Pobierz Immobilizacja enzymów na wybranych nośnikach ... i więcej Publikacje w PDF z Transport tylko na Docsity! POLITECHNIKA POZNAŃSKA WYDZIAŁ TECHNOLOGII CHEMICZNEJ INSTYTUT TECHNOLOGII I INŻYNIERII CHEMICZNEJ ROZPRAWA DOKTORSKA IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH mgr inż. JAKUB ŁUKASZ ZDARTA Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego i przedłożona Radzie Wydziału Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej w celu uzyskania stopnia doktora Promotor: prof. dr hab. inż. Teofil Jesionowski Promotor pomocniczy: dr inż. Agnieszka Kołodziejczak-Radzimska Poznań 2017 o Ogromne podziękowania składam na ręce mojego Promotora, Pana Prof. dr. hab. inż. Teofila Jesionowskiego, za ważne i cenne rady oraz wskazówki, a także za pokazanie, że warto być konsekwentnym i wytrwałym w dążeniu do celu. Niniejszą pracę dedykuję mojej żonie Agacie, która była dla mnie wsparciem w chwilach zwątpienia, motywacją, pomocą oraz cierpliwością, których potrzebowałem. Bez Ciebie ta praca by nie powstała. Dziękuję IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 6 - SPIS TREŚCI SPIS TREŚCI ................................................................................................................................ 6 SPIS SKRÓTÓW I SYMBOLI ........................................................................................................ 9 WPROWADZENIE ...................................................................................................................... 11 PRZEGLĄD LITERATURY ......................................................................................................... 13 1. Enzymy ............................................................................................................................................. 13 1.1. Budowa i właściwości enzymów ................................................................................................. 13 1.2. Podział enzymów i ich zastosowanie .......................................................................................... 16 1.3. Lipazy ......................................................................................................................................... 19 1.4. Parametry determinujące właściwości katalityczne enzymów .................................................... 22 1.5. Podsumowanie wiadomości dotyczących enzymów ................................................................... 28 2. Immobilizacja enzymów .................................................................................................................. 29 2.1. Definicja i podstawowe informacje dotyczące immobilizacji enzymów ....................................... 29 2.2. Metody immobilizacji enzymów................................................................................................... 33 2.3. Wykorzystanie i zalety stosowania immobilizowanych enzymów ............................................... 50 2.4. Podsumowanie podstawowych informacji o immobilizacji enzymów .......................................... 54 3. Nośniki w immobilizacji enzymów ................................................................................................. 55 3.1. Podstawowe informacje i podział nośników ................................................................................ 55 3.2. Przegląd nośników stosowanych w immobilizacji enzymów ....................................................... 60 3.3. Modyfikatory powierzchni w immobilizacji enzymów................................................................... 72 3.4. Podsumowanie wiadomości dotyczących nośników w immobilizacji enzymów .......................... 75 CEL I ZAKRES PRACY .............................................................................................................. 77 CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA .................................................................................................. 78 4. Metodyka przygotowania nośników wykorzystanych w procesie immobilizacji enzymów ...... 79 4.1. Synteza hydroksyapatytu ............................................................................................................ 79 4.2. Synteza krzemionki typu zol-żel.................................................................................................. 79 4.3. Otrzymywanie materiału hybrydowego krzemionka-lignina ........................................................ 80 4.4. Synteza układu chityna-lignina ................................................................................................... 81 4.5. Modyfikacja chityny związkami typu POSS ................................................................................ 82 4.6. Preparatyka gąbki roślinnej z gatunku Luffa cylindrica ............................................................... 83 4.7. Preparatyka gąbki morskiej z gatunku Hippospongia communis ................................................ 83 5. Immobilizacja wybranych enzymów na powierzchni przygotowanych nośników ..................... 84 6. Analiza fizykochemiczna oraz morfologiczna preparatów unieruchomionych enzymów ......... 85 6.1. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera oraz spektroskopia Ramana .............. 85 IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 7 - 6.2. Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim ........................ 86 6.3. Magnetyczny węglowy rezonans jądrowy – 13C CP MAS NMR .................................................. 86 6.4. Ocena morfologii i mikrostruktury z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii cyfrowej ........................................................................................................................... 87 6.5. Mikroskopia sił atomowych ......................................................................................................... 87 6.6. Ocena potencjału elektrokinetycznego (dzeta) ........................................................................... 87 6.7. Analiza elementarna ................................................................................................................... 88 6.8. Charakterystyka parametrów struktury porowatej ....................................................................... 88 6.9. Ocena stabilności termicznej – analiza termograwimetryczna .................................................... 89 6.10. Ocena ilości zimmobilizowanego enzymu – metoda Bradford .................................................. 89 6.11. Określenie wydajności immobilizacji proteazy .......................................................................... 90 7. Ocena aktywności katalitycznej oraz stabilności preparatów immobilizowanych enzymów ... 90 7.1. Aktywność katalityczna preparatów po immobilizacji .................................................................. 90 7.2. Stabilność preparatów po immobilizacji ...................................................................................... 91 7.3. Parametry kinetyczne preparatów po immobilizacji .................................................................... 92 7.4. Reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem ......................................................... 92 7.5. Chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas ......................................................... 93 WYNIKI BADAŃ I ICH ANALIZA ................................................................................................ 95 8. Immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu ....................... 95 8.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych ...................................................................... 95 8.2. Analiza elementarna – ocena składu pierwiastkowego analizowanych materiałów .................... 96 8.3. Analiza parametrów struktury porowatej ..................................................................................... 97 8.4. Określenie ilości unieruchomionego enzymu .............................................................................. 99 8.5. Wydajność procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae ............................................... 99 9. Immobilizacja Amano Lipase A z Aspergillus niger na powierzchni krzemionki typu zol-żel 101 9.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych .................................................................... 101 9.2. Analiza parametrów struktury porowatej ................................................................................... 102 9.3. Stabilność elektrokinetyczna powstałych układów po immobilizacji enzymu ............................ 103 9.4. Określenie ilości unieruchomionego enzymu ............................................................................ 104 9.5. Aktywność katalityczna układów po immobilizacji ALA ............................................................. 105 10. Immobilizacja lipazy typu B z Candida antarctica na powierzchni materiału hybrydowego krzemionka-lignina ............................................................................................................................ 106 10.1. Charakterystyka topografii powierzchni powstałych materiałów – mikroskopia AFM .............. 106 10.2. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych .................................................................. 107 10.3. Ocena składu powierzchniowego oraz charakteru powstałych oddziaływań – analiza XPS ... 109 10.4. Aktywność katalityczna oraz stabilność układów po immobilizacji CALB ............................... 111 IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 10 - NAD+ – utleniona forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego NADH – zredukowana forma dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego PAL – liaza fenyloalaninowa, ang. phenylalanine liase p-NPP – palmitynian para-nitrofenylu p-NP – para-nitrofenol POSS – poliedryczne oligomeryczne silseskwioksany, ang. polyhedral oligomeric silsesquioxanes PRT – proteaza z Aspergillus oryzae PSS – sulfonian polistyrenu, ang. polystyrene sulfonate SBA-15 – krzemionka mezoporowata typu SBA-15, ang. Santa Barbara Amorphous silica SDS – laurylosiarczan sodu SEM – skaningowy mikroskop elektronowy, ang. Scanning Electron Microscope Ser – seryna SWCNT – jednościenne nanorurki węglowe, ang. sigle-walled carbon nanotubes t1/2 – czas aktywności katalitycznej TEOS – tetraetoksysilan, ang. tetraethyl orthosilicate TG – trójglicerydy THF – tetrahydrofuran TRIS – bufor trihydroksymetyloaminometanowy, ang. tris(hydroxymethyl)aminomethane Tyr – tyrozyna U – unit – jednostka aktywności enzymatycznej V – początkowa szybkość reakcji enzymatycznej Vmax – maksymalna szybkość reakcji enzymatycznej VPOSS – ang. Vinyl POSS Cage mixture XPS – spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim, ang. X-ray photoelectron spectroscopy IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 11 - WPROWADZENIE W obecnych czasach wiele uwagi poświęca się realizacji procesów technologicznych w sposób efektywny oraz przyjazny dla środowiska. Trwają, zakrojone na szeroką skalę, poszukiwania stabilnych i wydajnych katalizatorów, które poprzez przyspieszanie reakcji chemicznych umożliwiają obniżenie kosztów ich prowadzenia. Szczególną uwagę zwracają enzymy, naturalne biokatalizatory procesów zachodzących w organizmach żywych, pozwalające na wielokrotne zwiększenie szybkości przemiany. Białka te odznaczają się wysoką specyficznością oraz selektywnością i tym samym znajdują coraz szersze zastosowanie w wielu różnych dziedzinach życia codziennego, nauki oraz przemysłu. Głównym ograniczeniem stosowania biokatalizatorów jest znaczące obniżenie ich aktywności katalitycznej oraz niska stabilność poza warunkami naturalnego występowania. Trudności te powodują, że opracowanie metod poprawiających ich właściwości jest wysoce pożądane. Jedną z takich technik, obecnie najpowszechniej stosowaną, jest immobilizacja. Jej zadanie polega na zwiększeniu stabilności oraz wydłużeniu aktywności unieruchomionego enzymu. Następstwem przyłączenia enzymu, bądź kilku enzymów z różnych grup katalitycznych do nierozpuszczalnego nośnika na drodze immobilizacji jest powstanie zupełnie nowego preparatu charakteryzującego się odmiennymi właściwościami, w porównaniu z natywnym białkiem. Podkreślić należy, że zmianie ulega przede wszystkim forma biokatalizatora, który po procesie unieruchomienia przybiera postać katalizatora heterogenicznego. Co więcej, immobilizacja powoduje zwiększenie odporności enzymów na denaturację wywołaną działaniem skrajnych warunków środowiska reakcji. Łatwość separacji unieruchomionych białek z mieszaniny reakcyjnej, wynikająca z formy biokatalizatora, możliwość ponownego wykorzystania takich układów, a także zwiększenie ich stabilności powodują, że zastosowanie immobilizacji ma bezpośrednie przełożenie na poprawę kontroli katalizowanych reakcji, a także na wzrost wykorzystania biokatalizatorów w wielu procesach. Unieruchomieniu poddana może zostać bardzo szeroka gama białek enzymatycznych, a jednym z najistotniejszych czynników determinujących ich właściwości jest dobór odpowiedniego nośnika. Coraz większym zainteresowaniem cieszą się materiały kompozytowe oraz biopolimerowe, wykorzystywane jako matryce dla enzymów. Charakteryzują się one dobrymi zdolnościami sorpcyjnymi, jak i zdefiniowaną stabilnością termiczną i chemiczną oraz odpornością mechaniczną. Należy podkreślić, że zastosowanie biokompatybilnych oraz stabilnych nośników powoduje, że gama reakcji, które mogą być katalizowane przez immobilizowane enzymy, stale się rozszerza. W ramach niniejszej dysertacji podjęto prace polegające na wykorzystaniu materiałów pochodzenia nieorganicznego: hydroksyapatytu oraz krzemionki typu zol-żel; kompozytowego: materiał krzemionka-lignina i chityna-lignina; jak i organicznego: zmodyfikowana związkami typu POSS chityna oraz gąbka roślinna Luffa cylindrica i szkielet gąbki morskiej Hippospongia communis, jako nośników w procesie immobilizacji proteazy oraz lipaz. W niniejszej pracy doktorskiej wiele uwagi poświęcono na określenie wpływu początkowych parametrów immobilizacji (takich jak: czas, temperatura, początkowe stężenie roztworu enzymu) na ilość unieruchomionego białka oraz aktywność otrzymanych preparatów. