Deaminaza AMP mięśnia sercowego w ontogenezie człowieka, Publikacje z Biochimica Medica

Pobierz Deaminaza AMP mięśnia sercowego w ontogenezie człowieka i więcej Publikacje w PDF z Biochimica Medica tylko na Docsity!

Ann. Acad. Med. Gedan. 2012, 42, 21–

Iwona Rybakowska 1 , Magdalena StępińSka 1 , Maciej krzyżanowSki 2 , GRzeGoRz szRedeR 3 , StaniSław Bakuła 4 , kRystIan kaletha 1

Deaminaza amp mięśnia sercowego

w ontogenezie człowieka

HuMan Heart aMp-deaMinaSe in ontogeneSiS

(^1) zakład Biochemii i Fizjologii klinicznej gdańskiego uniwersytetu Medycznego kierownik: prof. dr hab. krystian kaletha (^2) katedra i zakład Medycyny Sądowej gdańskiego uniwersytetu Medycznego kierownik: dr hab. zbigniew jankowski (^3) pomorskie centrum traumatologiczne gdańsk (^4) katedra rehabilitacji gdańskiego uniwersytetu Medycznego kierownik: dr hab. Stanisław Bakuła, prof. nadzw.

w ontogenezie człowieka skład izozymowy deaminazy aMp w mięśniu szkieletowym ulega zmianom. prezentowane w pracy wyniki sugerują, że ontogenetycznie uwarunkowa- ne zmiany składu izozymowego deaminazy aMp zachodzą również mięśniu sercowym.

deaminaza aMp (aMp – aminohydrolaza – ec 3.5.4.6.) katalizuje nieodwracalną, hydro-

lityczną deaminację kwasu adenylowego (aMp) do kwasu inozynowego (iMp).

u człowieka deaminaza aMp kodowana jest przez rodzinę trzech, niezależnych genów,

odpowiedzialnych za syntezę izoenzymów: mięśniowego (M, aMpd1), wątrobowego (l,

aMpd2) oraz erytrocytarnego (e, aMpd3) [7].

w mięśniach szkieletowych ssaków, gdzie aktywność deaminazy aMp jest wielokrotnie

wyższa aniżeli w pozostałych tkankach i narządach, znaczenie fizjologiczne katalizowanej przez

deaminazę aMp reakcji wiąże się głównie z funkcjonowaniem cyklu nukleotydów purynowych

[6]. w mięśniu sercowym natomiast, wydaje się ona być związana bardziej z utrzymywaniem

właściwej puli nukleotydów adenilowych oraz prawidłowych wartości ładunku energetycznego

adenylanów (łea).

deaminazę aMp z serca ludzkiego wyizolowano w roku 1979 [4]. zaadsorbowany na

fosfocelulozie enzym, wypływał z kolumny w jednym szczycie aktywności i w obecności

100 mM kcl prezentował sigmoidalną kinetykę wysycenia, ze stałą półwysycenia około

7 mM. obecność 1 mM atp zmieniała sigmoidalny kształt krzywej kinetycznej na hiperbo-

liczny obniżając wartość tej stałej do około 3 mM. 2 mM ortofosforan sigmoidalność krzywej

pogłębiał, podwyższając wartość stałej półwysycenia do około 8 mM. Badania późniejsze

22 i. rybakowska i in.

z użyciem zmodyfikowanej procedury preparatywnej [8], uwidoczniły w wypływającym z

kolumny eluacie dwa szczyty aktywności, z których pierwszy mało aktywny wypływał przy

0,75 M stężeniu kcl, zaś drugi zasadniczy wypływał z kolumny w 0,75-2 M gradiencie

stężenia tej soli [8].

w rozwoju ontogenetycznym człowieka, w mięśniu szkieletowym zaobserwować można

stopniową zmianę składu izozymowego deaminazy aMp. pojawiające się kolejno formy enzy-

mu embrionalna i płodowa, w miarę dojrzewania tkanki, zastąpione zostają ostatecznie przez

formę dojrzałą [3]. o składzie izozymowym deaminazy aMp w mięśniu sercowym ssaków oraz

formach rozwojowych tego enzymu wiadomo niewiele. Badania autorów japońskich wykazały,

że w pierwszych tygodniach życia pozapłodowego, skład izozymowy deaminazy aMp serca

szczura ulega wyraźnym zmianom, pozwalając wyróżnić trzy, chromatograficznie odmienne

formy enzymu w okresie noworodkowym, przechodzące w późniejszym okresie życia w jedną,

chromatograficznie jednorodną izoformę dojrzałą, znajdowaną w sercu szczura dorosłego [9].

cel pracy

celem niniejszej pracy jest zbadanie aktywności oraz właściwości chromatograficznych i

kinetyczno-regulacyjnych deaminazy aMp, wyizolowanej z serca ludzkiego w trzech różnych

etapach rozwoju osobniczego człowieka.

