Docsity
Docsity

Przygotuj się do egzaminów
Przygotuj się do egzaminów

Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity


Otrzymaj punkty, aby pobrać
Otrzymaj punkty, aby pobrać

Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium


Informacje i wskazówki
Informacje i wskazówki

część i: błony biologiczne 1. budowa i funkcje błony komórkowej, Schematy z Transport

30 cząsteczek białkowych. 2. TRANSPORT PRZEZ BŁONY KOMÓRKOWE. Jedna z podstawowych funkcji błony komórkowej jest kontrola transportu substancji do i z komórki.

Typologia: Schematy

2022/2023

Załadowany 24.02.2023

Maciej
Maciej 🇵🇱

4.8

(11)

126 dokumenty

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz część i: błony biologiczne 1. budowa i funkcje błony komórkowej i więcej Schematy w PDF z Transport tylko na Docsity! Część I: Błony biologiczne Biofizyka II przedmiot obieralny Materiały pomocnicze do wykładów prof. dr hab. inż. Jan Mazerski CZĘŚĆ I : BŁO N Y B I O L O G I C Z N E 1. BU D O W A I FU N K C J E BŁO N Y KO M Ó R K O W E J Błona komórkowa oddziela komórkę od środowiska zapewniając integralność komórki. Jednocześnie odpowiada ona za wymianę materii i informacji pomiędzy komórką a jej otoczeniem. Błony komórkowe spełniają 3 podstawowe funkcje: 1. przekazują informacje ze środowiska do wnętrza komórki 2. kontrolują, a w niektórych przypadkach aktywnie uczestniczą, w transporcie cząsteczek chemicznych do i z komórki 3. pozwalają, bez utraty powyższych funkcji, na wzrost, podział i ruch komórki przedstawione schematycznie na poniższym rysunku: Aby poprawnie wypełniać te funkcje błona komórkowa ma charakterystyczny skład chemiczny i unikalne właściwości fizykochemiczne. 1.1 Składniki błony komórkowej Już proste metody analityczne pozwalają stwierdzić, że podstawowymi składnikami błony komórkowej są: • lipidy • białka • cukry. Lipidy stanowią od 30 do 40% masy błony komórkowej. Podobna jest w błonie zawartość białka. Resztę masy błony stanowią cukry. Jest przy tym charakterystyczne, że cukry w błonie komórkowej są zawsze związane kowalencyjnie z lipidami (glikolipidy) lub białkami (glikoproteiny). 1 Część I: Błony biologiczne 1.1.1 Lipidy błonowe Pod względem budowy chemicznej lipidy błonowe podzielić można na 3 grupy: • fosfolipidy • sfingolipidy • sterole Fosfolipidy Pod względem chemicznym fosfolipidy są pochodnymi kwasu fosfatydylowego. Jego rdzeniem jest cząsteczka glicerolu zestryfikowana dwoma długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi i kwasem fosforowym. Kwas fosfatydylowy Fosfatydylocholina (lecytyna) W fosfolipidach błonowych jedna z grup hydroksylowych kwasu fosfatydylowego zestryfikowana jest jeszcze cząsteczką alkoholu. W zależności od rodzaju alkoholu mamy więc fosfatydylocholinę (lecytynę), fosfatydyloserynę itd. (rysunek poniżej). etanoloamina cholina seryna 2 Część I: Błony biologiczne 5 mat budowy błon komórkowych. Wyjaśniały one jednak tylko pewne ażnego układu biologicznego. Dopiero dzięki pracom ze sztuczn 1.2 Budowa błony komórkowej Jakościowy skład błon komórkowych poznano na przełomie XIX i XX w. Przez długi czas nie było jednak jasne jak rozmieszczone są poszczególne składniki błony, zwłaszcza białka i lipidy. Powstało wiele hipotez na te aspekty właściwości tego bardzo w ymi błonami lipidowymi zaproponowano w latach ’70 XX w. spójny model błony komórkowej. Obowiązujący do dzisiaj tzw. mozaikowy model błony zaproponowany został w 1972 przez Singera i Nicholsona. 1.2.1 Mozaikowy model płynnej błony Zgodnie z tym modelem podstawą błony komórkowej jest biwarstwa lipidowa. To ona zapewnia integralność środowiska wewnątrz komórki stanowiąc barierę dyfuzyjną. Biwarstwę lipidową można przy tym traktować jako dwuwymiarową ciecz: ruch w płaszczyźnie błony odbywa się w zasadzie bez specjalnych przeszkód. Jedynym ograniczeniem jest lepkość. W skład błony komórkowej wchodzą również białka błonowe. Związane one mogą być z są również tzw. białka integralne, zielone na rysunku powyżej, których nie można iszczenia jej struktury. Białka integralne mogą być jedynie zakotwiczone w onie biwarstwą lipidową na dwa różne sposoby. Tzw. białka powierzchniowe, nie pokazane na rysunku powyżej, wiążą się z błoną względnie luźno głównie poprzez oddziaływania elektrostatyczne i w pewnym zakresie poprzez wiązania wodorowe. Białka te można oddzielić od błony bez jej zniszczenia poprzez zmianę siły jonowej roztworu i/lub jego pH. Z błoną związane wyizolować z błony bez zn bł lub też przebijać ją na wylot. Te ostatnie, tzw. białka transbłonowe odpowiedzialne są za kontrolowany transport substancji do i z komórki oraz za przekazywanie informacji ze środowiska do wnętrza komórki. 