suchej kolby kulistej, a przesącz odparować na wyparce (temp. łaźni poniżej 50 °C). Żółtą pozostałość rozpuścić w 10 ml eteru dietylowego. Otrzymany roztwór wkroplić powoli, mieszając, do zlewki zawierającej 30 ml acetonu. Wytrącony osad surowych lecytyn odsaczyć na sączku karbowanym. Przesącz odparować, a pozostałość rozpuścić w chloroformie i zachować do TLC i reakcji probówkowych. Na płytkę chromatograficzną nanieść próbki osadu, przesączu i wzorzec cholesterolu. Rozwinąć w układzie oraz heksan-octan etylu (7:3). Wywołać: w parach jodu oraz kwasie siarkowym. 1 7 Wykrywanie cholesterolu Reakcje probówkowe na obecność cholesterolu w przesączu. Powtórzyć z wzorcem cholesterolu rozpuszczonym w chloroformie. Próba Salkowskiego: Do 2 ml roztworu cholesterolu dodać powoli po ściance probówki 1 ml stężonego kwasu siarkowego. Kwas fluoryzuje na zielono, a warstwa organiczna barwi się na czerwono. Próba Liebermana-Burcharda: Do 1 ml roztworu cholesterolu dodać 10 kropli bezwodnika octowego i kroplę kwasu siarkowego. Pojawia się czerwone zabarwienie, przechodzące przez niebieskie w zielone. Próba Windausa: Do 1 ml chloroformowego roztworu cholesterolu dodać kroplami roztwór bromu w lodowatym kwasie octowym. Obserwować zanikanie barwy bromu. W sprawozdaniu powinien się znaleźć opis przeprowadzonych prób, z uwzględnieniem swoich obserwacji i schematu reakcji.