Materiał i Metody

przeprowadzone badania uzyskały wcześniejszą zgodę niezależnej komisji etyki Badań

naukowych przy akademii Medycznej w gdańsku nr nkeBn/413/2000.

Materiałem do izolacji enzymu były serca osób dorosłych (5 osób w wieku od 40 do 45 lat),

pozyskane podczas autopsji przeprowadzanej (12-24 godziny po nagłej śmierci) w zakładzie

Medycyny Sądowej guM lub serca noworodków (5 osób w wieku do jednego miesiąca) i

płodów (15 płodów w 27-28 tygodniu) pozyskanych podczas autopsji przeprowadzanej (12-

godziny po śmierci) w ii klinice położnictwa i ginekologii guM. pozyskane tkanki zamra-

żano w temperaturze -70°c, zapobiegając w ten sposób spadkowi aktywności enzymatycznej,

a potem po uprzednim rozmrożeniu, używano dla celów preparatywnych.

zamrożone komory mięśnia sercowego (o łącznej masie około 10 g) rozdrabniano, a następ-

nie homogenizowano w trzykrotnej objętości buforu ekstrakcyjnego Smiley’a, zawierającego

dodatkowo inhibitor trypsyny (w stężeniu 1 mg/ml) oraz 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu

(pMSF). oczyszczanie enzymu prowadzono wedle zmodyfikowanej metody Sueltera opisanej

uprzednio [8]. zaadsorbowany na fosfocelulozie enzym przepłukiwano 0,4 M i 0,75 M kcl,

a następnie eluowano 0,75-2 M gradientem stężeń chlorku potasu, przy szybkości wypływu

około 7 ml/h.

w wyniku chromatografii na fosfocelulozie wyekstrahowany z mięśnia sercowego enzym

oczyszczony został blisko dwudziestokrotnie, a uzyskane w wyniku tego procesu preparaty

enzymatyczne (otrzymane ze zlania najbardziej aktywnych frakcji eluatu) prezentowały aktyw-

ność specyficzną wynoszącą odpowiednio blisko 1,4; 2,5 i 0,9 mmol uwolnionego amoniaku na

minutę, na miligram białka dla preparatu pochodzącego z serca płodu, noworodka i dojrzałego

24 i. rybakowska i in.

ryc. 1. chromatografia na kolumnie z fosfocelulozą. a – deaminaza aMp serca płodu; B – deami- naza aMp serca noworodka; c – deaminaza aMp serca człowieka dorosłego

Fig. 1. chromatography on a phosphocellulose column. a – aMp-deaminase from the human fetus heart; B – aMp-deaminase from the human neonate heart; c – aMp-deaminase from the human mature heart

deaminaza aMp mięśnia sercowego 25

gradientem stężeń tej soli i bardziej aktywny, reprezentował enzym nie zdegradowany lub

nieznacznie zdegradowany.

tabela ii przedstawia wartości parametrów kinetycznych reakcji katalizowanej przez de-

aminazę aMp serca ludzkiego, w badanych okresach ontogenezy, pomierzone w nieobecności

i w obecności najważniejszych modulatorów jego aktywności. jak to wynika z tabeli ii, w

nieobecności efektorów allosterycznych wartości stałej półwysycenia (S 0,5 ) wyliczone dla

enzymu wyizolowanego z serca płodu i noworodka były istotnie niższe (p< 0,001) od warto-

ści tej stałej wyliczonej dla enzymu wyizolowanego z serca człowieka dorosłego. obecność

efektorów allosterycznych (atp, adp, ortofosforan) modyfikowała w poszczególnych grupach

głównie wartość stałej półwysycenia, wpływając na szybkość maksymalną reakcji jedynie

nieznacznie. w przypadku enzymu wyizolowanego z serca noworodka, szybkość maksymalna

reakcji katalizowanej przez deaminazę aMp przewyższała znacząco (p<0,001), niezależnie od

braku czy też obecności efektorów allosterycznych, wartości tego parametru wyznaczone dla

enzymu pochodzącego z serca ludzkiego w innych okresach ontogenezy.

dySkuSja

cechą charakterystyczną metabolizmu serca jest duży dobowy obrót energii oraz koniecz-

ność stałej, niezakłóconej regeneracji zużywającego się atp [2]. w prawidłowo ukrwionym

mięśniu sercowym resynteza atp przebiega sprawnie i polega na fosforylacji adp przy udziale

energii uwolnionej podczas procesów utleniania kwasów tłuszczowych i glukozy. w pracują-

cym sercu degradacja i regeneracja atp są ze sobą ściśle sprzężone, a wytwarzany podczas

reakcji miokinazowej aMp może ulegać następnie deaminacji do iMp, w reakcji katalizowanej

przez deaminazę aMp, albo też defosforylacji do adenozyny, w reakcji katalizowanej przez

deaminaza aMp mięśnia sercowego 27

perbolizacja krzywej kinetycznej połączona ze spadkiem wartości stałej półwysycenia (tabela

ii). w obecności ortofosforanu widoczne było natomiast pogłębienie sigmoidalnego charakteru

krzywej kinetycznej i równoczesny wzrost wartości stałej półwysycenia (tabela ii).

