Pobierz Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń – budowa i funkcje i więcej Publikacje w PDF z Biochimica Medica tylko na Docsity!
12 www.postepybiochemii.pl
Patrycja Barańska *
Hanna jerczyńska
Zofia Pawłowska
Zakład Biofizyki Molekularnej i Medycznej Instytutu Fizjologii i Biochemii, uniwersytet Medyczny, łódź
*Zakład Biofizyki Molekularnej i Medycznej Instytutu Fizjologii i Biochemii, uniwersy- tet Medyczny w łodzi, ul. Mazowiecka 6/8, 92 - 215 łódź, e-mail: [email protected]; tel. (42) 678 33 93; faks: (42) 678 94 33
Artykuł otrzymano 5 lipca 2004 Artykuł zaakceptowano 14 stycznia 2005
Słowa kluczowe: angiogeneza; czynnik wzro- stu śródbłonka naczyń; neuropiliny.
Wykaz skrótów: ERK (ang. extracellularly re- gulated protein kinases ) – kinazy regulowane sygnałami zewnątrzkomórkowymi; FAK (ang. focal adhesion kinase ) – kinaza ognisk adhezyj- nych; FGF (ang. fibroblast growth factor ) – czyn- nik wzrostu fibroblastów; Flk-1 (ang. foetal liver kinase 1 ) – płodowa kinaza wątrobowa 1; Flt-1 (ang. fms-related tyrosine kinase1 ) – kinaza tyrozynowa 1 związana z fms; HIF-1 (ang. hy- poxia inducible factor-1 ) – czynnik indukowany hipoksją; HuVEC (ang. human umbilical vein endothelial cells ) – komórki śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej; KDR (ang. kinase insert do- main receptor ) – receptor z domeną kinazową; MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase ) – kinaza białkowa aktywowana przez mitogeny; PlGF (ang. placenta growth factor ) – łożyskowy czynnik wzrostu.
Podziękowania: Praca powstała w trakcie realizacji projektu badawczego KBN nr PBZ- -KBN-039/P04/2001 oraz Centrum Doskona- łości „MolMed” finansowanego z funduszy unii Europejskiej.
czynnik wzrostu śródbłonka naczyń – budowa i funkcje
StreSzczenie
c
zynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), opisany początkowo jako czynnik stymulu- jący przepuszczalność naczyń krwionośnych, uważany jest obecnie za jeden z głównych czynników regulujących proces angiogenezy, czyli tworzenia nowych naczyń krwionośnych w postaci wypustek z naczyń już istniejących. Pełni on wiodącą rolę w regulacji zarówno prawidłowej, jak i patologicznej angiogenezy. Niniejsza praca jest próbą zwięzłego podsu- mowania aktualnego stanu wiedzy na temat rodziny białek VEGF, struktury genu kodują- cego ludzki VEGF, regulacji jego ekspresji, receptorów VEGF oraz jego udziału w przeka- zywaniu sygnału. celem tej pracy jest również przedstawienie najnowszych osiągnięć do- tyczących poznanych biologicznych funkcji pełnionych przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz ich klinicznego znaczenia.
WPROWADZENIE
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF - ang. vascular endothelial growth factor ) jest głównym regulatorem procesu różnicowania komórek, powstawania nowych naczyń krwionośnych (waskulogeneza) oraz tworzenia odgałęzień z już istniejącej sieci naczyń (angiogeneza) [1]. VEGF moduluje wiele ważnych funkcji fizjologicznych komórek śródbłonka i jest jednym z najważniejszych czynników wzrostu i przeżycia śródbłonka naczyń. Stymuluje on rozwój prawidłowej sieci naczyń krwionośnych w procesie embriogenezy, jak również dalszego rozwo- ju organizmu, w przebiegu ciąży, gojenia się ran i cyklu miesięcznego u kobiet [ 2 ]. VEGF jest także zaangażowany w proces angiogenezy towarzyszący stanom patologicznym takim jak: retinopatia cukrzycowa, choroba nowotworowa, reu- matoidalne zapalenie stawów, łuszczyca i inne [2,3].
Początkowo VEGF opisany był jako czynnik stymulujący przepuszczalność naczyń krwionośnych [4]. Obecnie wiedza dotycząca zarówno złożoności typów i izoform VEGF, jak i procesów regulowanych przez ten czynnik jest ogromna. Najszersze zainteresowanie budzi jednak jego rola w procesach nowotworo- wych. Stymulowanie komórek śródbłonka do proliferacji oraz tworzenia no- wych naczyń krwionośnych stanowi ważny element regulowania procesu wzro- stu i przenoszenia się nowotworu. Badania ostatnich lat nad prawdopodobnymi regulatorami procesu angiogenezy wykazały wiodącą rolę VEGF w regulacji za- równo prawidłowej, jak i patologicznej angiogenezy. Obecne wysiłki badawcze w dziedzinie terapii nowotworów skupiają się między innymi na neutralizowa- niu VEGF w celu zahamowania procesu angiogenezy [3]. Celem tej pracy jest przedstawienie aktualnego stanu wiedzy o VEGF, jego budowie, receptorach, a w szczególności pełnionych funkcjach biologicznych i znaczeniu klinicznym.
RODZINA BIAłEk VEGF
VEGF występuje w postaci glikozylowanego homodimeru o masie cząstecz- kowej 46-48 kDa, który w warunkach redukujących dysocjuje na dwie identycz- ne podjednostki, monomery o masie 24 kDa połączone wiązaniami disiarczko- wymi [4-6]. Oczyszczone białko VEGF (VEGF-A) otrzymali po raz pierwszy Gospodarowicz i in. [5] oraz Ferrara i Henzel [6] w roku 1989. Do rodziny VEGF należą również spokrewnione strukturalnie, lecz różniące się aktywnością biolo- giczną VEGF-B, -C, -D i E oraz łożyskowy czynnik wzrostu (PlGF). Członkowie rodziny VEGF różnią się m.in. powinowactwem wiązania z receptorami VEGF, lokalizacją oraz intensywnością ekspresji.