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 12 - Zdefiniowano także najbardziej korzystne warunki procesu, zapewniające zachowanie jak najlepszych właściwości katalitycznych przez unieruchomione enzymy. Co więcej, określono wpływ czasu i temperatury magazynowania, ilości następujących po sobie cykli katalitycznych oraz warunków reakcji (pH, temperatura) na zmiany aktywności hydrolitycznej otrzymanych układów enzymatycznych. Z wykorzystaniem zaawansowanych metod oraz technik analitycznych potwierdzono skuteczne unieruchomienie biokatalizatora, jak i podjęto próbę scharakteryzowania rodzaju oddziaływań powstałych pomiędzy matrycą i unieruchomionym enzymem. Możliwość praktycznego zastosowania otrzymanych systemów biokatalitycznych zweryfikowano w oparciu o reakcje transestryfikacji oleju rzepakowego. Podsumowując, przedkładana dysertacja doktorska dostarcza wielu informacji na temat immobilizacji enzymów z grupy hydrolaz na wybranych, funkcjonalnych materiałach nieorganicznych, organicznych oraz kompozytowych. Największe znaczenie w ramach niniejszej pracy mają badania związane ze zdefiniowaniem wpływu rodzaju nośnika oraz warunków procesu na stabilność i aktywność katalityczną unieruchomionych enzymów, a także prace mające na celu wskazanie potencjalnych kierunków zastosowań otrzymanych systemów biokatalitycznych. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 15 - tylko trzy miejsca, a oddziaływania mogą powstawać wyłącznie pomiędzy atomami i grupami komplementarnymi, pasującymi do siebie pod względem chemicznym (rys. 1b) [10]. Teoria trzypunktowego przyłączenia (ang. three-point interaction model) nie opisuje jednak w sposób dostateczny zachodzących przemian energetycznych oraz nie tłumaczy mechanizmów reakcji stereospecyficznych. Dalsze badania dotyczące mechanizmu przemian enzymatycznych doprowadziły do opublikowania przez Daniela Koshlanda w 1958 roku modelu indukowanego dopasowania (ang. induced fit model), który jest ewolucją teorii „zamka i klucza". Według jego założeń centrum aktywne enzymu podczas katalizowanej reakcji zachowuje dużą elastyczność strukturalną, a aminokwasy je tworzące podlegają zmianom konformacyjnym (rys. 1c) [11]. W wyniku tych transformacji, możliwe staje się dokładne dopasowanie cząsteczek substratu do centrum aktywnego enzymu i wytworzenie stabilnych oddziaływań, co w rezultacie umożliwia przeprowadzenie procesu katalitycznego. Należy jednak podkreślić, że ostateczny mechanizm przemian enzymatycznych nie został do końca poznany i ciągle jest przedmiotem intensywnych badań. Enzymy są niezbędne nie tylko do prawidłowego funkcjonowania organizmów żywych. Ze względu na swoje unikalne właściwości i możliwość znacznego zwiększenia szybkości reakcji, znalazły zastosowanie jako efektywne katalizatory wielu procesów technologicznych. Zawdzięczają to zdolnościom do zmniejszenia poziomu wartości energii niezbędnej do przejścia substratu w produkt, poprzez obniżenie swobodnej energii aktywacji Gibbsa [12]. Zredukowanie wartości energii może odbywać się między innymi dzięki deformacjom, jakim poddane zostaje centrum aktywne enzymu oraz cząsteczki substratów. Wzrost szybkości reakcji może zostać osiągnięty także dzięki ograniczeniu niekorzystnych energetycznie oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy substratami i składnikami mieszaniny reakcyjnej. Wykorzystanie nowopowstałych interakcji, jak i odpowiednie zbliżenie substratów do centrum aktywnego skutkuje wytworzeniem otoczenia, które stabilizuje stan przejściowy. Dodatkowo zniekształcenie przez biokatalizator wiązań obecnych w cząsteczkach reagentów powoduje ich osłabienie i rozluźnienie, co w konsekwencji prowadzi do obniżenia energii aktywacji katalizowanej przemiany [13]. Obniżenie poziomu energetycznego przemiany osiągane jest także poprzez poprowadzenie reakcji chemicznej z powstaniem alternatywnego, bardziej stabilnego niż w procesach niekatalitycznych, kompleksu pośredniego enzym- substrat, co bez zastosowania enzymu nie byłoby możliwe. Powyżej opisano wybrane właściwości i niepodważalne zalety białek katalitycznych. Enzymy odpowiedzialne są za prawidłowe kierowanie przemianami zachodzącymi w organizmach żywych, jednak bardzo często znajdują też zastosowanie w wielu różnych dziedzinach życia codziennego, gdzie katalizują szeroką i zróżnicowaną gamę przemian chemicznych. Ze względu na złożoność prowadzonych procesów w jakich uczestniczą, jak i ich ogromną liczbę, konieczne było usystematyzowanie i podział enzymów na odpowiednie grupy. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 16 - 1.2. Podział enzymów i ich zastosowanie Stały rozwój w dziedzinie enzymologii, jak i ciągłe odkrywanie nowych rodzajów enzymów spowodowały, że potrzebne było odpowiednie sklasyfikowanie dotąd poznanych białek katalitycznych. Podział enzymów na poszczególne grupy katalityczne został zaproponowany w drugiej połowie XX wieku przez Międzynarodową Unię Biochemii i Biologii Molekularnej (IUBMB) i klasyfikuje enzymy na sześć głównych grup, w zależności od rodzaju katalizowanej przemiany. Każdemu biokatalizatorowi przypisany został odpowiedni, czteroczęściowy numer, w którym pierwsza cyfra oznacza klasę enzymu, druga i trzecia symbolizują odpowiednio podklasę i podpodklasę, a ostatnia reprezentuje miejsce, jakie białko zajmuje w swojej podpodklasie [14]. Na przykład lipaza trzustkowa posiada nr EC 3.1.1.3, co oznacza, że należy ona do hydrolaz, trzeciej grupy enzymów, i zajmuje pierwsze miejsce w swojej podklasie oraz podpodklasie. Podział enzymów na grupy katalityczne został zaprezentowany w tabeli 1. Większość nazw enzymów pochodzi od nazw substratów, bądź związana jest z rodzajem reakcji, jaką dane białko katalizuje. Do nazw tych dodaje się przyrostek -aza. Spora grupa enzymów posiada nazwy dwuczłonowe, np. dehydrogenaza alkoholowa, w których pierwszy człon związany jest z katalizowanym procesem, a drugi odnosi się do rodzaju substratu. Tabela 1. Podział enzymów na grupy katalityczne wraz z funkcją pełnioną przez każdą z nich oraz wybranymi przykładami enzymów Numer grupy Nazwa grupy Rodzaj katalizowanej reakcji Przykładowe enzymy I oksydoreduktazy kataliza reakcji utleniania i redukcji oraz transport protonów i elektronów pomiędzy cząsteczkami reduktora i utleniacza dehydrogenazy oksydazy hydroksylazy II transferazy przenoszenie wybranej grupy funkcyjnej z cząsteczki donora na cząsteczkę akceptora kinazy aminotransferazy III hydrolazy kataliza procesów hydrolizy – rozpadu wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody lipazy peptydazy IV liazy odszczepienie grup funkcyjnych od cząsteczki substratu i rozkład wiązania chemicznego na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie aldolazy dekarboksylazy hydroliazy V izomerazy konwersja jednej formy izomerycznej danego związku w drugą izomerazy cis-trans epimerazy VI ligazy generowanie nowych związków poprzez wytworzenie wiązania chemicznego pomiędzy dwiema niezależnymi cząsteczkami syntetazy karboksylazy IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 17 - Jak już wspomniano, w oparciu o raport IUBMB wyróżniono sześć głównych grup enzymów, w których sklasyfikowane są wszystkie znane obecnie białka katalityczne. Pierwszą klasę enzymów, EC 1, stanowią oksydoreduktazy. Są to białka odpowiedzialne za katalizowanie reakcji utleniania i redukcji, jak i transport protonów oraz elektronów pomiędzy cząsteczkami reduktora i utleniacza. Enzymy te mogą działać na szeroki wachlarz związków chemicznych, a do najczęściej spotykanych białek spośród tej grupy zaliczyć można dehydrogenazy oraz hydroksylazy. Pierwsze z nich to biokatalizatory biorące udział w procesie odszczepienia atomu wodoru z cząsteczki związku organicznego. Dehydrogenazy są kluczowymi enzymami w cyklu Krebsa, jednak wykorzystywane są także w procesach technologicznych, np. do regeneracji NAD+ do NADH [15]. Hydroksylazy z kolei to enzymy, których zadaniem jest przeprowadzenie procesu przyłączenia ugrupowania hydroksylowego do cząsteczki substratu. Są odpowiedzialne za prawidłowe funkcjonowanie wielu procesów zachodzących w organizmach żywych, lecz wykorzystywane są także w ochronie środowiska, gdzie ułatwiają degradację związków fenolowych zawartych m.in. w ściekach [16]. Do drugiej klasy enzymów, EC 2, należą transferazy, a więc grupa białek, których funkcją jest przenoszenie wybranej grupy funkcyjnej z cząsteczki donora na cząsteczkę akceptora. Dzielą się one na podklasy, w zależności od rodzaju przenoszonej grupy funkcyjnej. Do najważniejszych z tych białek katalitycznych należą kinazy, które przenoszą grupy fosforanowe z cząsteczek ATP na akceptor i odpowiedzialne są za właściwe przeprowadzenie procesu fosforylacji [17] oraz aminotransferazy, nazywane także transaminazami, które są odpowiedzialne za przyspieszenie transportu grupy aminowej (–NH2) z cząsteczki aminokwasu na cząsteczkę α-ketokwasu. Białka te odgrywają istotną rolę w wielu procesach metabolicznych, a ponadto są wykorzystywane w medycynie oraz w diagnostyce chorób wątroby. W tym wypadku monitoruje się poziom ich zawartości w płynach ustrojowych, a zmiany ilości tego białka mogą świadczyć o procesach chorobowych zachodzących w komórkach wątroby [18]. Bardzo liczną grupę enzymów stanowią hydrolazy, EC 3, białka które katalizują procesy hydrolizy, a więc rozpadu różnego rodzaju wiązań chemicznych z udziałem cząsteczki wody. Przez poszczególne enzymy z tej klasy rozłożone mogą zostać wiązania estrowe, peptydowe, β-glikozydowe, fosfodiestrowe w kwasach nukleinowych, czy estrowe w tłuszczach. Warto odnotować, że cechą wspólną białek z tej grupy jest to, że nie wymagają one kofaktorów do poprawnego działania. Szczególne miejsce w tej grupie zajmują lipazy, które zostaną szerzej opisane w podrozdziale 1.3. Numer klasyfikacyjny EC 4 otrzymały liazy, a więc enzymy, które odpowiedzialne są za odszczepienie poszczególnych grup funkcyjnych z cząsteczki substratu i rozkład wiązania chemicznego na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie. Zazwyczaj konsekwencją działania liaz jest rozerwanie jednego wiązania i powstanie w jego miejscu nowego. Kryterium podziału enzymów z tej grupy na podklasy jest rodzaj wiązania, którego rozpad katalizują. W związku z tym wyróżnić można kilka podklas tych enzymów, które biorą udział w procesach rozszczepienia wiązań: węgiel-węgiel, węgiel-azot, węgiel-tlen czy węgiel-siarka [19]. Największe zainteresowanie spośród tej grupy białek katalitycznych wzbudzają aldolazy, enzymy katalizujące reakcje rozszczepienia aldolowego. Są one używane jako IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 20 - Rys. 3. Ułożenie aminokwasów w strukturze lipazy, tworzących α/β sfałdowanie hydrolaz, na podstawie [29] Białka katalizujące procesy hydrolizy wiązań estrowych mogą brać udział w bardzo szerokiej gamie przemian chemicznych, a mechanizm ich działania w dużej mierze determinowany jest przez pochodzenie enzymu, parametry katalizowanego procesu czy obecność wody w mieszaninie reakcyjnej. W środowisku bezwodnym białka te katalizują przede wszystkim procesy syntezy estrów, oraz reakcje estryfikacji i transestryfikacji, natomiast w roztworze wodnym wykazują tendencję głównie do katalizowania i przyspieszania reakcji hydrolizy [31]. Lipazy są jednymi z najbardziej wszechstronnych enzymów, o relatywnie niskiej specyficzności substratowej. Cecha ta, w połączeniu z rolą katalityczną jaką spełniają, spowodowała, że wykorzystywane są w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym, mleczarskim, spożywczym, petrochemicznym czy w przemyśle środków czyszczących (rys. 4) [32-36]. Ważnym, z technologicznego punktu widzenia procesem przemysłowym, w którym wykorzystywane są lipazy jest hydrolityczny rozkład szerokiej gamy olejów roślinnych (olej z oliwek, rzepakowy, słonecznikowy, kokosowy) do kwasów tłuszczowych oraz glicerolu. Proces ten bez zastosowania enzymów wymaga wysokiej temperatury i ciśnienia, co powoduje, że jest wysokoenergetyczny. Wykorzystanie lipaz różnego pochodzenia, pozyskanych m.in. z: Thermomyces lanuginosus, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis czy Geotrichum candidum, powoduje, że reakcja hydrolizy biegnie w dużo łagodniejszych warunkach temperatury (40–60 °C) i ciśnienia, a dodatkowo możliwe jest otrzymanie produktów odznaczających się lepszymi właściwościami użytkowymi oraz wysoką czystością [37-39]. Bardzo duże osiągnięcia zostały także poczynione w zakresie wykorzystania wybranych lipaz w procesie transestryfikacji olejów roślinnych z krótkołańcuchowymi alkoholami alifatycznymi do produkcji biodiesla. Wykorzystanie lipaz otrzymanych między innymi z: Burkholderia cepacia, Pseudozyma antarctica i Candida antarctica, pozwala na otrzymanie biopaliwa o pożądanym składzie i czystości, całkowitą konwersję trójglicerydów oraz kwasów tłuszczowych zawartych w oleju, jak i na prowadzenie procesu w sposób bardziej przyjazny dla środowiska [40-42]. Należy także podkreślić, że enzymatyczna produkcja biodiesla umożliwia wytwarzanie biopaliw bez dodatku glicerolu, którego ekstrakcja z mieszaniny reakcyjnej jest droga i mało efektywna. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 21 - Przemysł spożywczy Przemysł papierniczy Synteza chemiczna Diagnostyka medyczna Przemysł kosmetyczny i farmaceutyczny Detergenty i środki czystości Przemysł kaletniczy PRZEMYSŁOWE WYKORZYSTANIE LIPAZ Rys. 4. Przykłady przemysłowego wykorzystania lipaz Obecnie lipazy są także powszechnie stosowane w syntezie organicznej, gdzie wykorzystywane są do katalizy szerokiej gamy regioselektywnych i stereospecyficznych przemian, jak również do produkcji związków chiralnych oraz rozdziału mieszanin racemicznych [43,44]. Wybrane typy enzymów pochodzenia mikrobiologicznego, pozyskane z Pseudomonas sp., Candida antarctica czy Candida rugosa, pomimo że zbudowane są z analogicznych sekwencji aminokwasów, to jednak diametralnie różnią się przestrzenną strukturą czwartorzędową. To właśnie ta cecha decyduje o ich właściwościach i katalizowaniu różnych typów reakcji chemicznych. Odmienne rozmieszczenie łańcuchów aminokwasowych w przestrzeni determinuje też wysoką regioselektywność oraz enancjoselektywność tych białek [45]. Ze względu na fakt, że wiele pochodnych tłuszczów oraz kwasów karboksylowych, jak i ich pochodnych powszechnie wykorzystuje się w przemyśle farmaceutycznym i kosmetycznym, także i w tych dziedzinach przemysłu zastosowanie znalazły lipazy. W obu gałęziach przemysłu doceniono możliwość realizacji procesów w bardziej łagodnych warunkach, co pozwala zmniejszyć ich koszty. Dodatkowo, zastosowanie białek katalitycznych pomaga przeciwdziałać izomeryzacji, racemizacji, epimeryzacji, a także innym niechcianym zmianom konformacyjnym cząsteczek podczas ich syntezy. W przemyśle kosmetycznym lipazy wykorzystywane są m.in. do produkcji kremów z filtrem przeciwsłonecznym, płynów do kąpieli i olejków zapachowych. W przemyśle farmaceutycznym natomiast Produkcja biopaliw IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 22 - stosowane są do produkcji leków, w których tylko jeden z enancjomerów jest substancją czynną i posiada pożądane właściwości lecznicze [46-48]. Znaczenie trójglicerydów oraz kwasów tłuszczowych w przemyśle spożywczym znane było już od dawna, stąd nie może dziwić duże wykorzystanie lipaz w wielu dziedzinach tego rodzaju przemysłu [49]. Poprzez swoje unikalne właściwości białka te, umożliwiają modyfikację struktury tłuszczów roślinnych, co wykorzystywane jest między innymi w produkcji preparatów do żywienia niemowląt, aby przypominały one mleko matki, a także w produkcji tłuszczów o zmniejszonej kaloryczności [50]. Jednym z ciekawszych zastosowań jest wykorzystanie lipaz do produkcji substytutów masła kakaowego, które charakteryzuje się właściwościami smakowymi oraz użytkowymi zbliżonymi do produktu pochodzenia naturalnego [51]. Ponadto, lipazy wykorzystywane są także przez serowarów, aby przyspieszyć dojrzewanie serów i wzmocnić ich aromat. Warto podkreślić, że omówione bardziej szczegółowo w niniejszym podrozdziale, przemysłowe zastosowania lipaz nie wyczerpują listy procesów, w których białka te mogą być stosowane. Należy zwrócić uwagę na ich powszechne wykorzystanie w przemyśle tekstylnym, papierniczym, kaletniczym czy środków piorących, a ostatnio także w ochronie zdrowia i diagnostyce medycznej [52-56]. Według zgodnej opinii naukowców, w ciągu najbliższych lat nastąpi dalszy, gwałtowny wzrost przemysłowego zastosowania lipaz, stąd dalsze prace nad rozwojem technologii tych enzymów są uzasadnione. 1.4. Parametry determinujące właściwości katalityczne enzymów W ostatnich latach odnotowuje się wyraźny trend wskazujący na wzrost wykorzystania biokatalizatorów w wielu dziedzinach nauki i technologii, czego dowodem jest ciągle rosnąca wartość rynku enzymów, który według prognoz, w 2020 roku powinien osiągnąć wartość ponad 6 mld USD [57]. Białka katalityczne stosowane są w bardzo szerokiej gamie procesów technologicznych, od oczyszczania zdegradowanych wód po przemysł farmaceutyczny, a co więcej, ciągle prowadzone są prace mające na celu ich implementację w nowych branżach nauki i techniki. Istnieje jednak szereg czynników, które mają istotny wpływ na właściwości enzymów, a jednocześnie ograniczają szersze wykorzystanie biokatalizatorów. Wśród najważniejszych należy wymienić: fizykochemiczne parametry środowiska reakcji, którą katalizują enzymy, charakter i rodzaj prowadzonego procesu oraz ilość i typ inhibitorów. Wybrane czynniki wpływające na właściwości katalityczne enzymów zostały zaprezentowane na rys. 5. Spośród najistotniejszych parametrów fizykochemicznych środowiska reakcji, które mają bezpośredni wpływ na działanie enzymów, należy wyróżnić: temperaturę oraz pH prowadzonego procesu, jednak znacząca jest również aktywność wody oraz siła jonowa roztworu. Większość białek katalitycznych osiąga swoją najwyższą aktywność w bardzo wąskim zakresie pH oraz temperatury, które odpowiadają warunkom fizjologicznym pracy enzymu. W przemianach chemicznych wzrost temperatury zazwyczaj powoduje wzrost szybkości reakcji. Podobnie jest IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 25 - Obecność w mieszaninie reakcyjnej innych jonów lub cząsteczek, niebędących bezpośrednimi substratami reakcji enzymatycznej, może mieć duży wpływ na przebieg oraz wydajność realizowanej przemiany. Białka katalityczne są bowiem bardzo czułe na występowanie różnych substancji, które mogą hamować ich aktywność. Substancje te nazywane są inhibitorami i odpowiadają za zmniejszenie katalitycznej efektywności enzymów [64]. Molekuły ograniczające działanie biokatalizatorów mogą łączyć się z ich cząsteczkami na drodze słabych oddziaływań, jak i w sposób trwały, dlatego wyróżnić należy inhibicję odwracalną i nieodwracalną. Inhibicję odwracalną można dalej podzielić na: kompetycyjną, akompetycyjną oraz niekompetycyjną, a nazewnictwo to jest konsekwencją współzawodnictwa pomiędzy cząsteczkami inhibitorów i substratów o miejsce aktywne, jak i różnych miejsc w enzymie, do których przyłączony może zostać związek blokujący [65]. Graficzną prezentację poszczególnych typów inhibicji odwracalnej zaprezentowano na rys. 7. Poza głównymi typami inhibicji, które spotykane są najczęściej, nie można także pominąć inhibicji allosterycznej, częściowej, postępującej wraz z czasem prowadzenia procesu, oraz typu „tight-binding” [66]. Rys. 7. Schematyczne zaprezentowanie różnych rodzajów inhibicji: a) kompetycyjna, b) akompetycyjna, c) niekompetycyjna, gdzie: S – substrat, E – enzym, I – inhibitor, E+I – kompleks enzym-inhibitor, E+S+I – kompleks enzym-substrat-inhibitor, na podstawie [65,66] a) b) c) E E E I I I S S S S S S S S E+I E+S+I E+I S S IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 26 - Najczęściej spotykanym typem blokowania enzymów jest inhibicja kompetycyjna, w której substrat i inhibitor konkurują o miejsce w centrum aktywnym białka (rys. 7a). W większości przypadków, inhibitor jest budową strukturalną bardzo zbliżony do cząsteczki substratu, co powoduje, że przyłączenie inhibitora właściwie uniemożliwia przyłączenie reagenta i odwrotnie. Warto jednak dodać, że istnieje możliwość kontroli inhibicji kompetycyjnej. Poprzez zwiększenie stężenia substratów proces inhibicji może zostać przezwyciężony, nie powodując drastycznych zmian w efektywności biokatalizatora. W tego rodzaju inhibicji maksymalna szybkość reakcji (Vmax) nie zmienia się, natomiast ze względu na malejące powinowactwo enzymu do substratu wzrasta wartość stałej Michaelisa-Menten (Km) [67]. W przypadku inhibicji akompetycyjnej (rys. 7b) inhibitor nie przyłącza się do natywnej formy białka, tylko do wytworzonego już kompleksu aktywnego enzym-substrat. Powoduje to pozorne zmniejszenie stężenia tego kompleksu i w konsekwencji obniżenie wartości stałej Km. Co więcej, ze względu na fakt, że centrum aktywne białka ciągle jest zablokowane i nie ma możliwości realizacji kolejnych aktów katalitycznych, spada także wartość szybkości reakcji. Ten rodzaj inhibicji jest jednak relatywnie rzadko spotykany i dotyczy głównie enzymów multimerycznych, o złożonej budowie [68]. Inhibicja niekompetycyjna (rys. 7c) polega na tym, że inhibitor może związać się z wolną formą białka, jednak poza miejscem aktywnym. Przyłączenie dużych cząsteczek inhibitora może blokować dostęp do centrum katalitycznego enzymu lub wywoływać w nim pewne zmiany konformacyjne. Spowalnia to lub całkowicie hamuje przebieg reakcji i powoduje obniżenie wartości Vmax, jednocześnie nie wpływając na wartość stałej Michaelisa-Menten. Warto dodać, że w przypadku reakcji z inhibicją niekompetencyjną, istnieje możliwość wytworzenia kompleksów enzym-inhibitor oraz enzym-substrat-inhibitor, jednak w obu przypadkach są to układy katalitycznie nieaktywne [68]. Poza przedstawionymi powyżej przykładami wyróżnić należy także inhibicję nieodwracalną. W takim przypadku dochodzi do stałego, zazwyczaj kowalencyjnego, związania substancji inhibitującej z jednym lub kilkoma łańcuchami białkowymi enzymu. Efektem tego typu działania jest skuteczne i trwałe zablokowanie centrum aktywnego białka, co prowadzi do jego dezaktywacji. Mechanizm inhibicji nieodwracalnej jest często stosowany w terapii wielu chorób. Inhibitory (np. eflornityna czy penicylina) zostają wprowadzone do ludzkiego organizmu gdzie wiążą się z resztami aminokwasów tworzących enzym i/lub centrum aktywne, powodując ich zablokowanie [69]. Inhibicja, czego najlepszym dowodem jest powyższy przykład, pomimo blokowania działania enzymów nie musi być rozpatrywana tylko poprzez pryzmat swoich negatywnych efektów. Znane są przykłady reakcji, gdzie inhibitory odpowiedzialne są za regulację aktywności enzymatycznej poprzez sprzężenie zwrotne. Mechanizm ten doskonale sprawdza się w ludzkim organizmie. Nadmierny wzrost stężenia produktu reakcji katalizowanej przez enzym może prowadzić do inhibicji białka, a taka sytuacja znacząco obniża zdolności produkcyjne biokatalizatora [70,71]. Wspomniana już wcześniej lipaza, pochodząca z Pseudomonas aeruginosa oraz pozyskana z komórek ludzkiego żołądka traci swoją aktywność pod wpływem działania wybranych jonów metali, takich jak jony: miedzi, cynku, kobaltu czy srebra. Co więcej, enzymy z tej podpodklasy są również czułe IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 27 - na związki z grup alkaloidów, polifenoli czy flawonoidów, a także wybranych surfaktantów, wśród nich między innymi saponin czy laurylosiarczanu sodu (SDS) [72-74]. Z kolei ureazy, białka katalityczne należące do tej samej klasy enzymów – hydrolaz, są wrażliwe na działanie np. jonów metali ziem alkalicznych oraz jonów rtęci, kobaltu czy miedzi [75], jak i wybranych pochodnych związków organicznych, wśród których największymi zagrożeniami są pochodne tiolowe oraz pochodne kwasów hydroksamowych [76]. Toksyczny wpływ na ureazy mają także niektóre kwasy nieorganiczne, np. kwas borny [77]. Sposób prowadzenia procesu, jak i poprawne oddzielenie produktów reakcji po procesie to również istotne parametry, które wpływają na sprawność biokatalizatora enzymatycznego. Blokowanie centrów aktywnych enzymów ma miejsce także w przypadku niewłaściwej separacji produktów przemiany katalitycznej z mieszaniny reakcyjnej. Odpowiedni odbiór produktów jest kluczowy, zwłaszcza jeśli dana przemiana katalizowana jest przez więcej niż jeden rodzaj enzymów, a produkty jednej reakcji mogą być inhibitorami biokatalizatorów pracujących w następnych etapach procesu [78]. Dobór odpowiedniego rodzaju procesu, a przy tym zapewnienie warunków pracy, które skutkować będą zachowaniem wysokiej aktywności biokatalizatorów, to podstawowe kwestie, które przekładają się na wysoką efektywność oraz wydajność prowadzonych przemian [79]. Rodzaj mikroorganizmu, z którego pochodzi dany enzym, jak i sposób jego ekstrakcji są ważnymi czynnikami, mającymi bezpośredni wpływ na jego strukturę oraz aktywność. Wykazano bowiem, że z każdego ze źródeł enzymów można pozyskać kilka form tego samego białka katalitycznego. Dobrym przykładem są lipazy typu A oraz B pozyskane z Candida antarctica. Lipaza typu B wykazuje wysoką stereoselektywność, podczas gdy lipaza typu A wykazuje selektywność względem zupełnie innych substratów na skutek odmiennej budowy przestrzennej centrum aktywnego [80]. W trakcie prowadzonych badań udowodniono również, że obecność surfaktantów (np. Tween 20 lub Tween 80) w pożywce wykorzystywanej podczas hodowli mikroorganizmów, determinuje i zmienia ilość różnych form lipazy, w porównaniu z hodowlą bez dodatku związków powierzchniowo czynnych, które można pozyskać z danego mikroorganizmu [81,82]. Większość