przedstawione w pracy wyniki badań wskazują wyraźnie, że w trakcie ontogenezy człowie-

ka, w jej okresie noworodkowym deaminaza aMp staje się bardziej aktywna oraz zmienia swoją

podatność na oddziaływanie efektorów allosterycznych. przedstawione powyżej odmienności

chromatograficzne i kinetyczne enzymu serca noworodka sugerują, że w tym okresie rozwoju

osobniczego człowieka, podobnie jak to obserwowano w przypadku deaminazy aMp z mięśnia

szkieletowego człowieka [3], deaminaza aMp może zmieniać swój skład izozymowy.

ryc. 2. Metabolizm nukleotydów purynowych w sercu (według żydowo M. [11]). enzymy: 1 – atp-azy, 2 – cyklaza adenylanowa, 3 – fosfodiesteraza, 4 – miokinaza, 5 – fosfataza, 6 – 5´-nu- kleotydaza, 7 – deamiaza aMp, 8 – deaminaza adenozyny, 9 – fosforylaza nukleozydowa puryn

Fig. 2. purine nucleotide metabolism in the heart (according to żydowo M. [11]). enzymes: 1 – atp-ases, 2 – adenylate cyclase, 3 – phosphodiesterase, 4 – Myokinase, 5 – phosphatase, 6 – 5´nucleotidase, 7 – aMp- -deaminase, 8 – adenosine deaminase, 9 – purine nucleotide phosphorylase

28 i. rybakowska i in.

wnIoskI

przedstawione wyniki badań wskazują, że w ontogenezie człowieka, w mięśniu sercowym,

podobnie jak w mięśniu szkieletowym, dochodzi najpewniej do zmian w składzie izozymowym

deaminazy aMp. najwyższa aktywność specyficzna deaminazy aMp w sercu ludzkim wydaje

się przypadać na okres noworodkowy ontogenezy. czy ma to związek ze zmieniającymi się

w tym okresie powszechnie, wymogami metabolizmu tkankowego pozostaje sprawą otwartą.

piŚMiennictwo

1. chaney a. l., Marbach e. p.: Modified reagents for determination of urea and ammonia. clin. chem. 1962, 8, 130. – 2. chodorowski z., rybakowska i., Sein anand j., kaletha k.: Metabolizm energetyczny niewydolnego serca. przegl. lek. 2009, 66, 6, 356. – 3. kaletha k., nowak g.: developmental forms of human skeletal-muscle aMp deaminase. the kinetic and regulatory properties of the enzyme. Biochem j. 1988, 249, 1, 255. – 4. kaletha k., Składanowski a., Bogdanowicz S., żydowo M.: purification and some regulatory properties of human heart adenylate deaminase. int. j. Biochem. 1979, 10, 11, 925. – 5. kochan z., Smoleński r.t., yacoub M.H., Seymour a.l.: nucleotide and adenosine metabolism in different cell types of human and rat heart. j. Mol. cell. cardiol. 1994, 26, 11, 1497. – 6. lowenstein j.M.: ammonia production in muscle and other tissues: the purine nucleotide cycle. physiol. rev. 1972, 52, 2, 382. – 7. Morisaki t., Sabina r.l., Holmes e.w.: adenylate deaminase. a multigene family in humans and rats. j. Biol. chem. 1990, 265, 20, 11482. – 8. nowak g., kaletha k.: Molecular forms of human heart muscle aMp deaminase. Biochem. Med. Metab. Biol. 1991, 46, 2, 263. – 9. ogasawara n., goto H., yamada y., watanabe t.: distribution of aMp-deaminase isozymes in rat tissues. eur. j. Biochem. 1978, 87, 2,
2. – 10. Van Belle H., wynants j., goossens F.: Formation and release of nucleosides in the ischemic myocardium. is the guinea-pig the exception? Basic res. cardiol. 1985, 80, 6, 653.
3. żydowo M.: adenine compouns and the heart. int. j. Biochem. 1976, 7, 8, 353.

i. rybakowska, M. Stępińska, M. krzyżanowski, g. Szreder, S. Bakuła, k. kaletha

HuMan Heart aMp-deaMinaSe in ontogeneSiS

Summary

in human ontogenesis the isozymic pattern of skeletal muscle aMp-deaminase changes. the experi- mental results presented here suggest that the same may concern the heart muscle of human.

adres: dr n. med. iwona rybakowska zakład Biochemii i Fizjologii klinicznej guMed ul. dębinki 1, 80-210 gdańsk e-mail: [email protected]