VEGF (VEGF-A) jest pierwszym opisanym czynnikiem wzrostu naczyń na- leżącym do rodziny czynników, których geny zostały zidentyfikowane w ciągu ostatnich kilku lat. Geny PlGF, VEGF-A, -B, -C, -D zlokalizowane są w genomie komórek ssaków, natomiast sekwencję homologiczną do pozostałych, a kodują-
Postępy Biochemii 51 (1) 2005 13
cą czynnik VEGF-E odnaleziono w genomie wirusa orf (pa- rapoxwirusa).
łożyskowy czynnik wzrostu występujący w postaci dwóch izoform PlGF 131 oraz PlGF 152 , będących wynikiem różnicowego cięcia i składania pierwotnego transkryptu, został zidentyfikowany jako pierwszy czynnik homologicz- ny do VEGF [7]. PlGF występuje w postaci homodimeru i wykazuje niewielkie działanie mitogenne w stosunku do komórek śródbłonka. Heterodimery PlGF:VEGF, które two- rzą się zarówno in vitro jak i in vivo wykazują nieco silniej- szą aktywność, jednak nadal około siedmiokrotnie słabszą niż homodimery VEGF. Sugeruje to, że PlGF bierze udział w negatywnej regulacji aktywności VEGF poprzez przesu- nięcie równowagi w kierunku dimerów o mniejszej aktyw- ności biologicznej [8].
Badania funkcji VEGF-B, odkrytego w 1995 roku w klo- nowanym fragmencie cDNA myszy [9], nie zyskały począt- kowo dużego zainteresowania. Ekspresja VEGF-B, często razem z VEGF-A, ma miejsce już we wczesnym życiu pło- dowym, głównie w kardiomiocytach, mięśniach szkieleto- wych i mięśniach gładkich dużych naczyń krwionośnych [9,10]. Na skutek alternatywnego składania genu, zlokalizo- wanego u człowieka na chromosomie 11q13, powstają dwie izoformy: VEGF-B 167 oraz VEGF-B 186 [9], które po uwolnieniu wiązane są z proteoglikanami błony komórkowej. Doniesie- nia na temat fenotypu myszy pozbawionych genu VEGF-B są sprzeczne. Wiadomo, że brak tego genu nie wpływa na żywotność i płodność zwierząt. Bellomo i in. [11] donoszą, że myszy takie mają mniejsze serca oraz charakteryzują się dysfunkcją tętnic wieńcowych, podczas gdy Aase i in. [12] udowadniają, że brak tego czynnika nie wpływa szkodli- wie na prawidłowe ukształtowanie systemu sercowo-na- czyniowego zwierząt zarówno w okresie rozwoju, jak i w dorosłym organizmie. Silvestre i in. [13] wskazują także na istotną rolę czynnika w stymulacji procesu angiogenezy in vivo , jednak nadal główną przeszkodą w określeniu funkcji biologicznej samego VEGF-B jest jego częste współwystępo- wanie z VEGF-A, z którym tworzy heterodimery wykazują- ce własną aktywność biologiczną.
VEGF-C człowieka syntetyzowany jest w formie białka prekursorowego, które po całkowitej obróbce proteolitycz- nej jest uwalniane z komórki w postaci homodimeru [2,9]. Jego gen jest zlokalizowany na chromosomie 4q34. VEGF-C jest konieczny w procesie tworzenia naczyń limfatycznych w rozwoju embrionalnym, lecz wykazuje aktywność rów- nież w tworzeniu naczyń krwionośnych [14,15]. Ze wzglę- du na jego mitogenne i ochronne działanie w stosunku do komórek białaczkowych, uwalniany z komórki VEGF-C, może mieć negatywny wpływ na postępy leczenia białaczek [16].
VEGF-D wykazuje podobne do VEGF-C działanie mito- genne w stosunku do komórek śródbłonka naczyń krwio- nośnych i limfatycznych. Czynnik ten syntetyzowany jest w komórkach płuc, serca, mięśni szkieletowych, okrężni- cy i jelita cienkiego. Czynniki regulujące ekspresję genu VEGF-D, zlokalizowanego na chromosomie Xp22.3, nie zostały dotychczas poznane [17]. Interesującym odkryciem jest znalezienie w genomie wirusa orf , atakującego kozy,
owce i sporadycznie człowieka, sekwencji homologicznej do genów pozostałych członków rodziny VEGF [2]. Może to sugerować, że gen wirusowego VEGF pochodzi od ssaków jako żywicieli i ulega dryfowi genetycznemu. VEGF-E wy- kazuje działanie proangiogenne [18], a dotychczasowa wie- dza na temat oddziaływania tego czynnika z jednym z re- ceptorów VEGF została streszczona w pracy Shibuya [19]. Do rodziny białek VEGF możemy również zaliczyć biał- ka sv-VEGF wyizolowane z jadów węży. Z powodu ich ho- mologii do VEGF występującego u naczelnych nazywane są one białkami „VEGF-like”. Jedno z nich wyizolowane zosta- ło z jadu węża Bothrops insularis [20].
STRukTuRA GENu kODującEGO VEGF (VEGF-A) cZłOWIEkA ORAZ IZOFORMy VEGF
Gen kodujący czynnik wzrostu VEGF człowieka zloka- lizowany jest na chromosomie 6p21.3, a na jego strukturę składa się osiem egzonów oddzielonych siedmioma regio- nami niekodującymi (Rys. 1) [21,22]. Analizy sekwencji cDNA wskazywały na możliwość występowania kilku izo- form VEGF, różniących się długością łańcucha aminokwa- sowego, a więc również właściwościami. Różnorodność ta, będąca skutkiem procesu dojrzewania mRNA, jest już opisana. W wyniku alternatywnego składania genu VEGF powstaje kilka izoform białka zawierających odpowiednio 121, 145, 148, 162, 165, 183, 189 i 206 aminokwasów [21-23].