1.2.2 Biwarstwa lipidowa Biwarstwa lipidowa jest strukturą supramolekularną rozdzielającą dwa roztwory wodne. Siłą zapewniającą jej stabilność termodynamiczną są oddziaływania hydrofobowe. Do powstania biwarstwy lipidowej niezbędna jest obecność lipidów posiadających długie lipofilowe łańcuchy Część I: Błony biologiczne 6 j monowarstwy do drugiej. Jak dotychczas nie udało się wykazać eksperymentalnie obecne są specjalne białka, tzw. ipazy, których zadaniem jest przenoszenie fosfolipidów i sfingolipidów z jednej monowarstwy do drugiej (p. 1.2.4). Badania eksperymentalne oraz wyniki obliczeń metodami modelowania molekularnego pokazują wyraźnie, że biwarstwa jest strukturą wysoce dynamiczną. alifatyczne oraz silnie polarną, najczęściej jonową część tzw. głowę. Tak więc spośród lipidowych składników błony najlepszymi kandydatami są fosfolipidy i sfingomieliny oraz w mniejszym stopniu glikolipidy. Sterole błonowe same nie są w stanie utworzyć stabilnej biwarstwy lipidowej nadają jednak już istniejącej biwarstwie pewne korzystne cechy fizykochemiczne. Dyfuzja lateralna (w płaszczyźnie błony) zachodzi przy tym stosunkowo łatwo i to zarówno w przypadku lipidów jak i białek. Zupełnie inaczej wygląda sytuacja z dyfuzją wertykalną (w poprzek błony). Spośród składników błony komórkowej jedynie sterole przemieszczają się względnie swobodnie z jedne samorzutnego przemieszczania się fosfolipidów, sfingolipidów i białek z jednej monowarstwy do drugiej, tzw. zjawisko flip-flop. W większości błon komórkowych fl W temperaturze pokojowej łańcuchy kwasów tłuszczowych nie przyjmują konformacji rozciągniętej, lecz posiadają znaczną swobodę rotacji wokół wiązań C-C. Swoboda ta maleje wraz z oddalaniem się .2.3 od powierzchni błony. Stwierdzono również, że cząsteczki wody mogą penetrować stosunkowo głęboko w strukturę biwarstwy. Występują nie tylko w obrębie polarnych głów, ale docierają również na głębokość kilku atomów węgla w warstwie lipidowej. 1 Białka błonowe Rysunek poniżej pokazuje poszczególne rodzaje białek błonowych. Kolorem zielonym zaznaczono na nim białka powierzchniowe związane z błoną oddziaływaniami elektrostatycznymi i w pewnym stopniu również poprzez wiązania wodorowe. Część I: Błony biologiczne Białka integralne, niebieskie na rysunku powyżej, związane są z błoną bardzo silnymi oddziaływaniami hydrofobowymi. Niektóre z nich związane są tylko z jedną monowarstwą (lewa część rysunku). W tym przypadku oddziaływania hydrofobowe wynikać mogą z dwóch różnych przyczyn: jedna z domen białka posiada powierzchnię hydrofobową i dzięki temu lokuje się w lipofilowym środowisku łańcuchów kwasów tłuszczowych, z łańcuchem białkowym związana jest reszta kwasu tłuszczowego, której łańcuch alifatyczny zakotwiczony jest w strukturze biwarstwy. Znane są dwa typowe zakotwiczenia: poprzez kwas mirystylowy lub palmitylowy, rysunek poniżej. Poza białkami związanymi z jedną monowarstwą istnieją również białka przebijające błonę na wylot. Fragment łańcucha peptydowego znajdujący się w błonie ma zwykle postać jednej lub kilku α-helis o bardzo charakterystycznej sekwencji. 1.2.4 Modyfikacje modelu mozaikowego Stworzony w latach ’70 XX w. mozaikowy model błony komórkowej wyjaśniał większość znanych wówczas faktów doświadczalnych. Od czasu jego powstania pojawiły się jednak nowe dane, więc model ten jest systematycznie modyfikowany. Poniżej omówione zostaną dwie modyfikacje powszechnie akceptowane przez środowisko biofizyków. 7 Część I: Błony biologiczne Proste eksperymenty myślowe pozwalają przewidzieć jakie substancje mogą być najwydajniej transportowane na tej drodze. Substancje jonowe i silnie polarne będą miały trudności z pokonaniem bariery woda-błona. Z kolei substancje lipofilowe bardzo łatwo wnikną do błony i będą mogły się w niej poruszać, napotkają jednak duże trudności z pokonaniem bariery błona-woda i wyjściem z błony. Jedynie w przypadku substancje niejonowych o średniej polarności możemy się spodziewać względnie łatwego pokonania biwarstwy na drodze biernej dyfuzji. Jest bardzo charakterystyczne, że praktycznie wszystkie leki spełniają ten wymóg i są transportowane do wnętrza komórek na drodze dyfuzji. Zamieszczony obok wykres pokazuje wartości współczyn- ników przepuszczalności przez biwarstwę dla kilku wybranych substancji. Widać wyraźnie, że najłatwiej dyfunduje przez biwarstwę woda. Już małe polarne związki organiczne takie jak mocznik czy glicerol dyfundują ok. 1000 razy trudniej. Jeszcze trudniej dyfundują silnie polarne substancje odżywcze takie jak aminokwasy i cukry. Na wykresie pokazano, jak ważny dla dyfuzji transbłonowej jest brak grup zjonizowanych. Indol, stanowiący łańcuch boczny tryptofanu, dyfunduje ponad 1000-krotnie szybciej niż aminokwas posiadający charakter jonu obojnaczego. Skrajnie trudno dyfundują silnie hydratowane proste jony nieorganiczne. Ich dyfuzja jest o ponad 9 rzędów słabsza niż dyfuzja wody i daje się w ogóle wykryć tylko dzięki zastosowaniu specjalnych technik, np. z zastosowaniem izotopów promieniotwórczych. W typowych pomiarach biofizycznych można spokojnie założyć, że jony takie praktycznie nie dyfundują poprzez biwarstwę. Charakterystyczne czasy dyfuzji Substancja Przez biwarstwę Przez warstwę wody Stosunek woda 0,5 ms 10 ns 104 małe nieelektrolity 0,5 s 10 ns 107 glukoza 50 s 10 ns 109 jony 14 godz. 10 ns 1012 Innym wskaźnikiem pozwalającym wyrobić sobie opinię o zdolności substancji do dyfuzji przez biwarstwę lipidową jest tzw. czas charakterystyczny dyfuzji (tabela powyżej). Wskaźnik ten pozwala porównać szybkość dyfuzji danej substancji w wodzie i poprzez biwarstwę. Widać, że nawet dyfuzja wody jest w biwarstwie o 4 rzędy wolniejsza niż w samej wodzie. W przypadku jonów nieorganicznych dyfuzja przez biwarstwę jest o 12 rzędów wielkości wolniejsza niż w wodzie. 