procesów metabolicznych z udziałem enzymów zachodzi w środowisku wodnym. Zmiana rozpuszczalnika na medium organiczne, powszechnie wykorzystywane w wielu syntezach, powoduje również modyfikację właściwości enzymów. Szeroko rozumiana synteza chemiczna, chemia metaloorganiczna oraz synteza i modyfikacja polimerów, to dziedziny w których zastosowanie enzymów w rozpuszczalnikach organicznych jest szczególnie zauważalne [83]. Białka katalityczne w środowisku niewodnym zazwyczaj wykazują większą stabilność, jednak pozostają w formie nierozpuszczonej, co powoduje tendencję do ich aglomeracji i w konsekwencji prowadzi do spadku aktywności [84]. Należy jednak odnotować, że prowadzenie reakcji w rozpuszczalniku organicznym umożliwia transformację związków o charakterze silnie hydrofobowym, co w środowisku wodnym jest trudne do osiągnięcia [85]. Wartym podkreślenia jest również fakt, że w medium organicznym, w porównaniu z warunkami wodnymi, zmianie mogą ulegać właściwości katalityczne enzymów. Przykład stanowią lipazy i esterazy, które IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 30 - nierozpuszczalnym w środowisku reakcji nośnikiem, przy jednoczesnym zachowaniu przez biokatalizator właściwości katalitycznych [87-90]. Należy odnotować, że unieruchomienie enzymów skutkuje zmianą formy katalizatora z postaci homogenicznej, w przypadku wolnego enzymu, do formy heterogenicznej dla immobilizowanego biokatalizatora [91]. Idea procesu immobilizacji enzymów została schematycznie zaprezentowana na rys. 9. Rys. 9. Schematyczne zaprezentowanie procesu immobilizacji enzymów, na podstawie [87] Zmiana formy białka katalitycznego (w wyniku immobilizacji) jest niezwykle istotna ze względu na fakt, że wykorzystanie unieruchomionego enzymu pozwala na znacznie łatwiejsze oddzielenie biokatalizatora od mieszaniny reakcyjnej po zakończonym procesie. Ma to bezpośredni związek z czystością otrzymanych produktów, które nie są zanieczyszczone zużytym białkiem katalitycznym [92]. Przyłączenie naturalnego katalizatora do nierozpuszczalnego nośnika skutkuje także znaczącym wydłużeniem aktywności katalitycznej enzymu, co umożliwia jego wykorzystanie w kilku następujących po sobie cyklach reakcyjnych, co nie jest możliwe w przypadku białka katalitycznego w natywnej formie [93,94]. Dodatkowo, możliwe staje się magazynowanie wytworzonych wcześniej preparatów, gdyż po przeprowadzeniu procesu unieruchomienia odnotowuje się znacznie wolniejszy spadek aktywności białka. Opublikowane dotąd wyniki badań potwierdzają również, że proces immobilizacji wpływa pozytywnie na całą strukturę białkową poprzez jej stabilizację i wzmocnienie, co przekłada się na zwiększenie odporności enzymu na niekorzystne działanie pH, temperatury czy chemicznych środków denaturujących [95-97]. Immobilizowane enzymy zachowują ponadto wysoką aktywność w rozpuszczalnikach organicznych, przy jednoczesnym zachowaniu pierwotnych funkcji katalitycznych, co nie jest możliwe w przypadku wykorzystania rozpuszczalnej formy biokatalizatora [98,99]. Zastosowanie enzymów związanych z podłożem daje także możliwość prowadzenia reakcji w reaktorze okresowym i/lub ciągłym, ponieważ takie rozwiązanie pozwala na stałe dostarczanie substratów oraz odbieranie produktów reakcji [100]. Jest to istotny aspekt, ponieważ skuteczność i wydajność procesu katalitycznego zależą od stężenia substratów i produktów reakcji, które mogą być inhibitorami enzymów. Doniesienia literaturowe wskazują, IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 31 - że ze względu na fakt ingerencji w strukturę białka, jak i możliwość powstania zawady przestrzennej, w wyniku procesu immobilizacji, możliwe jest obniżenie zdolności katalitycznych preparatów po immobilizacji, kosztem poprawy innych cech użytkowych. Nie zawsze jednak jest to obserwowane, bowiem podczas reakcji syntezy estrów katalizowanej przez lipazy odnotowano nawet 40-krotny wzrost właściwości katalitycznych enzymu po immobilizacji, w porównaniu z białkiem w formie natywnej, ze względu na większą ochronę biokatalizatora przed denaturacją [101]. Termin „immobilizowany enzym” w literaturze pojawił się w latach pięćdziesiątych XX wieku, natomiast pierwsze zastosowanie immobilizowanych biokatalizatorów zostało opisane przez Chibata i współpracowników w 1966 roku. W swojej pracy przedstawili oni wykorzystanie aminoacylazy z Aspergillus oryzae w procesie racemicznego rozdziału mieszaniny syntetycznych D-L-aminokwasów [102]. Wartym odnotowania jest fakt, że w początkowym okresie rozwoju metod unieruchamiania biokatalizatorów, poprzez immobilizowany enzym rozumiano białko katalityczne, które jest bezpośrednio związane z nośnikiem. Wraz z ich rozwojem pojawiły się jednak nowe rozwiązania i obecnie określenie unieruchomiony enzym oznacza białko bezpośrednio lub pośrednio związane z nośnikiem. Co więcej, wyróżnia się techniki, w których enzym jest otoczony przez nośnik, a także takie, w których nie występuje matryca w klasycznym rozumieniu tego słowa [103-105]. Obecnie immobilizacji poddaje się nie tylko pojedyncze enzymy, ale również kompleksy dwu- i wieloenzymatyczne lub żywe komórki z zachowaniem ich aktywności metabolicznej, a nawet rozbudowane struktury subkomórkowe [106]. Niemniej jednak żadna z technik powodujących zmianę formy biokatalizatora, w tym także immobilizacja, nie jest pozbawiona wad. Samo przeprowadzenie tego procesu może wiązać się z pogorszeniem właściwości katalitycznych enzymu. Może to być spowodowane usztywnieniem struktury białkowej, jak i oporami dyfuzyjnymi w swobodnym transporcie substratów i produktów, do i z centrum aktywnego. Utrudniony przepływ składników mieszaniny reakcyjnej jest wynikiem zawady przestrzennej, która powstaje wskutek przyłączenia cząsteczek białka do nośnika lub też związany jest z powstaniem oddziaływań w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca aktywnego [105,107]. Dodatkowo, trwałe połączenie enzymu z nośnikiem może powodować brak możliwości ponownego zastosowania matrycy, ze względu na trudności w usunięciu zdezaktywowanego białka [108]. Jednak w obliczu znaczącej poprawy właściwości preparatów po prawidłowo przeprowadzonej immobilizacji, zalety płynące z unieruchomienia znacząco przeważają nad wadami. Efektywność pracy preparatów po immobilizacji w procesach przemysłowych zależna jest od kilku czynników, wśród których najważniejsze są trzy: rodzaj enzymu, typ wykorzystanego nośnika oraz zastosowana metoda immobilizacji, co zobrazowano na rys. 10 [109-111]. Wybór enzymu, który ma zostać poddany unieruchomieniu determinowany jest przez rodzaj katalizowanej przemiany. Właściwości biochemiczne oraz strukturalne, w tym konformacja przestrzenna białka oraz ilość i rodzaj grup funkcyjnych w jego strukturze, to podstawowe parametry, które poddawane są analizie w trakcie projektowania procesu immobilizacji. Istotny jest również dobór odpowiedniego nośnika, którego selekcja zależy w głównej mierze od jego stabilności operacyjnej i właściwości mechanicznych. Niemniej ważny IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 32 - jest także charakter chemiczny matrycy oraz typ powierzchniowych grup chemicznych, które odpowiedzialne są za wytworzenie stabilnych oddziaływań z enzymem. Dobór właściwej techniki immobilizacji ma także wpływ na występowanie oporów dyfuzyjnych związanych z transportem komponentów mieszaniny reakcyjnej. Wybór odpowiedniej metody unieruchamiania wpływa również na stabilność immobilizowanych białek katalitycznych w zmiennych warunkach. Oprócz wyżej wymienionych czynników, także warunki prowadzenia procesu czy jego rodzaj (ciągły lub okresowy) determinują efektywność pracy unieruchomionego enzymu i wpływają na wydajność całego procesu technologicznego. Właściwości biochemiczne Rodzaj i kinetyka reakcji Charakter chemiczny Właściwości mechaniczne ENZYM NOŚNIK EFEKTYWNOŚĆ DZIAŁANIA PREPARATÓW PO IMMOBILIZACJI TYP IMMOBILIZACJI Stabilność operacyjna Opory dyfuzyjne Rys. 10. Czynniki kształtujące efektywność pracy preparatów po immobilizacji w procesach przemysłowych W trakcie realizowanego procesu przemysłowego unieruchomiony biokatalizator częściowo traci swoje właściwości. Parametrem charakteryzującym stabilność operacyjną preparatów po immobilizacji jest czas aktywności katalitycznej enzymu (ang. enzyme half-life) – t1/2. Jest to wielkość opisująca okres, po którym zachodzi utrata połowy początkowej aktywności katalitycznej enzymu. Najczęściej spowodowane jest to utratą aktywności przez enzym, wskutek inhibicji, denaturacji czy negatywnego wpływu zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Istotne znaczenie dla zaniku właściwości katalitycznych ma także wymycie biokatalizatora z nośnika, blokowanie porów matrycy oraz zniszczenie materiału nośnego [112,113]. Dobór konkretnego enzymu determinowany jest przez rodzaj procesu, który ma być katalizowany. Rodzaj biokatalizatora, jak i typ przemiany chemicznej wpływają także na selekcję nośnika, na którym osadzone ma zostać białko. Każdorazowo istnieje możliwość wyboru kilku nośników, a kluczowa, dla wytworzenia stabilnych i trwałych oddziaływań, jest komplementarność grup funkcyjnych matrycy oraz enzymu. Najważniejsze jednak dla zachowania jak najdłuższej i najwyższej aktywności preparatów po immobilizacji jest utrzymanie właściwego balansu pomiędzy wszystkimi czynnikami kształtującymi właściwości katalityczne unieruchomionych enzymów. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 35 - powierzchni matrycy oraz w cząsteczce biokatalizatora. W przypadku białek katalitycznych, w tworzeniu wiązań z matrycą najczęściej udział biorą grupy: imidazolowe, fenylowe, tiolowe oraz aminowe, które zawarte są w takich aminokwasach jak: lizyna (Lys), cysteina (Cys), tyrozyna (Tyr), histydyna (His) czy arginina (Arg). Grupy te zazwyczaj znajdują się w pozycji N- lub C-terminalnej łańcucha aminokwasowego [126]. W zależności od budowy chemicznej powierzchni nośnika i dostępności różnych grup funkcyjnych, proces tworzenia wiązania matryca-biokatalizator opiera się o reakcje: arylowania, amidowania, diazowania, alkilowania, a także powstawania zasad Schiffa lub wiązań amidowych [127]. Ograniczona liczba miejsc, w których przyłączone może zostać białko powoduje, że zazwyczaj niewielkie ilości enzymu, nieprzekraczające 50 mg białka na 1 g nośnika, mogą zostać unieruchomione poprzez immobilizację kowalencyjną. Grupa nośników stosowanych w tej technice immobilizacji jest mniejsza od wykorzystywanej w immobilizacji adsorpcyjnej, jednak nadal stanowi szeroką gamę materiałów, począwszy od związków nieorganicznych, przez materiały kompozytowe po matryce pochodzenia organicznego (zarówno naturalne, jak i syntetyczne). Najważniejszym kryterium podczas selekcji nośników jest wybór materiału posiadającego w strukturze grupy funkcyjne komplementarne z grupami enzymu, aby możliwe było wytworzenie wiązań kowalencyjnych. W tabeli 2 zaprezentowano wybrane przykłady immobilizacji enzymów poprzez kowalencyjne przyłączenie do nośnika. Inny rodzaj immobilizacji, polegający na związaniu enzymu w selektywnie przepuszczalnej matrycy zbudowanej z żelu lub włókien to pułapkowanie (ang. entrapment). W metodzie tej biokatalizatory często zamyka się też w kuleczkach żelu o średnicy w zakresie od 0,3 do 3 mm, jednak preparat może też przyjmować inne postaci, np. dysków czy innych kształtów sferycznych [128]. Ten rodzaj immobilizacji stosowany jest zazwyczaj w procesach, w których masa cząsteczkowa substratów i produktów nie jest duża, ze względu na utrudnienia mogące wystąpić w transporcie związków wielkocząsteczkowych [129]. Związanie białka odbywa się poprzez wytworzenie oddziaływań fizycznych, stosunkowo słabo wiążących enzym z matrycą, co pozwala uniknąć ingerencji w trójwymiarową strukturę białka, jednak prowadzi do szybkiego wymycia biokatalizatora i w konsekwencji utraty aktywności [130]. Problemem często spotykanym w tej technice jest również duży spadek właściwości katalitycznych enzymu wskutek przeprowadzenia samego procesu immobilizacji. Fakt ten związany jest z powstaniem dużych oporów dyfuzyjnych w transporcie składników mieszaniny reakcyjnej, będących wynikiem braku możliwości kontrolowania sposobu, w jaki enzym zostanie „uwięziony” w matrycy. W immobilizacji poprzez pułapkowanie stosuje się stosunkowo niewielką grupę nośników, głównie pochodzenia naturalnego, wśród nich: alginiany, κ-karaginian, agar, chitozan, poliakryloamid czy różnego rodzaju żywice epoksydowe. Materiały te muszą spełniać kilka warunków, przede wszystkim posiadać relatywnie wysoką odporność mechaniczną i wykazywać tendencję do tworzenia żelu w łagodnych warunkach temperatury i pH. Żelowanie układów katalitycznych odbywa się poprzez wytworzenie między cząsteczkami oddziaływań hydrofobowych lub jonowych oraz wiązań wodorowych i kowalencyjnych [131]. Warto dodać, że w immobilizacji poprzez pułapkowanie często do IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 36 - unieruchomienia enzymów stosuje się porowate membrany, np. typu hollow fibers, w których zatrzymane zostaje białko [132], jednak najistotniejszym parametrem, który należy wziąć pod uwagę przy doborze matrycy jest wielkość jej porów, jak i zdolność do selektywnego przepuszczania substratów i reagentów. Należy bowiem wybrać materiał, który będzie ułatwiał transport reagentów, jak i miał