Analiza regionu promotorowego genu ujawniła istnienie pojedynczego miejsca startu transkrypcji w bezpośrednim sąsiedztwie potencjalnego wiązania czynnika transkrypcyj- nego Sp-1, oraz dwóch potencjalnych miejsc wiązania dla czynników AP-1 i AP-2 [21]. Egzony 1-5 oraz 8 kodują część białka niezbędną do prawidłowego wiązania się liganda z jego receptorami. Natywny VEGF jest glikoproteiną wy- stępującą w postaci homodimeru o charakterze zasadowym, wiążącą heparynę. Najbardziej rozpowszechniona, syntety- zowana przez wiele typów komórek zarówno zdrowych jak i zmienionych, oraz najbardziej aktywna biologicznie forma to VEGF 165. Pozbawiona jest ona reszt kodowanych przez egzon 6. Transkrypt izoformy VEGF 121 wykrywany w więk- szości komórek i tkanek, w których ulega ekspresji VEGF (^165) [21,22], nie ma reszt kodowanych zarówno przez egzon 6 jak i 7, niosący informację o sekwencji, która oprócz wiązania heparyny odpowiada za wiązanie z jednym z receptorów VEGF, neuropiliną-1. W przeciwieństwie do powszechnie występujących izoform VEGF 121 , VEGF 165 , VEGF 189 , formy VEGF 145 , VEGF 183 oraz VEGF 206 występują in vivo niezwy- kle rzadko, np. najdłuższą z nich zlokalizowano jedynie w tkankach embrionalnych.
Rysunek 1. Struktura genu kodującego VEGF.
Postępy Biochemii 51 (1) 2005 15
sorowych komórek hematopoetycznych [9]. Ekspresja VEG- FR2 zachodząca we wczesnych etapach rozwoju odgrywa istotną rolę w różnicowaniu i dojrzewaniu komórek śród- błonka, ich proliferacji i migracji. Receptor ten wykazuje mniejsze powinowactwo do liganda niż VEGFR1 (Kd ~
VEGFR3 wykrywany jest we wszystkich embrionalnych komórkach śródbłonka, a w dorosłych tkankach obecny jest głównie w śródbłonku naczyń limfatycznych, co wskazuje na jego udział w limfangiogenezie. Receptor ten nie rozpo- znaje VEGF-A, natomiast wiąże formy VEGF-C i –D. Izofor- my VEGF-C i –D są również rozpoznawane przez receptor VEGFR2, chociaż z niższym powinowactwem. Brak genu VEGFR3 zaburza prawidłowy rozwój układu naczyniowe- go [9].
ROZPuSZCZAlNE RECEPTORY sVEGFR1 I sVEGFR
W celu zbadania miejsc wiążących ligand konstruowano różne typy rozpuszczalnych receptorów VEGF, sprawdza- jąc równocześnie ich zdolność do wywołania odpowiedzi biologicznej [8]. Obecnie zidentyfikowano dwa naturalnie występujące rozpuszczalne receptory: sVEGFR1 i sVEGFR2. sVEGFR1 powstaje na skutek różnicowego cięcia i składania pierwotnego transkryptu VEGFR1 [9]. Forma ta zawiera je- dynie domeny homologiczne do immunoglobulin, przez co nie wykazuje aktywności kinazowej. Wykazano, że wiąże on z wysokim powinowactwem wszystkie izoformy VEGF oraz różne formy PlGF i VEGF-B. Wysoki poziom sVEGFR występuje w surowicy kobiet ciężarnych [29].
Receptor sVEGFR2 został zidentyfikowany przez Ebos’a i in. [29] w ludzkim i mysim osoczu. Budowa sVEGFR2 i je- go powinowactwo do poszczególnych form VEGF pozosta- ją dotychczas nieznane.
Rola biologiczna krótszych form receptorów nie jest do końca poznana. W przypadku sVEGFR1 badania wskazują głównie na jego funkcję jako negatywnego regulatora ak- tywności VEGF, a więc naturalnego inhibitora angiogenezy [29].
NEuROPIlINY
Białka błonowe neuropilina-1 i neuropilina-2 stanowią specyficzną grupę receptorów dla dwóch strukturalnie nie- związanych rodzin białek – semaforyn klasy 3 i niektórych form VEGF wiążących heparynę, tj. VEGF 165 [30]. Wiązanie liganda z neuropiliną-1 lub neuropiliną-2 nie jest w stanie uruchomić szlaku sygnałowego w nieobecności innych białek na powierzchni komórki. Do zapoczątkowania pro- cesu przekazania sygnału do wnętrza komórki, po zwią- zaniu VEGF z neuropilinami, niezbędne jest sąsiedztwo innego receptora np.VEGFR1 lub VEGFR2. VEGF 165 wiąże się z obiema neuropilinami, VEGF 145 może wiązać się tyl- ko z neuropiliną-2, natomiast forma VEGF 121 zwykle nie wiąże się z żadną z nich. Wiązanie VEGF 165 z neuropiliną- wzmacnia funkcję sygnałową receptora VEGFR2. Neuro- pilina-1 została pierwotnie zidentyfikowana jako receptor semaforyny kontrolujący wzrost aksonów. Obecność tego białka obserwuje się również w komórkach śródbłonka
i komórkach mezenchymy otaczających naczynia krwio- nośne oraz w niektórych komórkach nowotworowych [31]. Białko to bierze udział w kształtowaniu systemu naczynio- wego serca. Na część zewnątrzkomórkową neuropiliny- składa się część homologiczna do domeny MAM (ang. meprin, A5 protein, receptor protein - tyrosine phosphatase mu ) biorącej udział w oddziaływaniach białko-białko, domeny b homologicznej do domen C1 i C2 czynników krzepnię- cia krwi (VII i V) oraz domeny a homologicznej do nieka- talitycznych regionów składników C1r i C1s komplementu [31]. Ze względu na niewielką domenę cytoplazmatyczną, neuropilina nie odgrywa roli w aktywacji złożonych szla- ków sygnałowych. Z uwagi na jej występowanie wspólnie z pozostałymi receptorami VEGF [31] uważa się ją raczej za dodatkowy receptor VEGFR2 wiążący ligand. Nadekspre- sja neuropiliny u myszy prowadzi do różnego rodzaju wad w budowie morfologicznej naczyń oraz do zniekształcenia mięśnia sercowego, natomiast brak tego białka prowadzi do nieprawidłowego unaczynienia neuronów oraz wad aorty i innych naczyń krwionośnych [31]. Ostatnio wykazano, że semaforyna-3F działająca poprzez receptor neuropili- ny-2 hamowała proliferację, angiogenezę in vivo oraz fos- forylację kinazy ERK1/2 stymulowaną VEGF 165 w ludzkich komórkach śródbłonka HuVEC (ang. human umbilical vein endothelial cells ). Semaforyna 3A blokuje wiązanie VEGF (^165) z neuropiliną-1 (koreceptorem VEGFR2). Sugeruje się, że w ten sposób hamowane jest przekazywanie przez VEGFR sygnału proangiogennego [30]. W wiązaniu VEGF 165 z neu- ropiliną współzawodniczą w różnym stopniu semaforyny. Rola neuropiliny jako mediatora procesu angiogenezy zo- stała opisana szczegółowo w pracy Miao i in. [31].