10 Część I: Błony biologiczne 2.1.2 Jonofory Praktyczna nieprzepuszczalność sztucznych błon lipidowych dla jonów nieorganicznych, a z drugiej strony istotna rola transportu tych jonów praktycznie we wszystkich typach komórek spowodowała ogromne zainteresowanie możliwością wywołania transportu jonów poprzez dodatek małocząsteczkowych związków chemicznych. Związki o takich właściwościach nazywamy jonoforami. Przenośnikowe Kanałowe I [mA] U [mV] I [mA] U [mV] Walinomycyna Gramicydyna Okazało się, że właściwości jonoforowe wykazuje wiele klas związków chemicznych poczynając od tak prostych, jak kwasy karboksylowe i fenole, a kończąc na antybiotykach i peptydach. Szczegółowe badania nad transport jonów przez sztuczne błony lipidowe wykazały, że istnieją dwa odmienne mechanizmy tego zjawiska. Różnice pomiędzy tymi mechanizmami są szczególnie wyraźnie widoczne na charakterystykach prądowo-napieciowych: wykresach zależności natężenia prądu płynącego przez błonę w funkcji przyłożonego do błony napięcia (rysunek powyżej). W przypadku jednego z tych mechanizmów, zwanego mechanizmem przenośnikowym, charakterystyki prądowo-napieciowe mają kształt sigmoidalny. Natężenie płynącego prądu zależy od przyłożonego napięcia jedynie w wąskim przedziale napięcia wokół wartości zerowej. Poza tym przedziałem prąd ma charakter prądu nasycenia. Natężenie prądu nasycenia zależy przy tym od stężenia jonoforu, a prawie nie zależy od stężenia jonów. 11 Część I: Błony biologiczne 12 W przypadku kanałowego mechanizmu przewodzenia charakterystyka prądowo-napieciowa ma w całym dostępnym przedziale charakter liniowy. Nachylenie charakterystyki jest zależne zarówno od stężenia jonoforu jak i stężenia przepływających jonów. Typowym jonoforem o mechanizmie nośnikowym jest walinomycyna - cykliczny depsipeptyd zbudowany z 4 aminokwasów i 4 hydroksykwasów. Bardzo charakterystyczna jest struktura przestrzenna tego związku. Tworzy on sztywny torus, którego powierzchnia zewnętrzna ma charakter silnie lipofilowy, a wewnątrz pustej przestrzeni torusa znajduje się 8 grup karbonylowych ułożonych w dwóch poziomach. Walinomycyna nawet w roztworach wodnych silnie kompleksuje kationy potasu. Kation lokuje się wewnątrz torusa i silnie oddziałuje z wolnymi parami atomów tlenu grup karbonylowych. Atomy te zastępują przy tym otoczkę hydratacyjną cząsteczek wody. Walinomycyna dodana do lipidów na etapie formowania błony lipidowej lub nawet do roztworu wodnego otaczającego gotową już błonę lokuje się we wnętrzu biwarstwy. Zdolna jest przy tym do wychwytywania jonów potasu z roztworu wodnego. Tak zakamuflowany jon potasu może pokonać biwarstwę na drodze biernej dyfuzji i oddysocjować od nośnika po drugiej stronie. Występowanie prądu nasycenia w charakterystyce prądowo-napieciowej jest przy tym związane z ograniczoną szybkością dyfuzji kompleksu jon-nośnik. W przypadku jonoforów o dużych zdolnościach kompleksujących, takich jak walinomycyna, natężenie prądu nasycenia zależy od liczby cząsteczek przenośnika, a nie od stężenia jonów. Duże zainteresowanie walinomycyną wynika również z faktu, że wykazuje ona bardzo dużą jono- selektywność: jej powinowactwo do jonów potasu jest ok. 1000-krotnie większe niż do jonów sodu. Swego czasu był to pierwszy jonofor niebiałkowy o tak dużej selektywności. Odpowiednikiem walinomycyny w grupie jonoforów kanałowych jest gramicydyna. Jest to antybiotyk będący niewielkim poliptydem. W konformacji natywnej gramicydyna przyjmuje formę helisy (ale nie α-helisy), której powierzchnia zewnętrzna jest silnie lipofilowa. Helisa gramicydyny ma na tyle dużą średnicę wewnętrzną, że może się w jej wnętrzu zmieścić jon alkaliczny. Wchodzenie kationu (ale nie anionu) do wnętrza helisy ułatwiają znajdujące się w jej wnętrzu atomy tlenu grup karbonylowych pełniące rolę zastępczej warstwy hydratacyjnej. Taki skompleksowany jon może przemieszczać się wzdłuż osi helisy zgodnie z gradientem stężenia lub zgodnie z kierunkiem przyłożonego zewnętrznego pola elektrycznego. Natężenie prądu jonowego zależy przy tym przede wszystkim od przyłożonego napięcia i stężenia jonów. Jest przy tym ciekawe, że aby uzyskać funkcjonalny kanał gramicydyna musi być dodana po obu stronach biwarstwy lub w trakcie jej formowania. Dodana po jednej stronie gotowej już błony nie ułatwia ruchu jonów. Wynika to z długości helisy: jest ona za krótka, aby przebić całą biwarstwę. Kanał powstaje dopiero gdy dwie cząsteczki gramicydyny, każda w innej połówce biwarstwy, spotkają się w układzie „ogon do ogona”. Część I: Błony biologiczne Połączenie gigaomowe odznacza się na tyle dużą wytrzymałością mechaniczną, że poruszając delikatnie kapilarą można oderwać skrawek błony komórkowej od reszty komórki. Jeżeli w zassanym fragmencie błony znajdzie się białko transportujące, to otrzymujemy idealny układ pomiarowy do badania charakterystyki tego białka. Połączenie gigaomowe można również wykorzystać do pomiarów wypadkowego transportu przez całą błonę komórkową. Należy w tym celu gwałtownie zwiększyć podciśnienie w kapilarze. Zassany fragment błony zostanie przerwany i prąd pomiędzy elektrodami płynąć będzie przez całą powierzchnię błony komórkowej. 