pory o dopasowanej do nich wielkości. Wybrane przykłady unieruchamiania enzymów poprzez pułapkowanie zostały zaprezentowane w tabeli 2. Zbliżoną do pułapkowania techniką immobilizacji jest kapsułkowanie, nazywane także enkapsulacją (ang. encapsulation). W metodzie tej biokatalizator zostaje otoczony ściankami, w ten sposób powstaje kapsułka, która w swoim rdzeniu zawiera unieruchomiony enzym, a materiał ścianek umożliwia transport małocząsteczkowych reagentów [133,134]. Powstaje zatem naturalna warstwa chroniąca białko przed szkodliwym działaniem środowiska reakcji, a jednocześnie zapewniająca możliwość prowadzenia przemiany katalitycznej. Wykorzystanie tej metody pozwala na stosunkowo łatwe oddzielenie zużytego biokatalizatora od mieszaniny. Co więcej, brak bezpośredniego kontaktu biokatalizatora z produktami reakcji, chroni je przed zanieczyszczeniem przereagowanym białkiem i jednocześnie pozwala zachować ich wysoką czystość [135]. Dzięki tej technice możliwe staje się nagromadzenie dużej ilości biomasy w małej przestrzeni, jednak skomplikowana procedura wykonania oraz wysokie koszty powodują, że enkapsulacja nie jest szeroko stosowana w procesach przemysłowych [132]. Kapsułki stosowane w tej metodzie mają zazwyczaj kulisty lub sferyczny kształt i rozmiary od dziesiątych części milimetra do kilku centymetrów, jednak najczęściej spotykane są kapsuły o rozmiarach nieprzekraczających kilkunastu milimetrów. Istnieje również kilka metod formowania żelu ze zimmobilizowanym enzymem, np.: koacerwacja, ekstruzja, powlekanie, suszenie rozpyłowe i sublimacyjne oraz denaturacja termiczna. Jednak najszerzej stosowane jest odparowanie rozpuszczalnika oraz żelowanie za pomocą odpowiednich jonów, np.: Ca2+, Na+ czy K+ [136], a enzym zostaje uwięziony w matrycy poprzez ograniczenie jego ruchliwości. Zazwyczaj procesowi temu towarzyszą oddziaływania fizyczne pomiędzy grupami białka i nośnika jak również, sporadycznie, powstanie wiązań kowalencyjnych, które dodatkowo pomagają utrzymać białko w matrycy. W przypadku kapsułkowania jako otoczki stosuje się zarówno związki pochodzenia naturalnego, jak i syntetyczne. Są to głównie silikonowe, liposomowe lub nylonowe membrany, jednak wykorzystuje się także pochodne celulozy, karaginianów czy alginianów [137]. Przegrody membranowe, oddzielające cząsteczki enzymu od mieszaniny reakcyjnej, powstają zazwyczaj w oparciu o polimery, a najpopularniejsze z nich to polipropylen oraz poli(chlorek winylu). Zastosowany nośnik musi być substancją nietoksyczną dla białka, a dodatkowo, podobnie jak w przypadku matryc stosowanych w pułapkowaniu, musi umożliwiać selektywny transport substratów i produktów [138]. Skuteczność tej metody immobilizacji potwierdzają liczne doniesienia literaturowe, które przedstawione zostały w tabeli 2. Innym sposobem immobilizacji jest otrzymywanie nierozpuszczalnych preparatów biokatalitycznych poprzez międzycząsteczkowe sieciowanie enzymów za pomocą oddziaływań i wiązań IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 37 - chemicznych tworzonych przez związki dwufunkcyjne, takie jak: aldehyd glutarowy, heksametylenodiizocyjanian lub heksametylenodiizotiocyjanian. Metoda immobilizacji poprzez sieciowanie różni się od opisanych powyżej technik unieruchamiania enzymów, ponieważ nie wykorzystuje ona nośnika, a matrycą są dla siebie poszczególne cząsteczki enzymów. Stabilizacja struktury staje się możliwa poprzez wytworzenie wiązań kowalencyjnych pomiędzy biokatalizatorami [139]. W zależności od sposobu przygotowania białka katalitycznego oraz warunków procesu można otrzymać dwa typy preparatów: CLEA (ang. cross-linked enzyme aggregates) oraz CLEC (ang. cross-linked enzyme crystals) [140,141]. Preparaty CLEC, dzięki wcześniejszej krystalizacji białka, składają się niemal wyłącznie z jego homogennej postaci i charakteryzują się wysoką odpornością na działanie inhibitorów i czynników denaturujących. Krystalizacja białek jest jednak procesem długotrwałym i kosztownym. Aby ją pominąć przeprowadza się proces wytrącania agregatów białkowych, zanim zostaną poddane sieciowaniu. Strącanie agregatów enzymatycznych odbywa się zazwyczaj z wykorzystaniem roztworów soli nieorganicznych, niejonowych polimerów oraz rozpuszczalników organicznych, a dopiero późniejsze usieciowanie prowadzi do powstania CLEA [142,143]. Największą zaletą immobilizacji poprzez sieciowanie jest możliwość kontroli właściwości katalitycznych wytwarzanych preparatów dobierając odpowiednie warunki procesowe. Powstałe systemy biokatalityczne mogą się bowiem różnić aktywnością, stabilnością, selektywnością, odpornością na działanie inhibitorów, pH, temperatury oraz rozpuszczalników, jak i wytrzymałością mechaniczną [144]. Wybór odczynnika strącającego, odpowiednia krystalizacja białka, jak i dobór optymalnej substancji sieciującej to kluczowe parametry, których kontrola zapewnia powstanie preparatów o pożądanych właściwościach. Na rys. 12 zestawiono i zaprezentowano zalety i wady każdej z opisanych technik immobilizacji. Należy zwrócić uwagę, że każda z technik unieruchamiania białek katalitycznych charakteryzuje się różnymi właściwościami i posiada szereg odmiennych zalet jak i wad, z którymi należy się zmierzyć wykorzystując daną metodę. W tabeli 2, w sposób przeglądowy, przedstawiono jakie enzymy i nośniki są wykorzystywane w poszczególnych technikach immobilizacji. Wskazano również modyfikator powierzchni lub związek sieciujący oraz aktywność katalityczną zachowaną przez unieruchomione białka, a także wykorzystanie preparatów immobilizowanych enzymów. Przedstawiono ponadto reprezentatywne dla każdej z technik immobilizacji przykłady, których zadaniem jest uwypuklenie uniwersalności każdej z metod. Należy podkreślić, że wybór techniki immobilizacji oraz nośnika jest ściśle determinowany przez typ enzymu oraz rodzaj katalizowanego procesu, dlatego te same enzymy mogą zostać unieruchomione na różnych matrycach, z wykorzystaniem odmiennych metod immobilizacji, co zostało wykazane w zaprezentowanym zestawieniu. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 40 - 9. ureaza TiO2 ε-poli-L-lizyna (EPL) 40% biosensory służące do detekcji mocznika [153] 10. adsorpcyjna oksydaza glukozowa z Aspergillus niger nanorurki złota aldehyd glutarowy b.d. biodetektory służące do detekcji i pomiaru stężenia glukozy [154] 11. oksydaza glikolowa z Medicago falcata magnetyczne nanocząstki grupy aminowe 45% utlenianie kwasu glikolowego do kwasu glioksalowego w reaktorze ze złożem stałym [155] 12. lipaza z Candida rugosa chitozan – 95% hydroliza oleju kuchennego do prostych związków, w zmiennych warunkach pH i temperatury [156] 13. ω-transaminaza Sepabeads EC-EA, Relizyme EA403, Sepabeads EC-HA, Relizyme HA403, Sepabeads EC-OD, Relizyme OD403 – 70–90%, w zależności od matrycy rozdział mieszanin racemicznych amin oraz alkoholi [157] 14. lipaza typu PS z Burkholderia cepacia lipaza typu B z Candida antarctica włókna z poli(alkoholu winylowego) oraz kwasu polimlekowego – B. cepacia – 84% C. antarctica – 80% rozdział mieszanin racemicznych alkoholi oraz estrów na enancjomery [158] 15. trypsyna membrana nylonowa sulfonian polistyrenu (PSS) b.d. procesy trawienia białek prowadzone w reaktorach przepływowych [159] 16. kowalencyjna lipaza z Pseudomonas fluorescens nanorurki węglowe (MWCNT) grupy: karboksylowe, hydroksylowe, aminowe 130–150% transestryfikacyjny rozdział mieszaniny racemicznej Solkatylu [160] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 41 - 17. oksydaza glukozowa z Aspergillus niger nanorurki węglowe (MWCNT) – b.d. produkcja biodetektorów do wykrywania glukozy [161] 18. kowalencyjna lipaza z Cercospora kikuchii łuski ryżu aldehyd glutarowy ~ 80% etanoliza oleju kokosowego w procesie produkcji biodiesla [162] 19. cyklooksygenaza 2 z komórek ludzkich żel krzemionkowy aldehyd glutarowy 100% przemysł farmaceutyczny, do produkcji leków przeciwnowotworowych [163] 20. lipaza z Rhizomucor miehei sferyczna krzemionka oktylotrietoksysilan, glicydoksypropylo- trimetoksysilan 200% hydroliza wiązań estrowych w produktach pochodzenia naturalnego [164] 21. liaza hydroksynitrylowa z Prunus dulcis Florisil® Eupergit® Fe3O4 3-aminopropylo- trimetoksysilan, aldehyd glutarowy 70–99% enancjoselektywna synteza różnych związków z grupy cyjanohydryn [165] 22. ureaza z Lactobacillus fermentum Eupergit® – 60–90% hydroliza mocznika do amoniaku oraz ditlenku węgla [166] 23. β-amylaza z Trigonella foenum-graecum grafen aldehyd glutarowy 85% katalityczny rozkład skrobi do cukrów prostych, głównie maltozy [167] 24. lipaza z Aspergillus niger Fe3O4-chitozan – 80% reakcje transestryfikacji prowadzone w rozpuszczalnikach organicznych [168] 25. dehydrogenaza alkoholowa z Saccharomyces cerevisiae Fe3O4-krzemionka γ-glicydoksy- propylo- trimetoksysilan 92% katalityczna redukcja kwasu fenyloglioksalowego do (R)-kwasu migdałowego [169] 26. ksylanaza wraz z celulazą nanocząstki węglowe pokryte chitozanem – 60% procesy biokonwersji biomasy o wysokiej zawartości ksylanu [170] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 42 - 27. kowalencyjna wołowa anhydraza węglanowa magnetyczne mikrosfery poli- metakrylanu glicydylu i diwinylo benzenu – b.d. wyłapywanie i hydratacja ditlenku węgla prowadzone w reaktorach przepływowych [171] 28. tyrozynaza grzybowa szkło porowate o kontrolowanej wielkości porów grupy: alkiloaminowe aryloaminowe karboksylowe 90–95% utlenianie dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) do dopachromu w bioreaktorach [172] 29. oksydaza glukozowa membrana poliakrylonitrylowa heksametyleno- diamina do 60% produkcja biopaliw drugiej generacji oraz w biosensorach do detekcji związków organicznych [173] 30. α-amylaza z Trichoderma harzianum wełna chlorek cyjanurowy 75% katalityczna hydroliza wybranych związków z grupy węglowodanów [174] 31. pułapkowanie ureaza z Canavalia ensiformis kopolimer poli- izopropyloakryloamidu i metakrylanu glikolu polietylenowego – do 83% usuwanie mocznika z roztworów wodnych oraz w biodetektorach służących do wykrywania obecności mocznika [175] 32. lipaza typu B z Candida antarctica poliuretan – 120% synteza propionianu geranylu z kwasu propionowego i olejku cytrynowego [176] 33. maltaza z Bacillus licheniformis agaroza – b.d. hydroliza maltozy wykorzystywanej w przemyśle spożywczym oraz farmaceutycznym [177] 34. celulaza z Trichoderma reesei krzemionka typu zol-żel – 92% przemysłowe procesy katalitycznej konwersji celulozy w glukozę [178] 35. lipaza z Pseudomonas fluorescens Celite® 545 – 70% acylowanie mieszanin racemicznych drugorzędowych alkoholi [179] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 45 - 52. sieciowanie lipaza z łusek kakowca – aldehyd glutarowy 75% katalizowanie reakcji w środowisku hydrofilowych rozpuszczalników organicznych [196] 53. dehydrogenaza formaldehydowa z Candida boidinii – poli(aldehyd dekstranowy), aldehyd glutarowy do 20% regeneracja kofaktora NADH oraz redukcja CO2 [197] 54. pektynaza, celulaza, ksylanaza z Aspergillus niger – aldehyd glutarowy b.d. w zastosowaniach przemysłowych opartych na biokonwersji pektyn, ksylanu oraz celulozy [198] 55. dekarboksylaza glutaminianowa z Escherichia coli – aldehyd glutarowy b.d. dekarboksylacja kwasu glutaminowego do związków prostych [199] 56. lipaza z łusek kakaowca – aldehyd glutarowy 70% transestryfikacja estrów zawartych w olejach roślinnych [200] 57. celulaza, pektynaza, poligalakturonaza, liaza pektolaza, pektometylo- esteraza – aldehyd glutarowy do 15% oczyszczanie i klaryfikowanie owocowych i warzywnych soków spożywczych [201] 58. lakkaza z Pleurotus ostreatus – aldehyd glutarowy 96% odbarwianie roztworów z barwników organicznych [202] 59. α-amylaza z Aspergillus oryzae glukoamylaza z Aspergillus niger – poli(aldehyd dekstranowy), aldehyd glutarowy α-amylaza – 60% glukoamylaza – 42% przemysłowa hydroliza skrobi i jej pochodnych do związków prostych [203] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 46 - 60. sieciowanie amyloglukozydaza z Aspergillus niger – aldehyd glutarowy, polietylenoimina, glikol poli- etylenowy b.d. hydroliza łańcuchów polisacharydowych do glukozy [204] 61. β-galaktozydaza z Escherichia coli – aldehyd glutarowy 93% synteza różnego rodzaju galakto-oligosacharydów [205] 62. oksydaza aspartanowa z Sulfolobus tokodaii – aldehyd glutarowy 85% rozdział mieszaniny racemicznej kwasu D,L-aspartanowego [206] 63. glukoamylaza – pektyny do 85% hydroliza maltodekstryn do prostych związków [207] 64. lipaza z Candida rugosa metyloceluloza aldehyd glutarowy 60% w procesach opartych na reakcjach transestryfikacji olejów roślinnych [208] 65. proteaza wspólnie z lipazą – aldehyd glutarowy proteaza – 43% lipaza – 99% w proszkach do prania, oraz w produkcji biodiesla [209] * b.d. – brak dostępnych danych IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 47 - Mając na uwadze dane zaprezentowane w tabeli 2 [145-209], można wysunąć jednoznaczny wniosek, że enzymy z różnych grup katalitycznych mogą zostać unieruchomione z wykorzystaniem każdej z technik immobilizacji. Decydujący jest tutaj rodzaj unieruchamianego białka, obecność grup funkcyjnych na powierzchni nośnika oraz typ ewentualnego modyfikatora powierzchni. Poniżej zaprezentowano kilka przykładów pomocnych w scharakteryzowaniu wpływu wybranej techniki unieruchomienia na właściwości osadzanego enzymu. W