REGulAcjA EkSPRESjI VEGF
STYMulACJA EKSPRESJI
Jednym z głównych czynników indukujących ekspresję mRNA dla VEGF, zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych, jest obniżenie ciśnienia parcjalnego tlenu. Wysoka ekspresja VEGF w niedotlenionych komór- kach nowotworowych, wystawionych na bezpośredni kontakt z komórkami nekrotycznymi sugeruje, że lokalna hipoksja jest głównym czynnikiem indukującym ekspre- sję VEGF. W 1995 roku w regionie promotorowym 5’ genu VEGF zidentyfikowano 28-zasadową sekwencję wysoce ho- mologiczną do miejsca wiążącego, zasadowe białko HIF- (czynnik indukowany hipoksją), którego związanie stymu- luje transkrypcję genu VEGF [32]. Zaobserwowano również niezależną od HIF-1 stymulację transkrypcji tego genu na skutek niedotlenienia [33]. W odpowiedzi na niskie ciśnie- nie tlenu może następować nagromadzenie adenozyny, która aktywując swój receptor A2 powoduje wzrost stęże- nia cAMP, co prowadzi do podniesienia poziomu mRNA dla VEGF [2]. Stymulacja transkrypcji genu VEGF nie jest jednak jedynym mechanizmem działającym w odpowiedzi na niedotlenienie komórki. Hipoksja może przyczyniać się także do wiązania z mRNA dla VEGF białek wywołujących potranskrypcyjny wzrost stabilności mRNA (m.in. białka HuR) [2]. Stymulacja ekspresji VEGF może nastąpić rów- nież pod wpływem działania różnego rodzaju cytokin, czy też na skutek mutacji niektórych onkogenów prowadzącej do transformacji nowotworowej (Tab. 1).
16 www.postepybiochemii.pl
HAMOWANIE EKSPRESJI
Szeroko prowadzone badania nad lekami antynowotwo- rowymi blokującymi angiogenezę doprowadziły do odkry- cia wielu jej inhibitorów, które bezpośrednio oddziałują z VEGF lub z jego receptorami. Inhibitory RAS farnezylo- transferazy blokują szlak sygnałowy onkogenu, prowadzą- cy do wzrostu produkcji VEGF przez komórki nowotwo- rowe oraz obniżenia syntezy inhibitora angiogenezy, jakim jest trombospondyna–1. Wiele działających pośrednio inhi- bitorów procesu angiogenezy tj. ZD1839 (Iressa), ZD6474, OSI774 (Tarceva), CI1033, PKI1666, IMC225 (Erbitux) [3] i PS 341 [34] (inhibitor proteasomu) hamuje syntezę VEGF przez komórki nowotworowe. Syntezę niektórych czyn- ników angiogennych, m.in. transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) i VEGF hamują przeciwciała Trastuzu- mab – blokujące szlak sygnałowy jednego z onkogenów, zwiększając równocześnie ekspresję inhibitora angiogenezy
- trombospondyny. Inne przeciwciała monoklonalne Beva- cizumab (Avastin) przeciw VEGF są obecnie stosowane w II i III fazie badań klinicznych. Niskocząsteczkowy inhibitor VEGF, NM-3 izokumaryna hamuje selektywnie proliferację komórek śródbłonka oraz tworzenie nowych naczyń in vi- tro. Stosowany szeroko w badaniach klinicznych talidomid powoduje obniżenie poziomu VEGF w krążeniu, co jest sko- relowane z pozytywnym efektem terapeutycznym w wielu typach białaczek i innych chorobach krwi [3].
Na uwagę zasługuje także oddziaływanie VEGF z meta- loproteazą macierzy zewnątrzkomórkowej ADAMTS1 (ang. disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif-1 ), która po związaniu z VEGF blokuje fosforylację receptora VEGFR2 i hamuje jego funkcję sygnałową [35]. Hamowa- nie proangiogennego działania VEGF przez ADAMTS1 jest procesem odwracalnym, gdyż dysocjacja tego kompleksu przywraca naturalną aktywność VEGF.
uDZIAł VEGF W PRZEWODZENIu SyGNAłu
Receptory VEGF różnią się stopniem aktywacji po zwią- zaniu liganda, jak również uruchamianymi ścieżkami sy- gnałowymi. Jak już wspomniano, VEGFR1, mimo dużego powinowactwa do VEGF, ulega niewielkiej aktywacji. Jego zdolność do przekazywania sygnału wydaje się być mała, jednak wciąż pojawiają się doniesienia podkreślające istotne znaczenie biologiczne tego receptora. Najlepiej zbadanym
działaniem VEGF, poprzez receptor VEGFR1, jest stymula- cja migracji monocytów oraz ekspresji czynnika tkankowe- go w tych komórkach, jednak znaczenie tych procesów nie jest w pełni poznane. Ostatnie badania wskazują na udział VEGFR1 w pozytywnej regulacji tworzenia struktur kapila- ropodobnych [36] oraz w podtrzymaniu angiogenezy po- przez stymulację szlaków antyapoptotycznych biegnących przez białko antyapoptotyczne Bcl-2 i kinazę PI3 [37]. Głównym receptorem, poprzez który VEGF wywołuje szerokie spektrum odpowiedzi biologicznych jest receptor VEGFR2. Receptor ten pośredniczy w większości znanych szlaków przekazywania sygnału, w komórkach śródbłon- ka aktywowanych VEGF, prowadzących do określonych funkcji biologicznych (Rys. 3). Wykazano, że podobnie jak inne receptory kinazowe, wiąże się on z białkami zawiera- jącymi domeny SH2 i białkowymi fosfatazami tyrozyno- wymi [1], uruchamia także skomplikowaną sieć sygnałową prowadzącą do regulacji prawie wszystkich procesów skła- dających się na efekt biologiczny wywoływany VEGF. Ak- tywacja VEGFR2, po związaniu liganda, następuje w wy- niku dimeryzacji receptorów i autofosforylacji tyrozyny w cytoplazmatycznej części receptora. W cząsteczce tego receptora zidentyfikowano sześć miejsc autofosforylacji na tyrozynach w pozycjach: 951, 996, 1054, 1059, 1175 i 1214 [38]. VEGF stymuluje fosforylację tyrozynową i aktywność białek sygnałowych komórek śródbłonka tj. PlCγ, MAPK, kinazy PI3, FAK, białek adaptorowych Nck, Crk, i paksy- liny. Również członek rodziny białek sygnałowych Shc
- białko Sck bierze udział w przekazywaniu sygnału indu- kowanego pod wpływem VEGF w komórkach śródbłonka naczyń. Pod wpływem VEGF w komórkach HuVEC nastę- puje przyłączenie Sck do tyrozyny w pozycji 1175 receptora VEGFR2 [39]. Rola fosforylacji większości miejsc receptora VEGFR2 jest w dalszym ciągu nieznana. Badania ostatnich lat wykazują, że w proces angiogenezy inicjowany przez VEGF zaangażowane są również niektóre szlaki integryno- we, pośredniczone przez receptory dla białek adhezyjnych, m.in. integryny α (^) vβ 3 oraz αvβ 5 [1].