2.2 Transport w komórce Poznanie poszczególnych układów transportowych w układach modelowych pozwoliło zrozumieć znaczenie i mechanizm działania transportu w błonach komórkowych. Przede wszystkim okazało się, że transport ten odbywa się na trzech drogach, jako: • bierna dyfuzja, • transport ułatwiony, oraz • transport aktywny. 2.2.1 Bierna dyfuzja Znaczenie biernej dyfuzji w przypadku błon komórkowych jest bardzo ograniczone i dotyczy przede wszystkim ruchu wody i wynikającej z tego wrażliwości osmotycznej komórek. Bierna dyfuzja innych substancji ma raczej dla komórki znaczenie negatywne. Wynika to przede wszystkim z faktu, że ten rodzaj transportu nie podlega kontroli. Jednakże fakt występowania dyfuzji przez błonę komórkową ma duże znaczenie w medycynie: pozwala na wprowadzenie do wnętrza komórki leków. W trakcie ewolucji komórki wypracowały specjalne mechanizmy pozwalające na usuwanie z komórki substancji, które wniknęły do jej wnętrza korzystając z tej drogi transportu. 2.2.2 Transport ułatwiony Podstawowe znaczenie dla prawidłowego działania komórki ma za to transport ułatwiony. Na tej drodze wnika do wnętrza komórki większość niezbędnych dla jej życia związków chemicznych. Również produkty przemiany materii opuszczają komórkę głównie dzięki transportowi ułatwionemu. Ten mechanizm transportu jest również kluczowy przy wymianie materii pomiędzy cytoplazmą komórki a znajdującymi się w jej wnętrzu organellami. Podobnie jak w przypadku transportu ułatwionego w sztucznych błonach lipidowych wykazano, że transport ułatwiony w błonach komórkowych może odbywać się według dwóch 15 Część I: Błony biologiczne odmiennych mechanizmów: przenośnikowego i kanałowego. Przy czym w obu przypadkach rolę czynnika ułatwiającego transport odgrywa białko transbłonowe. Siłą napędową w obydwu mechanizmach transportu ułatwionego jest występujący na błonie gradient chemiczny lub elektrochemiczny. Oba mechanizmy wykazują przy tym bardzo wysoką selektywność transportu i są podatne na mechanizmy regulacyjne. Przenośnik białkowy Jednakże mechanizm działania przenośników białkowych jest zupełnie odmienny od mechanizmu działania przenośników małocząsteczkowych takich jak walinomycyna. Ze względu na wielkość cząsteczki białka i jej zakotwiczenie po obu stronach biwarstwy trudno sobie wyobrazić, aby dyfundowało ono swobodnie w poprzek błony. Również mechanizm flip-flop jest w przypadku białek niemożliwy. Włożono wiele wysiłku w wyjaśnienie tego fenomenu. Pierwszych przesłanek pozwalających na zbudowanie wiarygodnego obrazu działania przenośnika białkowego dostarczyły wyniki badań nad przenośnikami poddanymi modyfikacjom chemicznym. Okazało się, że w wielu przypadkach niewielkie modyfikacje chemiczne, takie jak np. redukcja mostków dwusiarczkowych, prowadzą do przemiany białka przenośnikowego w niepoddające się regulacji białko kanałowe. Oznacza to, że przenośnik białkowy ma jednoczesny kontakt z obiema powierzchniami błony. Dalsze badania nad dynamiką białek przenośnikowych wykazały, że mogą one występować w dwóch stanach konformacyjnych. W jednym z nich wnętrze białka kontaktuje się ze środowiskiem zewnętrznym, a w drugim z cytoplazmą komórki. Stwierdzono również, że w jednym ze stanów konformacyjnych we wnętrzu białka istnieją miejsca wiążące transportowaną substancję. Łącząc wszystkie powyższe obserwacje zaproponowano mechanizm transportu ułatwionego zilustrowany na schemacie obok. W stanie A przenośnik otwarty jest do roztworu, który ma być źródłem transportowanej substancji (może to być np. otoczenie komórki). Umożliwia to cząsteczkom substancji transportowanej związanie się z miejscami wiązania wewnątrz cząsteczki białka. Związanie się cząsteczek transportowanej substancji z miejscami wiążącymi wyzwala zmianę 16 Część I: Błony biologiczne konformacyjną białka: przechodzi ono w stan B. W stanie tym kontakt ze środowiskiem zewnętrznym jest niemożliwy. Dostępne za to staje się wnętrze komórki. W stanie B zmianie ulega również konformacja miejsca wiążącego cząsteczkę transportowaną w taki sposób, że obniża się stała wiązania. W efekcie cząsteczka transportowana przechodzi do przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Oddysocjowanie wszystkich (lub co najmniej większości) cząsteczek transportowanych jest sygnałem do kolejnej zmiany konformacyjnej: stan B przechodzi w stan A i proces się powtarza. Wydajność transportowa przenośników białkowych jest w komórce precyzyjnie regulowana. Wydaje się, że mechanizm regulacji polega na modyfikacji chemicznej wybranych miejsc w cząsteczce białka. Pomimo