Ćwiczenie nr 4, Egzaminy z Transport

Pobierz Ćwiczenie nr 4 i więcej Egzaminy w PDF z Transport tylko na Docsity! 1 Ćwiczenie nr 4 – Bioenergetyka Oznaczanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej Celem ćwiczenia jest:  Zaznajomienie się modelem (układem) zawierającym wszystkie składniki potrzebne do przebiegu określonej reakcji redoks  Określenie wpływu niektórych substancji na przebieg reakcji w zaproponowanym modelu doświadczalnym  Zapis reakcji przebiegającej w tym doświadczeniu i obliczenie wartości ΔG  Interpretacja rezultatów przeprowadzonego doświadczenia Wstęp teoretyczny Wszystkie komórki wykorzystują ogólny mechanizm dla uzyskiwania energii 1. reakcje biochemiczne generujące elektrony na wysokim poziomie energetycznym - są to reakcje utleniania w matriks, głównie: pirogronianu z glukozy oraz acetylo-CoA pochodzących z utleniania kwasów tłuszczowych i szkieletów węglowych aminokwasów w cyklu Krebsa, - energia uwalniana w reakcjach redoks jest „wiązana” w NADH i FADH2, czyli w tzw. nośnikach elektronów o wysokiej energii, - elektrony z NADH i FADH2 są transportowane przez kolejne przenośniki łańcucha oddechowego, co stanowi system transportu elektronów, - na system transportu elektronów, składają się 4 kompleksy białkowe, przy czym trzy z nich istnieją jako oddzielne jednostki, umieszczone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, 2. sprzężenie energii uwalnianej w trakcie przepływu elektronów wzdłuż kompleksów łańcucha oddechowego z napędzaniem błonowych pomp protonowych - spontaniczny przepływ elektronów przez poszczególne kompleksy I, III, i IV jest związany z wymuszonym wytransportowaniem jonów H+ do przestrzeni międzybłonowej, - wypompowanie jonów H+ prowadzi do ustalenia się elektrochemicznego gradientu protonowego w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej, - czyli system transportu elektronów związany z wewnętrzną błoną mitochondrialną umożliwia zamianę energii transportu elektronów w gradient protonowy w poprzek błony, 2 3. wykorzystanie gradientu protonowego przez syntazę ATP - podczas przepływu jonów H+ z powrotem z przestrzeni międzybłonowej do matriks, co zachodzi przez enzym syntazę ATP, następuje synteza ATP z ADP i P, - enzym syntaza wykorzystuje gradient protonowy w poprzek błony do wytwarzania ATP, - następuje więc sprzężenie transportu elektronów w łańcuchu oddechowym z wytwarzaniem ATP. Łańcuch oddechowy - składa się z białek – enzymów klasy oksydoreduktaz oraz przenośników, transportujących początkowo protony i elektrony, a następnie elektrony na tlen, - jest ostatnim etapem utleniania w mitochondriach cząsteczek organicznych dostarczonych z pożywieniem, - enzymy i przenośniki są uorganizowane w kompleksy, które są umieszczone w matriks oraz w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, zgodnie ze wzrastającym potencjałem red-oks, - przenośnik przyjmujący elektrony ma większe powinowactwo do elektronów od przenośnika oddającego, a to zapewnia jednokierunkowy przepływ elektronów, - transport elektronów w łańcuchu oddechowym stanowi serię połączonych ze sobą reakcji utleniania i redukcji, - jak wiadomo: utlenianie polega na utracie elektronów, zaś redukcja na ich przyjęciu, - stąd utlenienie jednego związku zawsze pociąga za sobą redukcję drugiego, - w łańcuchu oddechowym elektrony są przenoszone: - od nukleotydu NADH, o najbardziej ujemnym potencjale redoks Eo, do tlenu, czyli do związku o najbardziej dodatnim potencjale redoks Eo (tlen ma największe powinowactwo do elektronów), - elektrony początkowo z dużym ładunkiem energii, stopniowo tracą ją na poszczególnych reakcjach wzdłuż łańcucha, - miarą powinowactwa związku do elektronów jest standardowy potencjał redoks Eo - jest to potencjał półogniwa zbudowanego z elektrody platynowej, zanurzonej w roztworze, w którym stężenie jonów potencjałotwórczych, czyli donora i akceptora elektronów jest równe (cutl = c red) i jest on mierzony w stosunku do standardowego półogniwa