AkTyWNOść BIOlOGIcZNA VEGF
VEGF jest silnym i specyficznym mitogenem dla komórek śródbłonka pochodzących z naczyń układu krwionośnego i limfatycznego [1]. Wywołuje on tworzenie struktur kapila- ropodobnych w modelu angiogenezy in vitro , podobnie jak zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów – bFGF (ang. basic fibroblast growth factor ) [40], oraz silną odpowiedź w postaci angiogenezy w różnych modelach in vivo [21,41]. Możemy stwierdzić, że VEGF jest niezbędny do tworzenia nowych naczyń krwionośnych, ale nie jest wystarczający. Stymulu- je on powstawanie naczyń „niedojrzałych”, o ścianie zbyt przepuszczalnej, które bez udziału takich czynników jak zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, angiopoetyna-1, czy efryny, nie są w stanie „dojrzeć” i prawidłowo funkcjo- nować [41].
udział VEGF oraz jego receptorów w regulacji wielu genów jest już dobrze udokumentowany [1]. VEGF bierze udział w reorganizacji macierzy zewnątrzkomórkowej po- przez indukcję ekspresji aktywatorów plazminogenu i ich inhibitorów [42] oraz metaloproteinaz [43]. Działa on rów-
Tabela 1 : Czynniki stymulujące ekspresję VEGF
Hipoksja Cytokiny Onkogeny HIF-1 EGF, TGF-β, KGF KRAS, HRAS Il-1β SRC adenozyna Il-1, PGE 2 ERBB Il-6 EGFR potranskrypcyjna IGF-1 FOS stabilizacja mRNA v-p3k PTTG Bcl- EGF - ang. epidermal growth factor, naskórkowy czynnik wzrostu ; TGF-β - ang. trans- forming growth factor β , transformujący czynnik wzrostu β; KGF -ang. keratinocyte growth factor , czynnik wzrostu keratynocytów; Il - interleukina; PGE2 - ang. pro- staglandin E2 , prostaglandyna E2; IGF-1 - ang. insulin-like growth factor , insulino- podobny czynnik wzrostu.
18 www.postepybiochemii.pl
zwiększając fosforylację i gromadzenie się FAK, jak rów- nież na białka z nim związane: paksylinę oraz kinazę tyro- zynową Pyk2 [8]. Oprócz bezpośredniej aktywacji zaobser- wowano także selektywne wiązanie VEGFR2 z integryną αV β 3. Adhezja takiego kompleksu do witronektyny, liganda αV β 3 , zwiększała zarówno mitogenne działanie VEGF, jak i aktywność receptora [52], którego rola w ochronie powsta- jących naczyń krwionośnych została już potwierdzona. Na podstawie wyników badań procesu unaczyniania siatkówki oka myszy pozbawionej genu kodującego β 3 można wnio- skować, że funkcja kompleksu VEGFR2/αV β 3 w tworzeniu i utrzymaniu prawidłowej struktury naczyń jest jednak dru- gorzędowa. Obserwacje przebiegu patologicznej angioge- nezy u zwierząt pozbawionych podjednostek β 3 i β 5 wska- zują nawet na możliwość hamowania angiogenezy przez integryny α (^) V β 3 i αV β 5 [53].
MITOGENNE DZIAłANIE VEGF
VEGF poprzez aktywację VEGFR2 wykazuje działanie mitogenne w stosunku do wielu typów komórek śródbłon- ka. Główne ścieżki sygnałowe prowadzące do wzrostu syn- tezy DNA i proliferacji komórek prowadzą przez silnie ak- tywowane VEGF kinazy ERK1/2, stymulujące z kolei sze- reg czynników transkrypcyjnych. Jedna z tych dróg oparta jest na znanej ścieżce sygnałowej Ras/Raf/MEK/ERK wio- dącej od kinazowych receptorów czynników wzrostu [54]. Droga ta indukowana jest fosforylacją białka adaptorowego Grb2, które kierując białko SOS do błony komórkowej wy- wołuje aktywację białka Ras i uruchamia kaskadę sygnału. Są jednak dowody na istnienie niezależnej od białka Ras drogi aktywującej kinazy ERK. Ścieżka ta uruchamiana jest przez aktywny receptor VEGFR2, który fosforyluje związa- ną z nim fosfolipazę C-γ [55]. Prowadzi to do powstawa- nia diacyloglicerolu (DAG) oraz trisfosfoinozytolu (IP3), a w konsekwencji do aktywacji kinazy białkowej C (PKC) i uwolnienia jonów wapnia do cytoplazmy. Droga ta zosta- ła potwierdzona poprzez badania, w których obserwowano zahamowanie aktywacji ERK po zastosowaniu inhibito- rów farmakologicznych kinazy białkowej C oraz oligonu- kleotydów antysensowych przeciwko izoformom kinazy białkowej C-α i -ζ [56]. Inhibitory kinazy białkowej C efek- tywnie hamowały również stymulowany VEGF proces an- giogenezy [57]. Istnieją jednak doniesienia, że stymulacja proliferacji przez VEGF wiąże się ze spadkiem aktywności jednej z izoform kinazy biakowej C, PKC-δ [58]. W zgodzie z tymi sygnałami pozostaje obserwacja spowolnienia cyklu komórkowego w komórkach śródbłonka z nadekspresją ki- nazy biakowej C-δ. Mitogenne działanie VEGF może więc zależeć zarówno od wzrostu jak i obniżenia aktywności po- szczególnych izoform kinazy białkowej C.