zgromadzenia wielu szczegółowych danych doświadczalnych nie powstała jeszcze ogólna teoria regulacji białek przenośnikowych. Transport kanałowy - regulacja Mechanizm działania błonowych kanałów białkowych jest stosunkowo prosty. Białka takie tworzą w błonie hydrofilowy kanał, przez który mniej lub bardziej swobodnie mogą dyfundować substancje o dostatecznie małej średnicy i odpowiednim ładunku elektrycznym. Dużo ciekawszy jest problem selektywności i regulacji transportu przez kanały białkowe. Na rysunku powyżej pokazano 4 podstawowe mechanizmy regulacji (tzw. bramkowania) pracy kanału błonowego. Kanał bramkowany potencjałem błonowym W większości komórek występuje różnica potencjału elektrycznego po obydwu stronach błony komórkowej. Zjawisko to nazywamy polaryzacją błony. W określonych warunkach potencjał ten może zaniknąć, depolaryzacja błony, lub zmienić się na przeciwny, repolaryzacja. Zmiana polaryzacji błony może wywołać taką zmianę konformacji białka kanałowego, że kanał przechodzi ze stanu zamkniętego w otwarty lub odwrotnie. Kanał bramkowany ligandem zewnątrzkomórkowym Ten mechanizm regulacji jest powszechnie wykorzystywany do przekazywania do wnętrza komórki sygnałów pochodzących ze środowiska zewnętrznego. Związanie cząsteczki sygnałowej z miejscem receptorowym kanału prowadzi do zmian konformacyjnych wywołujących jego otwarcie. 17 Część I: Błony biologiczne Wszystko wskazuje, że segmenty te są α-helisami przenikającymi błonę. Cytozol Z rozważań termodynamicznych wynika, że stan kanału może być zależny od potencjału błonowego tylko wtedy, gdy przejściu od stanu zamkniętego Z do stanu otwartego O towarzyszy ruch ładunku w poprzek błony. [ ] [ ] ( ) ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ − −== RT VVzFexp O ZK 0 Po zlogarytmowaniu powyższego wzoru otrzymujemy: [ ] [ ] ( ) RT VVzF Z Oln 0− =⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ Z zależności tej wynika, że wykres zależności ln([O]/[Z]) od przył ożonego potencjału powinien mieć postać linii prostej o nachyleniu równym zF/RT, gdzie z jest liczbą ładunków przemieszczających się w poprzek błony podczas zmiany stanu konformacyjnego kanału. Z wielokrotnie powtarzanych doświadczeń wynika, że w przypadku kanału sodowego bramkowanego potencjałem otwarcie kanału wymaga przemieszczenia się 6 dodatnich ładunków elementarnych od strony cytozolowej do strony zewnętrznej błony. Istnieje szereg przesłanek, że ruch ładunków jest wynikiem ruchu śrubowego segmentów S4. Podobnie jak w przypadku kanału sodowego bramkowanego acetylocholiną ruch taki może skutkować udrożnieniem kanału. [ ] [ ] ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ Z Oln V RT zFtg =α Kanał sodowy ulega samorzutnej inaktywacji w ciągu ok. 1 ms niezależnie od potencjału błonowego. Przechodzi przy tym nie w stan zamknięty, lecz w trzeci stan zwany stanem nieaktywnym. Powrót do stanu zamkniętego wymaga ponownej polaryzacji błony. Wykazano, że zdolność do przechodzenia kanału sodowego w stan nieaktywny związana jest z obecnością pętli w domenie cytozolowej pomiędzy powtórzeniami III i IV (kolorowa elipsa na rysunku poniżej). 20 Zamknięty Otwarty depolaryzacja polaryzacja Nieaktywny Część I: Błony biologiczne Kanał sodowy bramkowany potencjałem jest kanałem kationoselektywnym – przepuszcza jedynie kationy. Jest również kanałem kationospecyficznym – kationy sodu przepuszcza ok. 10 razy łatwiej niż kationy potasu, tabela poniżej. Jon Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ NH4 + HONH3 + H2NNH3 + CH3NH3 + Przepuszczalność względna 0,93 1,00 0,09 < 0,01 < 0,01 0,16 0,94 0,59 < 0,01 Z badań nad zależnością przepuszczalności jonów od ich średnicy wynika, że filtr selektywności tego kanału jest wąski. Przez kanał przechodzą tylko jony o średnicy mniejszej niż 0,5 nm. Jednakże filtr różnicuje nie tylko ze względu na wielkość jonu. Chociaż kationy hydroksyloaminy, hydrazyny i metyloaminy mają taką samą wielkość to jednak ich przepuszczalność przez kanał różni się o dwa rzędy wielkości. Na podstawie obserwowanej kationospecyficzności wysunięto wniosek, że przez kanał przechodzą kationy nieorganiczne wraz z cząsteczką wody lub kationy organiczne zdolne do tworzenia wiązania wodorowego. Uwodniony kation potasu jest za duży, a jon metyloamoniowy nie jest zdolny do tworzenia wiązania wodorowego. Stwierdzono ponadto, że przewodnictwo kanału dla danego jonu zależy od pH – spada ze spadkiem pH. Zależność przewodnictwa od pH ma przy tym kształt typowy dla krzywej miareczkowania słabego kwasu o pKa = 5,2. Wyciągnięto z tego wniosek, że istotnym składnikiem filtru selektywności tego kanału musi być co najmniej jedna zdysocjowana grupa karboksylowa. Hipoteza ta wyjaśnia zarówno zależność od pH jak i brak przepuszczalności kanału dla anionów. Z połączenia obydwu spostrzeżeń powstał model filtru selektywności pokazany na rysunku obok. W najwęższym miejscu filtru selektywności kanału sodowego bramkowanego potencjałem znajdują się naprzeciw siebie zdysocjowana grupa karboksylowa i akceptor wiązania wodorowego (prawdopodobnie atom tlenu wiązania peptydowego). 