wodorowego, którego potencjał umownie przyjęto za równy zero, - standardowy potencjał redoks Eo pozwala przewidzieć kierunek przepływu elektronów z jednej pary redoks na drugą, w warunkach standardowych, ale w układach niebiologicznych, - biologiczny standardowy potencjał redoks - mierzy się w roztworze, w którym stężenie jonów H+ wynosi 10-7 mol/l, czyli przy pH=7, a nie dla pH=0, bo przy 1 mol/l stężeniu jonów H+, enzymy tracą aktywność 5 Powstająca cząsteczka ATP może ulegać hydrolizie na dwa sposoby • bardziej powszechna jest reakcja przebiegająca z uwolnieniem ADP i fosforanu, • cały proces wyzwala entalpię swobodną o wartości ok. – 31 kJ/mol, • mniej powszechna jest reakcja do AMP i pirofosforanu – ta reakcja dostarcza więcej energii, bo pirofosforan jest szybko usuwany ze środowiska w obecności specyficznej pirofosfatazy, – cały proces wyzwala entalpię swobodną o wartości ok. – 108 kJ/mol, • wartość entalpii swobodnej hydrolizy ATP jest pośrednia pomiędzy wartością entalpii swobodnej dla hydrolizy związków wysoko- i niskoenergetycznych, co umożliwia syntezę ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego – wtedy endoergiczne tworzenie ATP (wiązanie energii) jest sprzężone z reakcjami, które zachodzą z dużym spadkiem entalpii swobodnej, większym niż bezwzględna wartość entalpii swobodnej syntezy ATP, – wykorzystanie energii zawartej w ATP do przebiegu reakcji endoergicznej, na skutek jej sprzężenia z reakcją hydrolizy ATP • synteza innych wiązań – tworzenie wiązań kowalencyjnych, – możliwe jest też wykorzystanie energii zawartej w tym nukleotydzie np. do: • transportu aktywnego – zachowanie stałości składu środowiska i prawidłowej objętości komórek, 6 • dla skurczów mięśniowych (ATPaza aktyno-miozynowa) • utrzymania cytoszkieletu komórki (interakcje ankiryny, aktyny spektryny) Enzymy katalizujące utlenienia i redukcji różnego typu substratów (reakcje redoks) to oksydoreduktazy (EC. 1...). Reakcje te polegają na odebraniu atomów wodoru (protonów i elektronów) lub wprowadzeniu atomów tlenu do substratu. Główne miejsca działania: mitochondria, peroksysomy, a także cytoplazma. Koenzymami mogą być: NAD+, NADP+, FMN, FAD, DPT, liponian, koenzym Q. Wyróżnia się następujące podklasy oksydoreduktaz: Dehydrogenazy, Reduktazy, Oksydazy, Oksygenazy, Peroksydazy, Katalaza 7 Część doświadczalna Zasada metody oznaczania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej Utlenianie kwasu bursztynowego heksacyjanożelazianem potasu Dehydrogenaza bursztynianowa jest jednym z enzymów cyklu Krebsa, który katalizuje reakcję utleniania bursztynianu do fumaranu. Akceptorem wodoru w tej reakcji jest FAD, który ulega redukcji do FADH2. Odtworzenie cząsteczki FAD katalizuje reduktaza bursztynian-koenzym Q wchodzącą w skład kompleks II łańcucha transportu elektronów. Inhibitorami reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę bursztynianową są m. in.:  malonian – podobnie jak inne kwasy dikarboksylowe ze względu na podobną budowę strukturalną do substratu jest inhibitorem kompetycyjnym reakcji  HgCl2 – jony metali ciężkich, są zdolne do tworzenia trwałych wiązań kowalencyjnych z enzymem poza jego miejscem aktywnym (inhibitor niekompetycyjny) W warunkach fizjologicznych elektrony pochodzące z utlenienia FADH2 są przenoszone na centra Fe-S a następnie na ubichinon (CoQ). W warunkach laboratoryjnych można zastosować również sztuczne akceptory elektronów, takie jak heksacyjanożelazian(III) potasu, Zaletą zastosowania sztucznego akceptora jest możliwość śledzenia zmiany barwy w trakcie reakcji. K3[Fe(CN)6] + e ↔ K4[Fe(CN)6] żółty bezbarwny Procedura 1. Przygotowanie homogenatu Do zlewki wprowadzić 10 g wątróbki drobiowej i dodać 50 ml buforu fosforanowego o pH=6. Homogenizować przez ok. 1,5 min, a następnie przesączyć przez podwójną warstwę gazy do nowej zlewki. Przesącz zachować do dalszych analiz. 2. Inkubacja wstępna Przygotować mieszaniny inkubacyjne w 8 erlenmajerkach (falkonach) z korkami według poniższej tabeli.