oparciu o poniższe informacje należy podkreślić dużą dowolność przy konfiguracji i tworzeniu systemu biokatalitycznego, co zapewnia szeroki wybór matryc oraz odmienna charakterystyka każdej z technik. Przykładem wykorzystania immobilizacji adsorpcyjnej jest osadzenie lipazy typu B z Candida antarctica (CALB) na niemodyfikowanej oraz modyfikowanej glicydopropylotrimetoksysilanem (związkiem zawierającym grupy epoksydowe) krzemionce typu zol-żel. Funkcjonalizacja powierzchni matrycy pozwala na osadzenie ponad sześć razy większej ilości biokatalizatora (375 mg enzymu na 1 g nośnika), w porównaniu z niemodyfikowaną krzemionką (58 mg/g). Udowodniono, że aktywność preparatów po immobilizacji w procesie transestryfikacji 1-fenyloetanolu z octanem winylu znacząco wzrasta w środowisku rozpuszczalników polarnych, a dodatkowo enzym po immobilizacji odznacza się lepszymi właściwościami użytkowymi w różnych warunkach temperatury i pH, w porównaniu z wolnym białkiem [147]. Kolejnym przykładem zastosowania unieruchomienia poprzez adsorpcję jest osadzenie wołowej anhydrazy węglanowej na powierzchni sferycznej krzemionki SBA-15, aby poprawić kontrolę procesu usuwania CO2, jak i zwiększyć ekonomikę jego prowadzenia. Uzyskany preparat biokatalityczny odznacza się zachowaniem ponad 95% początkowej aktywności po 30 dniach magazynowania oraz ponad 50% po katalizowaniu dziesięciu kolejnych cykli reakcyjnych. Wykazano także poprawę odporności na działanie pH, jak i wysoką aktywność operacyjną unieruchomionego białka [150]. W literaturze opisano także wykorzystanie kaolinu, skały osadowej o zróżnicowanym składzie chemicznym, jako nośnika do unieruchomienia peroksydazy chrzanowej. Unieruchomiony enzym znalazł zastosowanie w procesie odbarwiania roztworu barwnika C.I. Acid Violet 109 i pozwala na rozkład 87% barwnika, zachowując sprawność na poziomie 35% po odbyciu dziewięciu cykli katalitycznych [152]. Trwałe, kowalencyjne związanie enzymu z nośnikiem konieczne jest, gdy immobilizowane białko ma znaleźć zastosowanie w biosensorach służących do detekcji np. glukozy. Przykładem wykorzystania immobilizacji kowalencyjnej jest elektroda służąca do określenia poziomu glukozy we krwi zbudowana w oparciu o oksydazę glukozową z Aspergillus niger. Matrycą w tym przypadku były nanorurki węglowe (MWCNT). Zaprezentowane wyniki dowodzą, że istotny wpływ na wydajność pracy unieruchomionego enzymu mają początkowe parametry procesu immobilizacji [161]. Innym przykładem immobilizacji kowalencyjnej jest unieruchomienie na powierzchni sferycznej krzemionki, zmodyfikowanej związkami silanowymi, lipazy z Rhizomucor miehei. Związany z matrycą enzym charakteryzuje się ponad dwukrotnie większą aktywnością katalityczną niż białko w formie wolnej. Co więcej, bardzo duży wpływ na właściwości katalityczne zimmobilizowanego biokatalizatora mają ilość i rodzaj zastosowanego modyfikatora powierzchni [164]. Zastosowanie immobilizacji kowalencyjnej zostało także zaprezentowane IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 50 - takich produktów dodatkowo obniża koszty realizacji całego procesu, ze względu na brak konieczności samodzielnego przygotowania nośników. Niezależnie od techniki immobilizacji, najpowszechniej stosowanym związkiem modyfikującym powierzchnię nośnika jest aldehyd glutarowy, którego właściwości nie wpływają toksycznie na białko. Jednak w unieruchamianiu wykorzystuje się też związki zawierające w swojej strukturze grupy –OH, –NH2, –COOH oraz epoksydowe, a dobór modyfikatora determinowany jest głównie przez grupy funkcyjne zawarte w strukturze enzymu. Mając na uwadze powyższe informacje należy jednoznacznie stwierdzić, że immobilizowane enzymy mogą być wykorzystywane w niezwykle szerokiej gamie procesów technologicznych. Począwszy od najprostszych po zaawansowane, wymagające znacznych nakładów finansowych oraz wysokiej czystości produktów, przemiany chemiczne jak np. te mające miejsce w przemyśle farmaceutycznym czy medycznym. 2.3. Wykorzystanie i zalety stosowania immobilizowanych enzymów Immobilizacja enzymów, jak już wspomniano, następuje w wyniku powstania specyficznych oddziaływań pomiędzy grupami funkcyjnymi nośnika i enzymu. Ubocznym efektem unieruchomienia białek katalitycznych jest usztywnienie i stabilizacja całej struktury biokatalizatora, z czym związany jest wzrost odporności na niekorzystne działanie parametrów środowiska reakcji oraz substancji denaturujących i inhibitorów. Dobrym przykładem potwierdzającym te obserwacje jest unieruchomienie liazy fenyloalaninowej (PAL), poprzez enkapsulację, wewnątrz struktur wytworzonych w oparciu o nanocząstki magnetyczne i krzemionkę. Wolna oraz unieruchomiona forma enzymu wykazują najwyższą aktywność w takiej samej temperaturze (60 °C), jednak w trakcie prowadzenia przemiany w tych warunkach natywna forma białka bardzo szybko traci swoje właściwości, podczas gdy unieruchomiona zachowuje o ponad 30% wyższą aktywność, nawet po 60 min trwania reakcji. Co więcej, system biokatalityczny wykorzystany może być do konwersji L-fenyloalaniny w inne związki, np. kwas trans-cynamonowy lub kwas fenylopirogronowy z większą wydajnością niż wolny enzym [210]. Znaczną poprawę odporności na działanie pH środowiska reakcji zyskuje także immobilizowana acetylocholinoesteraza z Electrophorus electricus, która została kowalencyjnie osadzona na powierzchni sferycznej krzemionki zmodyfikowanej polietylenoiminą. Białko w wolnej formie charakteryzuje się maksimum aktywności przy pH=7 i wykazuje ponad 80% aktywności w pH 7 oraz 8. Tymczasem w przypadku unieruchomionego białka, następuje przesunięcie optimum katalitycznego do pH 8, a utrzymanie aktywności przekraczającej 80% jest obserwowane w zakresie pH od 8 do 10, umożliwiając prowadzenie reakcji w bardziej alkalicznych warunkach [211]. Preparaty po immobilizacji, w wyniku której powstaje wiązanie kowalencyjne, ze względu na zachodzące zmiany konformacyjne, stają się zazwyczaj bardziej odporne na działanie inhibitorów. Jako przykład posłużyć może ureaza z Canavalia ensiformis, która jest powszechnie stosowana w procesach hydrolizy mocznika, a znaczący wpływ na aktywność tego białka ma obecność IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 51 - jonów metali ciężkich. Już przy niewielkim stężeniu jonów Hg2+ oraz Cu2+ enzym w natywnej formie traci całkowicie swoje właściwości, podczas gdy preparaty po immobilizacji, w obecności tych samych jonów, wykazują nadal ponad 65% początkowej aktywności [212]. Warto również podkreślić, że stabilizacja struktury białkowej powoduje jej wzmocnienie, co przekłada się na możliwość znacznie dłuższego magazynowania preparatu po immobilizacji, w porównaniu z przechowywaniem natywnego enzymu. Wolna lakkaza z Trametes pubescens, wykorzystywana do usuwania barwników syntetycznych z roztworów wodnych, dość gwałtownie traci swoją aktywność i po 30 dniach zachowuje ją na poziomie ok. 10%. To samo białko unieruchomione poprzez pułapkowanie w chitozanie i dodatkowo usieciowane aldehydem glutarowym, odznacza się zachowaniem ponad połowy początkowych właściwości po takim samym okresie magazynowania [213]. Preparaty unieruchomionych enzymów cieszą się sporym zainteresowaniem przemysłowym również ze względu na fakt, że mogą być wykorzystywane z satysfakcjonującymi wynikami, przez więcej niż jeden cykl katalityczny. Dobrym przykładem jest esteraza z Bacillus cereus, która została kowalencyjnie unieruchomiona na włóknach celulozowych zmodyfikowanych grupami dietyloaminoetylowymi (DEAE). System biokatalityczny wykorzystywany jest w rozdziale racemicznym estru metylowego kwasu α-etylo-2-oksopirolidynooctowego (związku wykorzystywanego w przemyśle farmaceutycznym) i umożliwia uzyskanie ponad 99-proc. nadmiaru enancjomerycznego pożądanego produktu. W trakcie badań wykazano, że unieruchomiony enzym wykazuje ponad 70% początkowej aktywności po pełnych sześciu cyklach reakcyjnych, nie tracąc swoich właściwości do efektywnego rozdziału. Należy podkreślić, że znane są także przypadki białek katalitycznych, które w wyniku unieruchomienia kowalencyjnego zachowują ponad 50% początkowych właściwości nawet po 20 cyklach [214]. Przedstawione powyżej zalety unieruchomionych enzymów powodują, że możliwym jest realizowanie przemian katalitycznych w bioreaktorach ciągłych, jak i przepływowych, z zachowaniem wysokiej wydajności oraz efektywności realizowanego procesu, przez cały czas jego trwania. Przykładem potwierdzającym tę tezę jest adsorpcyjne unieruchomienie trypsyny na powierzchni oraz w porach monolitycznych prętów krzemionkowych o wysokim stopniu porowatości. W oparciu o wytworzone układy zbudowany został reaktor pozwalający na prowadzenie, w sposób ciągły, procesu trawienia białek do prostszych łańcuchów peptydowych z zachowaniem ponad 90-proc. skuteczności rozkładu protein [215]. Zbliżony budową reaktor, oparty o funkcjonalizowane jonami niklu i kobaltu pręty krzemionkowe, z którymi kowalencyjnie związano acetylotransferazę z Mycobacterium smegmatis, został wykorzystany w procesie transestryfikacji glikolu neopentylowego z octanem etylu. W tych samych warunkach procesowych (temperatura, pH, czas reakcji, użyty rozpuszczalnik) preparat po immobilizacji wykazuje ponad trzykrotnie szybsze działanie niż wolne białko, a dodatkowo pozwala na otrzymanie w dużej przewadze, bardziej pożądanego monoestru, z zachowaniem wysokiej kontroli nad procesem [216]. Porównanie najważniejszych właściwości oraz zalet wolnych i immobilizowanych enzymów zaprezentowano na rys. 13. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 52 - Rys. 13. Porównanie właściwości preparatów wolnych oraz immobilizowanych enzymów Poza zachowaniem wysokiej aktywności przez unieruchomione enzymy, niekwestionowanymi zaletami takich systemów, w zastosowaniach przemysłowych, są także lepsza kontrola prowadzonych procesów, między innymi poprzez możliwość szybkiego oddzielenia systemów biokatalitycznych od mieszaniny reakcyjnej oraz zdecydowanie większa czystość produktów reakcji. Zmiana postaci katalizatora z formy rozpuszczalnej w mieszaninie reakcyjnej na heterogeniczną, powoduje, że nie dochodzi do zanieczyszczenia produktów reakcji zużytym biokatalizatorem. Wysoka czystość ma szczególne znaczenie w przemyśle spożywczym oraz farmaceutycznym i kosmetycznym, gdzie obecność niepożądanych substancji dyskwalifikuje dany związek z dalszej obróbki [217]. Co więcej, brak konieczności przeprowadzenia dodatkowych procesów, mających na celu oczyszczenie produktów katalizowanych przemian, ma duże znaczenie ekonomiczne, gdyż umożliwia obniżenie całkowitych kosztów technologicznych realizacji danego procesu [218]. W realizowanych dotychczas procesach przereagowane białka katalityczne oddzielane są od pozostałych składników mieszaniny poprzez ultra- bądź nanofiltrację czy wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC). Procesy te są jednak dość kosztowne i skomplikowane, co przekłada się na złożoność całej przemiany. Oddzielenie enzymu po immobilizacji jest dużo łatwiejsze i zazwyczaj odbywa się poprzez odwirowanie lub odsączenie zimmobilizowanego białka [219]. Bardzo interesującą alternatywą jest również zastosowanie nośników o właściwościach magnetycznych, które umożliwiają separację przereagowanego biokatalizatora poprzez przyłożenie zewnętrznego pola magnetycznego. W tym celu jako matryce wykorzystywane są magnetyczne nanocząstki magnetytu – Fe3O4 [220], jednak aby jeszcze Wolny enzym niższy brak ograniczeń niska trudne i kosztowne brak trudne i kosztowne zazwyczaj wyższy Analizowany parametr Koszt wytworzenia preparatu Transport masy Stabilność Oczyszczanie produktu Możliwość ponownego wykorzystania enzymu Prowadzenie procesu ciągłego Całkowity koszt procesu katalitycznego Immobilizowany enzym wyższy mogą wystąpić ograniczenia podwyższona łatwe zazwyczaj łatwe i wydajne możliwe i wydajne zazwyczaj niższy IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 55 - oraz utrzymują wysoką aktywność w rozpuszczalnikach organicznych. Wykorzystanie unieruchomionych enzymów w wielu przemianach powoduje obniżenie kosztów ich realizacji, zapewnia lepszą kontrolę całego procesu technologicznego, jak i zwiększa jego szybkość i efektywność. Wartym podkreślenia jest również fakt, że produkty przemian enzymatycznych, realizowanych z wykorzystaniem immobilizowanych białek, charakteryzują się wysoką czystością i zazwyczaj nie ma konieczności przeprowadzenia ich dodatkowej obróbki. Oprócz warunków środowiskowych, wpływających na aktywność unieruchomionych enzymów, ważnymi czynnikami determinującymi zachowanie przez te białka swoich właściwości są także warunki procesu immobilizacji. Typ enzymu oraz rodzaj zastosowanego nośnika to kluczowe parametry, od których zależy przydatność wytworzonych układów. Wybór białka, którego właściwości mają zostać polepszone zależy od typu katalizowanego procesu, natomiast na dobór matrycy wpływ ma zarówno rodzaj enzymu, jak i procesu. Kluczowe jest zastosowanie w immobilizacji enzymów odpowiednich nośników. Stanowią one bardzo szeroką i zróżnicowaną grupę związków różnego pochodzenia, często o bardzo odmiennym składzie chemicznym oraz budowie morfologicznej. Ze względu na fakt, że konieczne jest występowanie odpowiedniego powinowactwa pomiędzy nośnikiem i unieruchamianym enzymem stosuje się modyfikatory powierzchni. Są to związki ułatwiające wytworzenie trwałych oddziaływań i skuteczne związanie enzymu, co zapobiega jego szybkiemu wymyciu z powierzchni nośnika. Substancje, które stosowane są jako modyfikatory powierzchni posiadają w strukturze co najmniej dwie grupy funkcyjne, które mogą oddziaływać z nośnikiem oraz cząsteczkami enzymu. Związki te wykorzystuje się głównie w immobilizacji adsorpcyjnej i kowalencyjnej do zwiększenia siły oddziaływań, jednak kluczową rolę stanowią w immobilizacji poprzez sieciowanie, gdzie wykorzystywane są do wytworzenia agregatów białkowych. 