21 Część I: Błony biologiczne Kanał potasowy bramkowany potencjałem Kanały tego typu występują we wszystkich komórkach nerwowych i ich prawidłowe funkcjonowanie jest niezbędne dla sprawnego przekazywania impulsów nerwowych. Jest to kanał bramkowany potencjałem błonowym. Przy normalnej wartości potencjału błonowego kanały potasowe są zamknięte. Jednakże, gdy na skutek depolaryzacji potencjał błonowy stanie się dodatni kanały potasowe otwierają się. Funkcjonalny kanał potasowy komórek nerwowych jest tetramerem złożonym z czterech bardzo podobnych białek o m.cz. ok. 70 kDa. Profil hydrofobowy każdego z tych białek jest bardzo podobny do powtarzalnych fragmentów białka tworzącego kanał sodowy. Kanał potasowy Kanał sodowy bramka Białko kanału potasowego zawiera również 5 helis hydrofobowych i 1 silnie kationowy segment S4. Otrzymanie w stanie czystym białka kanału potasowego z komórek nerwowych jest dużo trudniejsze niż białka kanału sodowego. Na szczęście kanały potasowe występują również w komórkach bakteryjnych. Białko to jest łatwiejsze do izolacji a jego właściwości tworzonego kanału (przewodnictwo, selektywność, inhibitory) są bardzo podobne do właściwości neuronalnego kanału potasowego bramkowanego potencjałem. Podstawowa różnica polega na tym, że nie jest on wrażliwy na potencjał błonowy. Kanał neuronalny filtr Kanał bakteryjny Białko tworzące kanał potasowy w komórkach bakteryjnych zawiera tylko dwie helisy transbłonowe odpowiadające segmentom S5 i S6. Funkcjonalny kanał bakteryjny jest homotetramerem którego podjednostki ułożone są ukośnie na pobocznicy stożka. Poznano strukturę tego kanału dzięki zastosowaniu analizy rentgenostrukturalnej monokryształu. cytozol Pętla i krótka helisa pomiędzy segmentami (ciemnoczerwone na prawym panelu rysunku powyżej) pełni rolę filtra selektywności. 22 Część I: Błony biologiczne dalekozasięgowym oddziaływaniom elektrostatycznym niedostępne w stanie zamkniętym miejsce wiążące w świetle kanału i przywiera do niego (ulega okluzji). Czas otwarcia kanału determinowany jest więc przez szybkość okluzji. Wykazano, że skrócenie łańcucha przyspiesza inaktywację, ponieważ wtedy kula szybciej odnajduje swoje miejsce docelowe. Z kolei wydłużenie łańcucha opóźnia inaktywację. Tak więc czas otwarcia kanału potasowego zależny jest od długości i elastyczności segmentu łączącego (łańcucha). 2.2.3 Transport aktywny Białka odpowiedzialne za transport ułatwiony, a zwłaszcza kanały białkowe, umożliwiają w zasadzie przepływ substancji w obie strony. Kierunek przepływu określony jest przez gradient stężenia (substancje obojętne) lub gradient elektrochemiczny (jony). Jak jednak dochodzi do wytworzenia i utrzymywania się przez długi czas gradientu na błonie? Przecież transport ułatwiony powinien w końcu doprowadzić do wyrównania się stężeń. Nie da się również za pomocą mechanizmów transportu ułatwionego wyjaśnić jak dochodzi do nagromadzenia się w komórce pewnych substancji w stężeniu o wiele większym niż w środowisku zewnętrznym. Wyjaśnienie wspomnianych powyżej zjawisk wymaga przyjęcia założenia, że w błonie komórkowej istnieją systemy zdolne do transportu substancji wbrew gradientowi stężenia lub gradientowi elektrochemicznemu. Systemy takie noszą nazwę systemów transportu aktywnego lub pomp błonowych. Ruch substancji wbrew gradientowi wymaga bowiem nakładu energii. Obecnie znamy 3 źródła energii wykorzystywane w transporcie aktywnym. Źródłem energii dla transportu aktywnego jednej substancji może być przepływ innej substancji zgodnie z dużym gradientem stężenia. Mówimy wtedy o transporcie sprzężonym. Siłą napędową transportu aktywnego może być również ene hydrolizy wiązań wysokoenergetycznych. Takim uniwersalnym paliwem dla pomp błonowych jest hydroliza ATP. Wreszcie w procesie fotosyntezy źródłem energii dla pompy błonowej są kwanty światła. rgia chemiczna wydzielająca się w trakcie 25 Część I: Błony biologiczne Transport sprzężony Mechanizm molekularny transportu sprzężonego podobny jest do mechanizmu przenośnikowego w transporcie ułatwionym. Różnica polega jednak na tym, że białko przenośnikowe posiada miejsca wiążące dwie substancje. W zależności od kierunku transportu substancji transportowanej w stosunku do kierunku przepływu substancji towarzyszącej rozróżniamy symport, gdy obie substancje przepływają w tym samym kierunku, oraz antyport, gdy kierunki przepływu są przeciwne. Mechanizm transportu sprzężonego prześledzimy teraz na przykładzie symportu glukozy napędzanego gradientem jonów sodu. W typowych komórkach silny gradient elektrochemiczny skierowany jest od otoczenia komórki do jej wnętrza. Z kolei gradient stężenia glukozy jest odwrotny. Jednakże komórki potrafią wykorzystać ruch jonów sodu zgodny z gradientem elektrochemicznym do transportu glukozy wbrew gradientowi stężeń. W stanie A białko przenośnikowe otwarte jest do środowiska zewnętrznego. Wewnątrz białka znajdują się miejsca wiążące glukozę i jony sodu. Gdy miejsca wiążące glukozę zostaną obsadzone dochodzi do zmiany