Pobierz Ćwiczenia o właściwościach aminokwasów i więcej Ćwiczenia w PDF z Biologia tylko na Docsity! Ćwiczenie 1: Aminokwasy i białka Przed przystąpieniem do wykonywania ćwiczenia wymagana jest znajomość zagadnień wymienionych poniżej: 1. Aminokwasy białkowe, ich wzory, kryteria podziału oraz właściwości. 2. Budowa białek, struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- oraz czwartorzędowa; charakterystyka wiązania peptydowego oraz charakterystyka rodzajów wiązań stabilizujących strukturę białka; umiejętność narysowania fragmentu polipeptydu złożonego z kilku aminokwasów. 3. Zrozumienie pojęć: punkt izoelektryczny aminokwasu, punkt izoelektryczny białka, wysalanie białka, denaturacja białka. 4. Wyjaśnienie na czym polegają specyficzne reakcje służące wykrywaniu aminokwasów i białek w realizowanym ćwiczeniu. Literatura: Berg JM., Tymoczko JL., Stryer L. „Biochemia” Wydawnictwo Naukowe PWN, W-wa 2009, wydanie VI; www.whfreeman.com/stryer Hames BD., Hooper NM., Krótkie wykłady „Biochemia” Wydawnictwo Naukowe PWN, W-wa 2009, wydanie II, poprawione Kłyszejko-Stefanowicz L. i wsp. , „Ćwiczenia z biochemii” Wydawnictwo Naukowe PWN, W-wa 2005, wydanie I Wstęp Białka są zbudowane z -aminokwasów; podstawowym kryterium podziału aminokwasów białkowych jest charakter chemiczny ich reszt bocznych R poniżej wzór ogólny - aminokwasu z centralnie umieszczonym węglem- Aminokwasy ze względu na posiadanie zarówno grupy karboksylowej jak i aminowej są związkami o charakterze amfoterycznym. Aminokwasy niepolarne z resztą boczną o charakterze alifatycznym Aminokwasy z resztą boczną o charakterze aromatycznym Aminokwasy z polarną resztą boczną pozbawioną ładunku Uwaga: rozpuszczalnik kontaktuje się z bibułą tylko przez knot. Nałożyć drugą część szalki, aby powstała szczelna komora chromatograficzna. Chromatogram rozwijać tak długo aż czoło rozpuszczalnika zbliży się do obwodu krążka. Zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, następnie wysuszyć bibułę w temp. około 90°C (w suszarce), potem spryskać 0,1% roztworem ninhydryny w 95% etanolu i wysuszyć. Obserwować barwne plamy odpowiednich aminokwasów. Zidentyfikować skład nakropionej mieszaniny. Obliczyć Rf dla poszczególnych aminokwasów (Rf jest to stosunek odległości środka plamy aminokwasu od linii startu do odległości między linią startu a czołem rozpuszczalnika). Uwaga:w trakcie przebiegu rozdziału chromatograficznego wykonywać następne doświadczenia. Wykrywanie aminokwasów metodą ninhydrynową Zasada: aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do amoniaku, dwutlenku węgla i aldehydu uboższego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny: zredukowanej i utlenionej z amoniakiem (pochodzącym z grup α-aminowych) powstaje kompleks o fioletowoniebieskim zabarwieniu, natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do zawartości azotu α-aminowego aminokwasów. Reakcja ninhydrynowa jest dość czuła i umożliwia detekcję śladów biologicznych zawierających nawet małe ilości aminokwasów. Reakcja aminokwasów z ninhydryną umożliwia również ilościowe oznaczanie tych związków metodami spektrofotometrycznymi, w których mierzy się natężenie barwy zależne od stężenia powstałego kompleksu ninhydryny z NH3. Dodatni, barwny odczyn ninhydrynowy dają oprócz aminokwasów, peptydów i białek także sole amonowe, aminocukry i amoniak. Wykrywanie cystyny i cysteiny Poniżej przedstawiono reszty boczne dwu cystein (ang. side chains) zbliżone przestrzennie (mogą należeć do tego samego polipeptydu lub do dwu różnych poplipeptydów); w wyniku utlenienia ich grup –SH (grupy tiolowe) powstaje między nimi silne kowalencyjne wiązanie nazywane wiązaniem lub mostkiem dwusiarczkowym. Dwie wolne cysteiny połączone wiązaniem dwusiarczkowym nazywamy cystyną. Funkcjonowanie wielu białek wymaga istnienia w ich strukturze określonych wiązań dwusiarczkowych lub odwrotnie grupy tiolowe określonych cystein nie mogą tworzyć mostków dwusiarczkowych w biologicznie aktywnej formie białka. Poniżej przykład rybonukleazy (enzym degradujący RNA) której forma aktywna wymaga istnienia mostków dwusiarczkowych w określonych pozycjach jej łańcucha polipeptydowego. Rybonukleaza w formie biologicznie aktywnej Rybonukleaza zdenaturowana za pomocą czynników redukujących mostki dwusiarczkowe Uwaga: w polipeptydach kolejne reszty aminokwasowe numerujemy zawsze w kierunku od końca aminowego do karboksylowego Zasada: cystyna i cysteina pod wpływem NaOH uwalniają siarkę w postaci siarczku. Jony siarczkowe z kationami Pb +2 dają czarny osad PbS. Wykonanie: do jednej probówki dodać 1 ml 1% roztworu żelatyny a do drugiej 1 ml roztworu białka jaja kurzego. Do każdej dodać po 1 ml 30% roztworu NaOH i kilka kropel 10% roztworu octanu ołowiawego. Ogrzewać ostrożnie we wrzącej łaźni wodnej. Obserwować wypadanie z roztworu czarnego osadu PbS. Czy żelatyna zawiera cysteinę? Reakcja biuretowa Zasada: jest to reakcja charakterystyczna dla związków zawierających w cząsteczce co najmniej dwa ugrupowania -CO-NH- (wiązanie peptydowe ), grupy -CO-NH2 połączone ze sobą bezpośrednio lub powiązane poprzez atom azotu jak np. w w biurecie. Z wiązaniami tego typu jony miedziowe tworzą w środowisku zasadowym kompleksy o barwie fioletowej. biuret Wykonanie: do 2 ml roztworu 2% albuminy dodać 2 ml 10% roztworu NaOH, a następnie po kropli, dobrze mieszając, dodawać 1% roztwór CuSO4. Pojawia się zabarwienie fiołkowe.