Kolejną drogą działania VEGF jest indukcja szlaku kinaz MAP związana z aktywacją kinazy JNK. Dodatkowo wska- zuje się na możliwe wzajemne oddziaływanie pomiędzy tą drogą sygnałową a ścieżką angażującą kinazy ERK w szla- ku prowadzącym do wywoływanych przez VEGF efektów mitogennych [1].
MIGRACJA KOMóREK
Degradacja błony podstawnej i macierzy zewnątrzko- mórkowej przez metaloproteinazy jest procesem umożli- wiającym migrację komórek śródbłonka. VEGF indukując wzrost poziomu tych enzymów zaangażowany jest już w początkowe etapy tego procesu [43].
Głównym przekaźnikiem sygnału wiodącego do stymu- lacji migracji komórek jest kinaza FAK (ang. focal adhesion kinase ), która jak już wspomniano, zaangażowana jest także w szlak sygnałowy prowadzący do zwiększenia przeży- walności komórek. VEGF indukuje fosforylację tyrozynową FAK oraz paksyliny kierując tym samym białka do nowych ognisk adhezyjnych, co zostało zbadane w komórkach Hu- VEC [8]. VEGF aktywuje kinazę FAK bezpośrednio poprzez fosforylację reszt Tyr-397 i Tyr-861, która w przypadku Tyr- -861 może następować pośrednio również poprzez kinazę Src. Zahamowanie działania kinazy Src zmniejsza migrację komórek indukowaną przez VEGF. Stwierdzono, że fosfo- rylacja kinazy FAK jest ułatwiana przez białko Hsp90, a za- stosowanie inhibitora białka szoku termicznego zatrzymy- wało migrację [59].
Obserwacje zahamowania migracji stymulowanej VEGF pod wpływem inhibitora kinazy p38 (SB203580), sugerują udział tej kinazy należącej do rodziny kinaz MAP w tym procesie [59]. Ostatnie doniesienia wskazują, że zarówno szlak prowadzący przez białko p38, jak również kinazę FAK indukowany jest poprzez VEGFR2, którego pełna fosforyla- cja i zdolność do aktywacji powyższych szlaków jest zależ- na od jego interakcji z integryną α (^) V β 3 [60].
Kolejna droga prowadząca od VEGF do migracji wiedzie prawdopodobnie przez oddziaływanie szlaku kinazy FAK z NO, który stymuluje ruch komórki bez obecności che- moatraktanta. NO reguluje stabilność ognisk adhezyjnych i fosforylację kinazy FAK, a fosforylacja syntazy tlenku azo- tu (eNOS – ang. e ndothelial nitric oxide synthase ) jest koniecz- na do indukcji migracji przez VEGF [61].
Oprócz wymienionych już szlaków VEGFR2 pośredni- czy również w aktywacji białek z rodziny Rho i chociaż me- chanizm tego działania jest nieznany, to wiadomo, że jest on niezależny od jonów wapnia i kinazy PI3K, a białka te odgrywają istotną rolę w regulacji migracji komórek śród- błonka, w której pośredniczą także białka adaptorowe Nck i Crk [62].
WZROST PRZEPuSZCZAlNOŚCI NACZYń KRWIONO- ŚNYCH
VEGF był zdefiniowany początkowo jako czynnik zwięk- szający przepuszczalność naczyń, jednak do dziś ścieżki sy- gnałowe uczestniczące w tym procesie zostały słabo pozna- ne. Stwierdzono na przykład, że w regulacji przepuszczal- ności naczyń uczestniczą białka z rodziny Src; brak genu kodującego pp60 c-Src^ hamuje odpowiedź komórek na VEGF [63]. udział w tym procesie tlenku azotu i prostacyklin zo- stał potwierdzony obserwacjami spadku przepuszczalności
Postępy Biochemii 51 (1) 2005 19
naczyń wywołanym działaniem inhibitorów zarówno syn- tazy tlenku azotu (eNOS), jak i cyklooksygenazy (COX) [1].
Fosforylacja białek odpowiedzialnych za adhezję mię- dzykomórkową indukowaną VEGF, która prowadzi do zniszczenia połączeń między komórkami, może być jednym z mechanizmów wywołujących wzrost przepuszczalności naczyń [1].