stanu konformacyjnego przenośnika. W nowym stanie konformacyjnym B białka otwiera się do wnętrza komórki, a miejsca wiążące tracą zdolność do wiązania sodu i glukozy. Po uwolnieniu transportowanych substancji białko powraca do stanu A i cykl może się powtórzyć. Ciekawy przykład wykorzystania transportu sprzężonego do przenoszenia glukozy nie tylko przez błonę komórkową, ale przez warstwę komórek napotkać można w ścianie jelita. W błonie komórek wyścielających jelito znajdują się białka zdolne do symportu glukoza - jony sodu. Przenośniki te zlokalizowane są w tej części błony komórkowej, która tworzy kosmki jelitowe. Dzięki ich działaniu glukoza przepływa do wnętrza komórek ściany jelita wbrew gradientowi stężeń. Jednak stężenie glukozy we wnętrzu 26 Część I: Błony biologiczne komórki nie rośnie. Dzieje się tak, ponieważ w tej części błony komórkowej, która styka się z naczyniami krwionośnymi lub limfatycznymi znajdują się przenośniki błonowe zdolne do ułatwionego transportu glukozy zgodnie z gradientem jej stężenia. W efekcie, glukoza niejako przepływa przez komórki wyścielające jelito. Przepływ odbywa się z przestrzeni o niskim stężeniu glukozy (światło jelita), poprzez przestrzeń o dużym stężeniu glukozy (wnętrze komórki nabłonkowej), do przestrzeni o niskim stężeniu (płyn zewnątrzkomórkowy). Cały ten skomplikowany przepływ możliwy jest dzięki przepływowi jonów sodu zgodnie z gradientem elektrochemicznym. Pompy błonowe Co jednak dzieje się z jonami sodu, które napływają nieprzerwanym strumieniem do wnętrza komórek nabłonka? Aby komórki te mogły pracować nieprzerwanie jony sodu muszą być z nich usuwane. Funkcję tą spełniają pompy sodowo-potasowe napędzane energią hydrolizy ATP. Prześledźmy działanie takiej pompy bardziej szczegółowo. Działanie pompy ma charakter procesu cyklicznego, można go więc je analizować od dowolnego punktu. My rozpoczniemy od stanu [1] w którym przestrzeń wewnętrzna białka przenoszącego kontaktuje się z cytozolem. W przestrzeni tej znajduje się miejsce zdolne do wiązania jonów sodu. Gdy miejsce to zostanie obsadzone dochodzi do niewielkiej zmiany konformacyjnej odsłaniającej miejsce fosforylacji. Miejsce to znajduje się na powierzchni pompy od strony cytozolu. Odsłonięte miejsce fosforylacji zostaje teraz ufosforylowane dzięki przeniesieniu grupy fosforanowej z ATP - wykorzystana została energia chemiczna [2]. Fosforylacja białka wywołuje powstanie naprężenia konformacyjnego, które relaksuje się doprowadzając do kompleksowej zmiany konformacji [3]. W tym stanie konformacyjnym wnętrze białka przenośnikowego jest połączone ze środowiskiem zewnętrznym. Zanika też powinowactwo do jonu sodu, który na drodze dyfuzji opuszcza wnętrze białka. Jednocześnie w innym miejscu tworzy się miejsce wiążące jon potasu. Obsadzenie tego miejsca jonem potasu prowadzi do niewielkiej, ale istotnej zmiany konformacyjnej [4]. W jej wyniku uruchomione zostaje centrum katalityczne, które 27 Część I: Błony biologiczne 3.1.1 Synapsa Miejsce styku dwóch komórek nerwowych, w którym informacja przepływa z jednej komórki do drugiej ma bardzo charakterystyczną budowę. Wyróżniamy w nim 3 obszary: 30 • błonę presynaptyczną od strony komórki przekazującej sygnał, • szczelinę synaptyczną rozdzielającą obie komórki, oraz • błonę postsynaptyczną na powierzchni komórki odbierającej sygnał. Błona presynaptyczna tworzy gruszkowatą wypustkę na końcu rozgałęzionego zakończenia aksonu. W zgrubieniu tym znajduje się wiele pęcherzyków lipidowych, tzw. pęcherzyków synaptycznych, z których każdy zawiera ok. 104 cząsteczek neuroprzekaźnika, np. acetylocholiny. Na powierzchni bocznej zgrubienia znajdują się kanały wapniowe bramkowane potencjałem. Gdy do presynaptycznego zakończenia nerwu dociera impuls nerwowy w postaci fali depolaryzacji błony kanały te otwierają się umożliwiając napływ jonów wapniowych do wnętrza komórki. Lokalny wzrost stężenia jonów wapniowych powoduje połączenie się błony pęcherzyka synaptycznego z błoną presynaptyczną i uwolnienie neuroprzekaźnika do szczeliny synaptycznej z ok. 300 pęcherzyków. Podnosi to stężenie przekaźnika w szczelinie synaptycznej z 10 nm do 500 µM w czasie krótszym niż 1 ms. Neuroprzekaźnik szybko dyfunduje przez wąską szczelinę synaptyczną, grubość ok. 50 nm, i wiąże się z receptorem znajdującym się na białku kanału jonowego wbudowanego w błonę postsynaptyczną. Jest to kanał jonowy bramkowany neuroprzekaźnikiem. Po związaniu neuroprzekaźnika kanał ulega otwarciu umożliwiając ruch odpowiednich jonów do wnętrza komórki. Wewnątrzkomórkowe zmiany stężenia jonów powodują lokalna zmianę polaryzacji błony. Część I: Błony biologiczne Stwierdzona, że istnieje wiele rodzajów synaps. Przede wszystkim synapsy mogą się różnić rodzajem neuroprzekaźnika. Poza wspomnianą powyżej acetylocholiną rolę przekaźnika w odpowiednich synapsach pełnią dopamina, serotonina, kwas γ-aminomasłowy (GABA) i szereg innych związków małocząsteczkowych. Synapsy mogą się również różnić wpływem jaki wywierają na potencjał błony postsynaptycznej. W przypadku większości