3. Nośniki w immobilizacji enzymów 3.1. Podstawowe informacje i podział nośników Proces immobilizacji powoduje poprawę właściwości katalitycznych enzymów, a także w znaczący sposób zwiększa ich stabilność operacyjną oraz rozszerza gamę procesów technologicznych, w których mogą zostać one wykorzystane. Decydujący wpływ na poszczególne parametry preparatów unieruchomionych enzymów mają rodzaj zastosowanego białka, jak i nośnik, który w znacznym stopniu determinuje stabilność operacyjną oraz koszt wytworzenia immobilizowanego systemu biokatalitycznego. Materiały, które mogą zostać wykorzystane jako nośniki muszą charakteryzować się szeregiem właściwości oraz spełniać wiele kryteriów, które bardziej szczegółowo omówione zostaną w niniejszym rozdziale. Kluczowe cechy, którymi musi się odznaczać matryca, to zdolność do trwałego związania enzymu, jak i nie wywoływanie znaczącej utraty jego aktywności katalitycznej [225-228]. Najważniejsze parametry determinujące wybór nośnika zostały zaprezentowane na rys. 15. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 56 - Rys. 15. Właściwości stosowanych nośników w immobilizacji enzymów Należy jednoznacznie podkreślić, że dobór oraz charakterystyka nośnika ma istotny wpływ na właściwości katalityczne oraz stabilność unieruchomionego enzymu. Najważniejszym kryterium, decydującym o wyborze danego materiału jest odpowiednio wysokie powinowactwo do rodzaju enzymu, który ma zostać unieruchomiony. Przy selekcji matryc należy także wziąć pod uwagę temperaturę, lepkość, polarność oraz charakter kwasowo-zasadowy mieszaniny reakcyjnej, w której pracować będzie unieruchomiony enzym [229]. W celu zapewnienia heterogenicznej formy preparatu po immobilizacji, stosowany nośnik powinien być nierozpuszczalny w środowisku katalizowanej przemiany [230]. Jest to niezwykle ważne, nie tylko ze względu na zabezpieczenie białka przed szybkim wymyciem z powierzchni materiału nośnego, lecz przede wszystkim, ze względu na możliwe zanieczyszczenie produktów reakcji rozpuszczonym nośnikiem, jak i uwolnionym enzymem. Jak już wspomniano, stabilne związanie enzymu to jeden z najważniejszych parametrów wpływających na wybór nośnika. Stąd też rozpatrywany materiał musi odznaczać się dużą ilością reaktywnych grup funkcyjnych, takich jak hydroksylowe lub aminowe, które wykazują powinowactwo do grup funkcyjnych zawartych w strukturze biokatalizatora i zapewnią dużą zdolność do przyłączenia enzymu [231]. Ważne jest jednak, aby typ i rodzaj obecnych grup chemicznych umożliwiał wytworzenie pożądanych oddziaływań w jak najłagodniejszych warunkach, a powstałe interakcje zapewniały trwałe przywiązanie enzymu, bez znaczącej ingerencji w jego strukturę przestrzenną, co zapewnia zachowanie NOŚNIK odporność chemiczna stabilność w środowisku reakcji wysokie powinowactwo do enzymu brak negatywnego wpływu na bialko reaktywne powierzchniowe grupy funkcyjne dostępność i cena możliwość ponownego wykorzystania IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 57 - wysokiej aktywności katalitycznej. W przypadku braku możliwości bezpośredniego połączenia matrycy i biokatalizatora, nośnik powinien wykazywać podatność na modyfikacje, która umożliwiają zwiększenie ilości i/lub wprowadzenie niezbędnych ugrupowań chemicznych, odpowiadających za powstanie oddziaływań z białkiem katalitycznym [232,233]. Wytworzenie odpowiednio silnych oddziaływań jest także związane z hydrofilowo-hydrofobowym charakterem powierzchni nośnika. Dobór matrycy o odpowiednich właściwościach jest szczególnie istotny zwłaszcza w przypadku typów immobilizacji, w których nie dochodzi do wytworzenia wiązania kowalencyjnego, jak np. immobilizacja adsorpcyjna. W takim przypadku to charakter matrycy determinuje siłę powstających oddziaływań, a więc ważne jest, aby hydrofobowy enzym, np. lipaza, unieruchamiany był na powierzchni hydrofobowego nośnika, co spowoduje trwałe przyłączenie białka i zapobiegnie szybkiej elucji biokatalizatora z powierzchni matrycy [234,235]. Znaczący wpływ na przydatność danego materiału jako nośnika w immobilizacji ma jego budowa morfologiczna oraz struktura porowata, a więc kształt i rozmiar cząstek, wielkość powierzchni właściwej oraz kształt, rozmiar i objętość porów. Preferowane są matryce odznaczające się silnie porowatą powierzchnią właściwą, której wielkość przekracza 100 m2/g [236]. Taki dobór parametrów nośnika umożliwia swobodny transport substratów oraz produktów do i z centrum aktywnego enzymu, nie wywołując zarazem oporów dyfuzyjnych. W roli matryc najlepiej sprawdzają się materiały posiadające sferyczny kształt cząstek, których wielkość mieści się w zakresie od 100 do 300 nm [235]. Dobór nośnika charakteryzującego się odpowiednimi wartościami poszczególnych parametrów jest szczególnie ważny dla zastosowania preparatu po immobilizacji w procesach ciągłych, realizowanych w reaktorach zbiornikowych oraz przepływowych, a także w kolumnach reakcyjnych. Odpowiednie właściwości nośnika wydłużają bowiem okres wysokiej aktywności oraz zapewniają dużą sprawność operacyjną reaktora. Z technologicznego punktu widzenia, kluczowe znaczenie ma stabilność operacyjna preparatu po immobilizacji, a więc odporność układu na zmienne warunki procesowe. Stąd też wykorzystany nośnik musi charakteryzować się wysoką odpornością mechaniczną oraz dużą trwałością i sztywnością, co zapobiega jego znacznej degradacji podczas katalizowania kolejnych cykli reakcyjnych. Matryca o takich właściwościach stanowi odpowiednią ochronę dla enzymu, zapewniając jednocześnie wysokie wydajności katalizowanych procesów [237]. Kolejną z pożądanych cech jest odporność stosowanych nośników na ataki mikrobiologiczne, które mogą stanowić istotny problem przy długotrwałym wykorzystywaniu preparatu po immobilizacji w środowisku, gdzie obecne są różnego rodzaju mikroorganizmy, a więc w środowisku wodnym, w procesach konwersji biomasy lub w przypadku prowadzenia reakcji w zamkniętych instalacjach [238,239]. Duży wpływ na projektowanie procesów przemysłowych mają względy ekonomiczne. Tak więc nośnik, który potencjalnie ma być powszechnie stosowany w skali technicznej powinien być łatwo dostępny oraz relatywnie tani [240]. W przypadku braku możliwości bezpośredniego pozyskania odpowiedniej matrycy ze źródeł naturalnych, koszt jego produkcji nie może być wysoki, a sam proces syntezy powinien być jak najmniej skomplikowany. Jeżeli jednak matryca spełniająca wszystkie kryteria IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 60 - w procesie syntezy polimerów syntetycznych. Większość ze wspomnianych wyżej materiałów może być pozyskana jako produkt odpadowy z różnych gałęzi przemysłu, co czyni je łatwymi do otrzymania oraz tanimi [268]. Największą zaletą tych materiałów jest jednak obecność w ich strukturze dużej ilości grup chemicznych, które odpowiedzialne są za związanie enzymu lub ewentualną, efektywną modyfikację powierzchni nośnika. Ilość i rodzaj grup funkcyjnych determinują także zastosowanie wybranego materiału w konkretnej technice immobilizacji. Chityna i chitozan, zawierające grupy –OH oraz –NH2, a także ze względu na fakt występowania pod postacią ciała stałego o dużej odporności mechanicznej, wykorzystywane są głównie w immobilizacji kowalencyjnej [269]. Alginiany, karaginiany czy agar, dzięki tendencji do żelowania, np. pod wpływem dodatku jonów metali, znajdują zastosowanie głównie w immobilizacji poprzez kapsułkowanie i pułapkowanie. Warto podkreślić, że nie tylko polisacharydy mogą znaleźć zastosowanie jako biopolimery w immobilizacji enzymów. Spotykane są też prace, w których jako matryce wykorzystuje się inne biopolimery, jak np. ligninę czy szkielety gąbek pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego [270-272]. Popularną, głównie ze względu na niską cenę, grupę matryc pochodzenia organicznego oraz nieorganicznego, stanowią produkty dostępne komercyjnie, takie jak: Eupergit®, Florisil®, Celite® Promaxon® czy Purolite® [273,274]. Ich największą zaletą, poza ceną, jest duża dostępność oraz stabilność w różnych warunkach co powoduje, że są one szeroko stosowane w wielu procesach. Ze względu na dynamiczny rozwój metod syntezy układów hybrydowych oraz kompozytowych w ostatnich latach obserwuje się znaczący wzrost wykorzystania tych materiałów w różnych technikach immobilizacji. Wśród takich substancji można wyróżnić układy zarówno nieorganiczno-nieorganiczne, jak np. krzemionka-magnetyt [275], magnetyt-nanocząstki złota [276]; nieorganiczno-organiczne, np. krzemionka-chitozan [277] czy krzemionka w połączeniu z różnymi polimerami [278], jak i układy pochodzenia organiczno-organicznego, a wśród nich chitozan-alginian [279]. Zaletą zastosowania takich układów jest fakt, że można precyzyjnie zaprojektować ich właściwości, pod kątem konkretnego enzymu oraz procesu, w którym będą wykorzystywane. Dodatkowo materiały te łączą w sobie właściwości obu prekursorów, co zwiększa ich funkcjonalność oraz rozszerza gamę potencjalnych zastosowań. 3.2. Przegląd nośników stosowanych w immobilizacji enzymów Informacje zaprezentowane w podrozdziale 3.1. jasno wskazują na bardzo szeroki wachlarz materiałów, które mogą zostać wykorzystane jako nośniki w immobilizacji enzymów. Charakteryzują się one różnymi właściwościami co powoduje, że nie każdy surowiec może zostać zastosowany do unieruchomienia dowolnego enzymu. Poza powinowactwem do biokatalizatora, przy doborze odpowiedniej matrycy, należy także wziąć pod uwagę jej stabilność oraz odporność w danych warunkach reakcyjnych. Negatywny wpływ nośnika na właściwości katalityczne enzymu powinien być maksymalnie ograniczony, a powstały system biokatalityczny musi odznaczać się nie tylko wysoką aktywnością, ale i korzystnymi właściwościami użytkowymi. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 61 - Bardziej szczegółowy wykaz wykorzystywanych substancji wraz z unieruchamianymi na ich powierzchni enzymami, jak i technikami immobilizacji, w których zazwyczaj stosuje się dany materiał, został zaprezentowany w tabeli 3. Dla każdej z matryc wskazano także grupy funkcyjne odpowiedzialne za przyłączenie enzymu, jak i stosowany modyfikator powierzchni, gdy powinowactwo nośnika do białka jest zbyt niskie. W tabeli 3 zaprezentowano także zachowaną aktywność katalityczną preparatów po unieruchomieniu oraz wskazano ilość związanego biokatalizatora. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 62 - Tabela 3. Przegląd literatury przedstawiający rodzaje stosowanych nośników w różnych technikach immobilizacji Lp. Pochodzenie nośnika Nośnik Enzym Technika immobilizacji Związek modyfikujący Zachowana aktywność katalityczna Przyłączenie przez grupy Ilość unieruchomionego enzymu/wydajność immobilizacji Literatura 1. materiał nieorganiczny film mezoporowatej krzemionki α-amylaza z Bacillus sp. adsorpcyjna – b.d. immobilizacja w porach 1 µg enzymu na 1 cm2 nośnika [280] 2. krzemionka SBA 15 lipaza z Candida rugosa adsorpcyjna aldehyd glutarowy do 85% hydroksylowe, karbonylowe 344 mg enzymu na 1 g nośnika [281] 3. sferyczna krzemionka dehydrogenaza mrówczanowa z Candida methylica kowalencyjna epichlorohydryna 60% karbonylowe wydajność immobilizacji 75% [282] 4. żel krzemionkowy lipaza z Candida rugosa, Rhizomucor miehei oraz Candida antarctica kowalencyjna 3-glicydoksypropylo- trimetoksysilan b.d. epoksydowe 9,6 mg enzymu na 1 g nośnika [283] 5. mezoporowata krzemionka Ia3d acylaza G penicylinowa kowalencyjna kwas 3-chlorookso- benzoesowy 77% epoksydowe 209 mg enzymu na 1 g nośnika [284] 6. Fe3O4 oksydaza glukozowa z Aspergillus niger adsorpcyjna – 82% hydroksylowe b.d. [285] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 65 - 25. materiał biopolimerowy κ-karaginian -galaktozydaza z Aspergillus oryzae kowalencyjna polietylenoimina, aldehyd glutarowy 29% karbonylowe 11 443 U enzymu na 1 g nośnika [304] 26. celuloza komercyjna pektynaza adsorpcyjna dimetyloacetamid 30% karbonylowe, hydroksylowe 4,7 mg enzymu na 1 g nośnika [305] 27. celuloza lakkaza z Myceliophtora thermophila adsorpcyjna – 79% karbonylowe, hydroksylowe b.d. [306] 28. dekstran α-amylaza z Bacillus licheniformis kowalencyjna – 95% hydroksylowe b.d. [307] 29. gąbka roślinna z gatunku Luffa cylindrica β-glukozydaza z Aspergillus niger kowalencyjna aldehyd glutarowy 63% karbonylowe wydajność immobilizacji 95% [308] 30. materiał polimerowy mikrosfery poliaminowe lipaza z Candida rugosa kowalencyjna polietylenoimina, aldehyd glutarowy do 96% aminowe, aldehydowe 230,9 mg enzymu na 1 g nośnika [309] 31. polimerowa żywica aminoalkilowa lipaza typu B z Candida antarctica kowalencyjna eter diglicydylo-1,6- heksanodiolowy 81% epoksydowe wydajność immobilizacji 95% [310] 32. polistyren lipaza typu B z Candida antarctica kowalencyjna 1‐fluoro‐2‐nitro‐4‐azydo benzen b.d. grupy N3 218 mg enzymu