PATOlOGICZNA ANGIOGENEZA
Podwyższony poziom VEGF obserwowany jest w więk- szości tkanek nowotworowych [2]. VEGF uważany jest za aktywator angiogenezy nowotworowej. Zwiększona eks- presja genu VEGF jest ściśle związana ze złym rokowaniem i zwiększoną częstością występowania przerzutów u pa- cjentów z nowotworami. u pacjentów z rakiem przewodu pokarmowego lub sutka obserwuje się pozytywną korelację między ekspresją VEGF a gęstością naczyń krwionośnych w bezpośrednim otoczeniu guza nowotworowego. Wysoka ekspresja mRNA dla VEGF w nowotworach oraz wysoki poziom VEGF w innych jednostkach chorobowych związa- nych z patologiczną angiogenezą potwierdzają hipotezę, że VEGF jest kluczowym mediatorem tego procesu. Zwiększo- ną ekspresję mRNA dla VEGF obserwuje się bezpośrednio w komórkach nowotworowych, podczas gdy w komórkach śródbłonka sąsiadujących z nowotworem zwiększeniu ulega poziom mRNA dla receptorów VEGFR1 i VEGFR2. Wskazuje to na parakrynny mechanizm działania VEGF. Duże zainteresowanie budzi ostatnio możliwy udział VEGF w tworzeniu się i rozwoju blaszki miażdżycowej. Okazuje się, że substancja, która według wielu badaczy miała być panaceum na miażdżycę i jej konsekwencje, może tę choro- bę pogłębiać. Badania przeprowadzone na myszach i króli- kach wykazały, że VEGF zwiększa rozmiary i przyspiesza tworzenie blaszek miażdżycowych. Celletti i in. stwierdzili, że po wstrzyknięciu VEGF, do krwi przedostaje się bardzo wiele komórek macierzystych śródbłonka. Takich komó- rek było również znacznie więcej w blaszkach miażdżyco- wych myszy traktowanych VEGF, niż u zwierząt, którym podano obojętne białko [64,65]. Wiele wskazuje na to, że tworzenie unaczynienia może przyspieszać rozwój miaż- dżycy. Neowaskularyzacja w blaszce miażdżycowej pod wpływem podwyższonego, w odpowiedzi na hipoksję, po- ziomu VEGF może prowadzić do niestabilności i pęknięcia tej blaszki [27,66]. Dotychczasowej wiedzy na temat pozy- tywnej roli egzogennie użytego VEGF w regeneracji tkanek towarzyszyły kontrowersyjne doniesienia o wpływie VEGF na tworzenie patologicznej blaszki wewnętrznej naczynia (neointimy). W świetle najnowszych badań bardzo ważną rolę zarówno w procesie regeneracji uszkodzonej tkanki, jak i tworzenia neointimy odgrywa endogenny VEGF [67]. Za- równo jego nadekspresja, jak i rozmieszczenie w komórce endogennej formy prowadzą do zaburzenia czasu trwania odnowy uszkodzonego śródbłonka. Opóźnienie procesu regeneracji śródbłonka może inicjować kaskadę złożonych molekularnych i komórkowych oddziaływań, mogących prowadzić do zmiany wielkości tworzącej się neointimy. Może ono być również odpowiedzialne za różnice w loka- lizacji komórek progenitorowych. Różny czas ekspozycji uszkodzonej tkanki na krążące czynniki wzrostu i tlenek azotu może mieć wpływ na wielkość neointimy. Wyjaśnie-
nie mechanizmu tego bardzo złożonego procesu regulacyj- nego z udziałem VEGF wymaga jeszcze dodatkowych ba- dań.
PODSuMOWANIE
Pomimo różnorodności czynników mających prawdopo- dobnie wpływ na proces angiogenezy, VEGF odgrywa klu- czową, niezastąpioną rolę w wielu stanach fizjologicznych i patologicznych związanych z tym procesem. Zastosowa- nie przeciwciał anty-VEGF lub inhibitorów sygnału przeka- zywanego przez receptory, a także oligonukleotydów anty- sensowych blokujących działanie VEGF może mieć znacze- nie w leczeniu wielu nowotworów i innych chorób, również jako terapia wspomagająca. Biorąc pod uwagę kluczową rolę systemu VEGF – receptory VEGF w rozwoju układu naczyń krwionośnych i homeostazie komórek śródbłonka naczyń, poznanie właściwości sygnałowych receptorów VEGFR i VEGFR2 może określić drogi prowadzące do regulacji podstawowych funkcji biologicznych komórek śródbłon- ka takich jak: różnicowanie, morfogeneza i angiogeneza. Oprócz głównych terapeutycznych wysiłków badawczych dotyczących zahamowania stymulacyjnego działania VEGF na proces angiogenezy, bardzo obiecującą możliwością jest zastosowanie rekombinowanego VEGF lub terapii genowej w przypadkach uszkodzenia lub upośledzonego rozwo- ju śródbłonka. Metody analizy proteomicznej stosowane ostatnio do identyfikacji białek, które ulegają modyfikacji pod wpływem aktywacji komórek śródbłonka czynnikiem VEGF, pozwalają lepiej poznać mechanizmy jego działania prowadzące do regulacji angiogenezy [68,69]. Wiedza na temat tych oddziaływań może znaleźć zastosowanie w le- czeniu wielu chorób, u podłoża których leży zaburzenie procesu angiogenezy.
PIśMIENNIcTWO
- Zachary I, Gliki G (2001) Signaling transduction mechanisms me- diating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res 49: 568–
- Ferrara N, Davis-Smyth T (1997) The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev 18: 4-
- Kerbel R, Folkman J (2002) Clinical translation of angiogenesis inhi- bitors. Nat Rev Cancer 2: 727-
- Connolly DT, Heuvelman DM, Nelson R, Olander JV, Eppley Bl, Delfino JJ, Siegel NR, leimgruber RM, Feder J (1989) Tumor vascu- lar permeability factor stimulates endothelial cell growth and angio- genesis. J Clin Invest 84: 1470-
- Gospodarowicz D, Abraham J, Schilling J (1989) Isolation and cha- racterization of a vascular endothelial cell mitogen produced by pi- tuitary-derived folliculo stellate cells. Proc Natl Acad Sci uSA 86: 7311-
- Ferrara N, Henzel W J (1989) Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 161: 851-
- Maglione D, Guerriero V, Viglietto G, Delli–Bovi P, Persico M G (1991) Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein re- lated to the vascular permeability factor. Proc Natl Acad Sci uSA 88: 9267-
- Zachary I (2001) Signaling mechanisms mediating vascular protec- tive actions of vascular endothelial growth factor. Am J Physiol Cell Physiol 280: C1375-C
- Petrova TV, Makinen T, Alitalo K (1999) Signaling via Vascular En- dothelial Growth Factor receptors. Exp Cell Res 253: 117-
Postępy Biochemii 51 (1) 2005 21
- Kazi AS, lotfi S, Goncharova EA, Tliba O, Amrani Y, Krymskaya VP, lazaar Al (2004) Vascular endothelial growth factor-induced secretion of fibronectin is ERK dependent. Am J Physiol lung Cell Mol Physiol 286: l539-