synaps związanie przekaźnika otwiera kanał selektywny w stosunku do kationów. Tak dzieje się np. w synapsach acetylocholinowych. Ze względu na duży gradient jonów sodu i kierunek polaryzacji błony otwarcie kanału kationoselektywnego wywołuje przede wszystkim napływ jonów sodu do wnętrza komórki wywołując lokalnie silną depolaryzację błony i pobudzając komórkę do wysłania własnego impulsu. Synapsy tego typu nazywamy synapsami pobudzającymi. Znane są również synapsy, które w odpowiedzi na wzrost stężenia neuroprzekaźnika indukują w błonie postsynaptycznej ruch anionów, głównie chlorków. Napływ jonów chlorkowych do wnętrza komórki pogłębia polaryzacje błony (tzw. hiperpolaryzacja) i zmniejsza prawdopodobieństwo wysłania przez nią impulsu. Synapsy takie noszą nazwę synaps hamujących. Wiązanie przekaźnika z miejscem receptorowym kanału w błonie postsynaptycznej ma charakter równowagowy. W warunkach fizjologicznych kanał pozostaje otwarty tylko przez ok. 1 ms, 31 Część I: Błony biologiczne ponieważ przekaźnik w szczelinie synaptycznej ulega szybkim przemianom enzymatycznym. W przypadku najlepiej poznanej synapsy acetylocholinowej dochodzi do enzymatycznej hydrolizy przekaźnika na cholinę i anion octanowy. Za przemianę tą odpowiedzialny jest enzym esteraza acetylocholinowa zakotwiczony w błonie postsynaptycznej przez związaną kowalencyjnie grupę glikolipidową. Enzym ten ma bardzo dużą liczbę obrotów (25 000 na sekundę), co pozwala na bardzo sprawne usunięcie przekaźnika ze szczeliny synaptycznej. Spadek stężenia wolnej acetylocholiny prowadzi z kolei do oddysocjowania cząsteczek przekaźnika od miejsc receptorowych kanału i jego zamknięcie. Pompa sodowo-po K+ Nie jest to jeszcz postsynaptyczna je sodu. Powrót do sta Dokonuje tego wbu 3.1.2 Neuron przetw Wszystkie komórki. Tutaj nas gdy jej stan pobudz pobudzający jak i h neuronu. Dzięki te dochodzi do skomp komórek nerwowyc występują w najp reagować na zmian Na+ Acetylocholinoesteraza tasowa e równoznaczne z powrotem synapsy do stanu początkowego, gdyż błona st ciągle zdepolaryzowana na skutek obecności pod błoną dużego stężenia jonów nu wyjściowego (spoczynkowego) wymaga więc usunięcia z komórki jonów sodu. dowana w błonę postsynaptyczną ATP-zależna pompa sodowo-potasowa. arza dochodzące do niego sygnały sygnały docierające do neuronu poprzez synapsy trafiają ostatecznie do ciała tępuje przetwarzanie informacji. Komórka wyśle aksonem swój impuls nerwowy, enia przekroczy pewna wartość progową. Synapsy mogą mieć zarówno charakter amujący, a ponadto każda z nich ma swoistą wagę, z jaką wpływa na ogólny stan mu ciało neuronu spełnia rolę swoistego biologicznego komputera, w którym likowanego przetwarzania informacji pochodzącej jednocześnie od wielu innych h. Wyjaśnia to, dlaczego nawet bardzo proste układy komórek nerwowych jakie rostszych organizmach wielokomórkowych potrafią w bardzo celowy sposób y zachodzące w organizmie i jego środowisku zewnętrznym. 32 Część I: Błony biologiczne 3.2.2 Propagacja potencjału czynnościowego Pojawia się teraz pytanie, co powoduje przejście kanału sodowego ze stanu zamkniętego w stan otwarty. Wiemy, że potrzebny jest do tego niewielki spadek polaryzacji błony: od -60 mV (stan spoczynkowy) do -40 mV (wartość progowa). Co jednak wywołuje tą zmianę? Odpowiedź uzyskano w trakcie badań na wyizolowanych fragmentach aksonu. Okazało się, że sztuczne pobudzenie aksonu wywołuje już samo zbliżenie do powierzchni aksonu elektrody o dodatnim potencjale. Efekt pola elektrycznego tej elektrody (indukcja elektrostatyczna) jest wystarczający, aby lokalnie przekroczona została wartość progowa i kanały sodowe przeszły w stan otwarty. Otwarcie kanałów powoduje dalszą depolaryzację i przebiegunowanie błony. Przebiegunowany fragment błony wywołuje w swoim sąsiedztwie przekroczenie wartości progowej i otwierają się kolejne kanały sodowe. Proces powtarza się na kolejnym fragmencie aksonu i wzdłuż aksonu przebiega fala depolaryzacji i przebiegunowania: impuls nerwowy. W warunkach fizjologicznych impuls zostaje zapoczątkowany we fragmencie błony komórkowej ciała neuronu znajdującej się u podstawy aksonu. Stan otwarty jest krótkotrwały i już po ok. 1 ms, nawet przy ciągłej depolaryzacji błony, przechodzi spontanicznie w stan nieaktywny. Kanał w tym stanie nie może być otwarty bez uprzedniej polaryzacji błony. Za inaktywację kanału sodowego odpowiedzialna jest pętla domeny cytozolowej znajdująca się pomiędzy powtórzeniem III i IV. Tak więc kanał sodowy w czasie przejścia impulsu nerwowego ulega cyklowi jednokierunkowych przemian. Kanał otwiera się tylko raz w czasie jednego impulsu. Występowanie okresu nieaktywnego zapewnia przy tym rozprzestrzenianie się impulsu tylko w jednym kierunku. Przejście ze stanu otwartego w nieaktywny pełni również funkcję wyłącznika 35 Część I: Błony biologiczne 36 czasowego określającego czas trwania prądu jonów sodu. Akson komórki nerwowej może przekazywać setki impulsów nerwowych na sekundę tylko dlatego, że kanał sodowy pozostaje w stanie otwartym tylko ok. 1 ms.