- Alon T, Hemo I, Itin A, Pe’er J, Stone J, Keshet E (1995) Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat Med 1: 1024-
- Yamaguchi H, Wang HG (2001) The protein kinase PKB/Akt regu- lates cell survival and apoptosis by inhibiting Bax conformational change. Oncogene 20: 7779-
- Carmeliet P, lampugnani MG, Moons l, Breviario F, Compernolle V, Bono F, Balconi G, Spagnuolo R, Oostuyse B, Dewerchin M (1999) Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogen- esis. Cell 98: 147-
- Tran J, Rak J, Sheehan C, Saibil S, laCasse E, Korneluk R, Kerbel R (1999) Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 264: 781-
- Soldi R, Mitola S, Strasly M, Defilippi P, Tarone G, Bussolino F (1999) Role of alphavbeta3 integrin in the activation of vascular endothelial growth factor receptor-2. EMBO 18: 882-
- Reynolds lE, Wyder l, lively JC, Taverna D, Robinson SD, Huang X, Sheppard D, Hynes RO, Hodivala-Dilke KM (2002) Enhanced pa- thological angiogenesis in mice lacking beta3 integrin or beta3 and beta5 integrins. Nat Med 8: 27-
- Meadows KN, Bryant P, Pumiglia K (2001) Vascular endothelial growth factor induction of the angiogenic phenotype requires Ras activation. J Biol Chem 276: 49289-
- Takahashi T, Yamaguchi S, Chida K, Shibuya M (2001) A single au- tophosphorylation site on KDR/Flk-1 is essential for VEGF-A-de- pendent activation of PlC-gamma and DNA synthesis in vascular endothelial cells. EMBO J 20: 2768–
- Gliki G, Abu-Ghazaleh R, Jezequel S, Wheeler-Jones C, Zachary I (2001) Vascular endothelial growth factor-induced prostacyclin production is mediated by a protein kinase C (PKC)-dependent activation of extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2 involving PKC-delta and by mobilization of intracellular Ca2+. Bio- chem J 353: 503–
- Gliki G, Wheeler-Jones C, Zachary I (2002) Vascular endothelial growth factor induces protein kinase C (PKC)-dependent Akt/PKB activation and phosphatidylinositol 3’-kinase-mediates PKC del- ta phosphorylation: role of PKC in angiogenesis. Cell Biol Int 26: 751–
- Shizukuda Y, Tang S, Yokota R, Ware JA (1999) Vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell migration and proliferation depend on a nitric oxide-mediated decrease in protein kinase Cdelta activity. Circ Res 85: 247-
- Rousseau S, Houle F, Kotanides H, Witte l, Waltenberger J, landry J, Huot J (2000) Vascular endothelial growth factor (VEGF)-driven actin-based motility is mediated by VEGFR2 and requires concer- ted activation of stress-activated protein kinase 2 (SAPK2/p38) and geldanamycin-sensitive phosphorylation of focal adhesion kinase. J Biol Chem 275: 10661-
- Masson-Gadais B, Houle F, laferriere J, Huot J (2003) Integrin alpha- vbeta3, requirement for VEGFR2-mediated activation of SAPK2/p and for Hsp90-dependent phosphorylation of focal adhesion kinase in endothelial cells activated by VEGF. Cell Stress Chaperones 8: 37-
-
- Dimmeler S, Dernbach E, Zeiher AM (2000) Phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase at ser-1177 is required for VEGF- -induced endothelial cell migration. FEBS lett 477: 258–
- Stoletov KV, Gong C, Terman BI (2004) Nck and Crk mediate distinct VEGF-induced signaling pathways that serve overlapping functions in focal adhesion turnover and integrin activation. Exp Cell Res 295: 258-
- Eliceiri BP, Puente XS, Hood JD, Stupack DG, Schlaepfer DD, Huang XZ, Sheppard D, Cheresh DA (2002) Src-mediated coupling of focal adhesion kinase to integrin alpha(v)beta5 in vascular endothelial growth factor signaling. J Cell Biol 157: 149-
- Inoue M, Itoh H, ueda M, Naruko T, Kojima A, Komatsu R, Doi K, Ogawa Y, Tamura N, Takaya K, Igaki T, Yamashita J, Chun TH, Ma- satsugu K, Becker AE, Nakao K (1998) Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in human coronary atherosclerotic lesions: possible pathophysiological significance of VEGF in progression of atherosclerosis. Circulation 98: 2108-
- Celletti Fl, Waugh JM, Amabile PG, Brendolan A, Hilfiker PR, Dake MD (2001) Vascular endothelial growth factor enhances atheroscle- rotic plaque progression. Nature Medicine 7: 425-
- Heeschen C, Jang JJ, Weis M, Pathak A, Kaji S, Hu RS, Tsao PS, John- son Fl, Cooke JP. (2001) Nicotine stimulates angiogenesis and pro- motes tumor growth and atherosclerosis. Nat Med 7: 833-
- Hutter R, Carrick FE, Valdiviezo C, Wolinsky C, Rudge JS, Wie- gand SJ, Fuster V, Badimon JJ, Sauter BV (2004) Vascular endothelial growth factor regulates reendothelialization and neointima forma- tion in a mouse model of arterial injury. Circulation 110: 2430-
- Pawlowska Z, Baranska P, Jerczynska H, Koziolkiewicz W, Cier- niewski CS (2005) Cellular machinery for protein synthesis is highly upregulated in VEGF-activated human endothelial cells. Proteomics 5 (3) (w druku)
- Baranska P, Pawlowska Z, Jerczynska H, Cierniewski CS (2003) The role of vascular endothelial growth factor in an early phases of pro- angiogenic changes in human endothelial cells. J Thromb Haemost suppl 1, CD
Vascular endothelial growth factor – structure and functions
Patrycja Barańska * , Hanna jerczyńska, Zofia Pawłowska
Department of Molecular and Medical Biophysics, Institute of Physiology and Biochemistry, Medical university of lodz, 6/8 Mazowiecka St., 92- lodz, Poland *e-mail: [email protected]
key words: angiogenesis, vascular endothelial growth factor, neuropilins
ABStrAct
Vascular endothelial cell growth factor (VEGF), oryginally described as a vascular permeability factor, is currently known as one of the main factors which regulate angiogenesis. It plays an important role in the regulation of normal as well as pathological angiogenesis. In this paper we try to shortly review the actual knowledge on VEGF protein family, its expression, VEGF receptors and role of VEGF in signal transduction. The aim of this review is also to summarize recent achievements in research on biological functions of vascular endothelial growth factor and their clinical applications.