na 1 g nośnika [311] 33. calix[4]arene komercyjna α-amylaza kowalencyjna aldehyd glutarowy 100% karbonylowe b.d. [312] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 66 - 34. materiał polimerowy diakrylan glikolu polietylenowego lipaza z trzustki świni enkapsulacja – 76% karbonylowe 0,005 mg enzymu na 1 µm grubości nośnika [313] 35. poliakryloamid peroksydaza chrzanowa enkapsulacja – > 80% aminowe, karbonylowe wydajność immobilizacji 92% [314] 36. polianilina komercyjna oksydoreduktaza pułapkowanie – b.d. aminowe b.d. [315] 37. poli(chlorek winylu) acylaza G penicylinowa kowalencyjna etylenodiamina 26% aminowe wydajność immobilizacji 24% [316] 38. materiał kompozytowy mezoporowata SiO2-Fe3O4 acylaza G penicylinowa kowalencyjna winylotrimetoksysilan 91% karbonylowe 129 mg enzymu na 1 g nośnika [317] 39. SiO2-diakrylan- glikolu polietylenowego lipaza z Candida rugosa kowalencyjna 3-glicydoksypropylo- trimetoksysilan b.d. epoksydowe 7,22 mg enzymu na 1 g nośnika [318] 40. SiO2-chitozan izomeraza glukozowa ze Streptomyces rubiginosus enkapsulacja aldehyd glutarowy 90% karbonylowe b.d. [319] 41. TiO2-chitozan lipaza z trzustki świni adsorpcyjna aldehyd glutarowy 66% karbonylowe, hydroksylowe 78 U enzymu na 1 g nośnika [320] 42. chitozan-kwas poliakrylowy izomeraza glukozowa ze Streptomyces rubiginosus adsorpcyjna – 85% aminowe, karbonylowe, b.d. [321] 43. Fe3O4-chitozan komercyjna ureaza enkapsulacja – 82% hydroksylowe 60 mg enzymu na 1 g nośnika [322] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 67 - 44. materiał kompozytowy Fe3O4- polistyren-kwas metakrylowy lipaza z Candida rugosa kowalencyjna 1-etylo-3-(3-dimetylo- aminopropylo)karbodiimid 64% karbonylowe wydajność immobilizacji 86% [323] 45. poli(alkohol winylowy)- poliamid 6 katalaza z wątroby wołowej kowalencyjna jony miedzi 64% karbonylowe, hydroksylowe, 65 mg enzymu na 1 g nośnika [324] 46. produkt komercyjny Florisil® pektynaza z Aspergillus aculeatus kowalencyjna aldehyd glutarowy, 3-aminopropylo- trietoksysilan 75% aminowe, karbonylowe 6,3 mg enzymu na 1 g nośnika [325] 47. Celite® lipaza AK 20 z Pseudomonas fluorescens adsorpcyjna – 127% hydroksylowe b.d. [326] 48. Eupergit® C oksydaza D- aminokwasowa ze świńskiej nerki kowalencyjna – 11% aminowe, epoksydowe b.d. [327] 49. Amberlite® IR tanaza z Penicillium variable kowalencyjna – 65% sulfonowe 30 000 U enzymu na 1 g nośnika [328] 50. Sepharose® β -ksylozydaza z Aspergillus niger kowalencyjna dietyloaminoetyl 94% aminowe wydajność immobilizacji 87% [329] * b.d. – brak dostępnych danych IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 70 - katalitycznej preparatów po immobilizacji (do 85%) oraz uzyskaniu wysokiej wydajności procesu unieruchamiania (96%) stosuje się objętościowy stosunek jonów wapnia do alginianu 1:4. Tak powstały preparat został wykorzystany w procesie usuwania barwników stosowanych w przemyśle tekstylnym z roztworów wodnych. Dzięki zamknięciu enzymu w biopolimerowej otoczce preparat odznacza się zachowaniem aktywności katalitycznej w dłuższym przedziale czasu, a także pozwala na degradację ponad 50% barwnika Bismark Brown R rozpuszczonego w analizowanym roztworze [302]. Przykładem zastosowania materiałów pochodzenia naturalnego są różnego rodzaju gąbki, wśród nich gąbka roślinna z gatunku Luffa cylindrica. Są to lignocelulozowe biopolimery, o otwartej, włóknistej strukturze, co umożliwia swobodny przepływ składników mieszaniny reakcyjnej, bez tworzenia się oporów dyfuzyjnych. Wspomniana gąbka została wykorzystana przez Ahmeda i współpracowników do unieruchomienia kowalencyjnego β-glukozydazy pozyskanej z Aspergillus niger z zastosowaniem aldehydu glutarowego jako mediatora. Produkt po immobilizacji odznacza się dobrą stabilnością podczas magazynowania, a ponadto długim czasem aktywności katalitycznej (t1/2) wynoszącym 213 min. Unieruchomiony enzym jest także mniej podatny na denaturujący wpływ takich czynników środowiska reakcji jak pH oraz temperatura [308]. Poza związkami polimerowymi pochodzenia naturalnego, jako nośniki enzymów stosowane są także polimery syntetyczne, wśród nich: poli(chlorek winylu), polistyren, polianilina czy poliakryloamid [309-316]. Zaletą tych materiałów jest obecność w strukturze wielu reaktywnych grup funkcyjnych, które wykazują duże powinowactwo do białek i umożliwiają trwałe związanie enzymu. Dodatkowo, wykorzystywane polimery charakteryzują się dużą odpornością, co podnosi stabilność preparatu po immobilizacji. Ciekawą właściwością nośników polimerowych jest także fakt, że mogą one przybierać różne formy, co powoduje, że są stosowane we wszystkich metodach immobilizacji. Bukhari oraz jego zespół zastosowali polistyren do unieruchomienia lipazy typu B z Candida antarctica. Produkty po immobilizacji mogą znaleźć zastosowanie w procesach biochemicznych, w reakcjach transestryfikacji kwasu oleinowego z metanolem, gdzie umożliwiają około 70-proc. konwersję substratów. Wykorzystanie 1‐fluoro‐2‐nitro‐4‐nitrobenzenu umożliwia chemiczne przyłączenie nawet 218 mg lipazy na 1 g nośnika, a powstałe wiązania zapobiegają wymywaniu enzymu, co przekłada się na wydłużenie aktywności katalitycznej [311]. Materiałem nośnym może być również polianilina, która została wykorzystana przez Nemzera oraz współpracowników do pułapkowania oksydoreduktazy. Powstałe układy, odznaczające się dobrą stabilnością oraz zachowaniem wysokich właściwości katalitycznych mogą zostać wykorzystane do budowy biosensorów. Co więcej, sama technika immobilizacji, zapewniająca ochronę białka, jak i jego silne związanie z nośnikiem, zapobiegające wymyciu enzymu, pozwalają na wielokrotne stosowanie powstałego preparatu, bez wyraźnego spadku aktywności [315]. Osobną grupę materiałów, które na przestrzeni ostatnich lat coraz szerzej stosuje się w immobilizacji enzymów stanowią układy kompozytowe oraz hybrydowe. Największą zaletą tej grupy związków jest fakt połączenia pożądanych właściwości obu składników w celu otrzymania układu o najkorzystniejszych właściwościach dla danego zastosowania. Dobrym przykładem jest kompozyt IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 71 - mezoporowatej krzemionki z magnetytem, gdzie połączono wysokie zdolności sorpcyjne ditlenku krzemu z magnetycznymi właściwościami Fe3O4. Układ taki zastosowano do immobilizacji acylazy G penicylinowej w celu łatwego oddzielenia systemu biokatalitycznego od mieszaniny reakcyjnej. Unieruchomiono 129 mg enzymu na 1 g nośnika, a powstały produkt wykazywał dobre właściwości katalityczne (ponad 90%), co czyni go potencjalnym katalizatorem przemian wykorzystywanych w przemyśle farmaceutycznym [317]. Jednak nie tylko materiały powstałe z połączenia dwóch prekursorów nieorganicznych są wykorzystywane jako nośniki enzymów. Spotykane jest bardzo szerokie spektrum możliwych kombinacji, począwszy od połączenia materiału nieorganicznego z biopolimerem (SiO2-chitozan, TiO2-chitozan), jak i syntetycznym polimerem (SiO2-diakrylan glikolu polietylenowego), poprzez złączenie dwóch polimerów (poli(alkohol winylowy)-poliamid 6), na powiązaniu biopolimeru z polimerem (chitozan-kwas poliakrylowy) skończywszy [318-324]. Warto odnotować, że tak duże możliwości łączenia różnych prekursorów powodują, że synteza oraz właściwości konkretnego materiału kompozytowego są determinowane głównie przez rodzaj wykorzystania układu po immobilizacji oraz charakter enzymu. Mikrosfery kompozytowe chitozan-kwas poliakrylowy zostały wykorzystane do kowalencyjnej immobilizacji izomerazy glukozowej pozyskanej ze Streptomyces rubiginosus. Xu i współpracownicy w swoich badaniach dowodzą, że wysoce porowata struktura powstałych sfer, a także duża ilość grup karbonylowych, wchodzących w skład kwasu poliakrylowego, umożliwiają unieruchomienie znacznych ilości enzymu, a także zapewniają zachowanie wysokiej, 85-proc. aktywności katalitycznej, przez unieruchomione białko. Preparat po immobilizacji może znaleźć zastosowanie w procesie przemysłowej izomeryzacji glukozy do fruktozy, ze względu na fakt, że charakteryzuje się bardzo nieznacznym obniżeniem aktywności katalitycznej na przestrzeni piętnastu cykli reakcyjnych [321]. Wysoka biozgodność chitozanu była podstawą do wykorzystania i zsyntezowania przez Dogaca i Teke kompozytu Fe3O4-chitozan, który został wykorzystany do immobilizacji poprzez enkapsulację komercyjnie dostępnej ureazy. System biokatalityczny został zastosowany w reakcji enzymatycznego rozkładu mocznika i charakteryzował się wysoką aktywnością katalityczną w szerszym zakresie pH (5,0–9,5) oraz temperatury (25–60 °C), w porównaniu z wolnym białkiem. Dodatkowo, wytworzony produkt odznaczał się relatywnie dużą stabilnością podczas magazynowania, gdyż po czterech miesiącach zachował ponad 50% swojej początkowej aktywności. Należy również podkreślić, że wykorzystanie unieruchomionego biokatalizatora zapewnia dużą kontrolę nad przebiegiem reakcji oraz zdolność do szybkiego oddzielenia układu enzymatycznego od mieszaniny reakcyjnej poprzez przyłożenie zewnętrznego pola magnetycznego [322]. Feng wraz z zespołem wykorzystał polimerową membranę zbudowaną z poli(alkoholu winylowego) oraz poliamidu 6, w którą wbudowano jony miedzi, do kowalencyjnego związania katalazy pozyskanej z wątroby wołowej. Jony miedzi odpowiedzialne są za trwałe związanie cząsteczek enzymu, co umożliwia wykorzystanie produktu po immobilizacji w reaktorze ciągłym. Wyniki badań wskazują, że powstały układ może być z powodzeniem stosowany w ochronie środowiska, ponieważ umożliwia konwersję substratów na poziomie 90%, a także wykazuje wysoką aktywność w trakcie pracy reaktora (ponad 70% po 25 dniach pracy reaktora) [324]. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 72 - W procesie immobilizacji, jako nośniki często stosuje się także materiały komercyjne. Wśród nich matryce pochodzenia nieorganicznego, głównie krzemionkowe, takie jak: Florisil® czy Celite®, żywice jonowymienne, np.: Lewatit® jak i różne typy żywicy Amberlite® IR oraz odpowiednio przygotowane materiały biopolimerowe (np. Sepharose® i Sephadex®). Osobną, bardzo szeroką grupę, stanowią komercyjne produkty polimerowe. Wśród nich Accurel® – produkt oparty na polipropylenie, a także różne rodzaje produktów pod ogólną nazwą Eupergit®, które posiadają w swojej strukturze reaktywne grupy epoksydowe, jak i inne materiały takie jak Purasorb® czy LentiKats®. Niekwestionowaną zaletą produktów komercyjnych jest ich dostępność, relatywnie niska cena, jak i fakt, że możliwe staje się pominięcie etapu syntezy matrycy, co automatycznie przekłada się na zwiększenie ekonomiki całego procesu immobilizacji. Dodatkowo, duże zróżnicowanie dostępnych produktów powoduje, że istnieje możliwość swobodnego wyboru nośnika, najbardziej odpowiedniego dla stosowanego enzymu oraz stabilnego w warunkach środowiska procesu katalitycznego. Materiały te odznaczają się również dobrymi właściwościami sorpcyjnymi, co umożliwia przeprowadzenie procesu immobilizacji z wydajnościami około 90% oraz unieruchomienie dużych ilości enzymu [328,329]. Brem wraz z zespołem wykorzystał Celite®, materiał krzemionkowy o dobrych właściwościach sorpcyjnych, do immobilizacji lipazy z Pseudomonas fluorescens, a powstały układ został zastosowany w procesie rozdziału kinetycznego 3-arylo-3-hydroksy estrów. Otrzymany system biokatalityczny charakteryzował się o prawie 30% wyższą aktywnością katalityczną niż wolny enzym, a co więcej umożliwiał rozdział kinetyczny mieszaniny estrów z wysokimi wydajnościami oraz ponad dwukrotnie większym nadmiarem enancjomerycznym pożądanego produktu, niż w przypadku stosowania wolnej formy białka [326]. W innych badaniach Benassi oraz współpracownicy przeprowadzili kowalencyjną immobilizację β-ksylozydazy z Aspergillus niger z wykorzystaniem produktu Sepharose®, a powstały produkt wykorzystano w hydrolizie ksylooligosacharydów – procesie o dużym znaczeniu biotechnologicznym. Uzyskano wysoką wydajność immobilizacji (około 90%), a unieruchomiony biokatalizator zachował 94% aktywności wolnej formy białka. Wartym odnotowania jest także fakt, że w porównaniu z wolnym enzymem, produkt po immobilizacji w zdecydowanie mniejszym stopniu ulega inhibicji ksylozą oraz glukozą, które są uwalniane w trakcie katalizowanego procesu, co powoduje zwiększenie wydajności procesów prowadzonych z zastosowaniem unieruchomionej β-ksylozydazy [329]. 3.3. Modyfikatory powierzchni w immobilizacji enzymów W celu zwiększenia powinowactwa matrycy do enzymu i ułatwienia wytworzenia stabilnych oddziaływań, wykorzystuje się związki pośrednie, które pełnią rolę modyfikatorów powierzchni nośnika. Substancje te, poprzez funkcjonalizację wykorzystywanego materiału nośnego, umożliwiają trwałe związanie biomolekuły z podłożem. Powstałe stabilne wiązania pozwalają na oddalenie biokatalizatora od powierzchni matrycy, co zmniejsza zawadę przestrzenną i ułatwia transport składników mieszaniny reakcyjnej [330,331]. Związki modyfikujące umożliwiają wprowadzenie na powierzchnię nośnika nowych IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 75 - 3.4. Podsumowanie wiadomości dotyczących nośników w immobilizacji enzymów Najważniejsze właściwości unieruchomionych enzymów determinowane są przez rodzaj immobilizowanego enzymu i zastosowany typ nośnika. Biokatalizator ma kluczowy wpływ na charakter oraz rodzaj katalizowanej przemiany, jednak to wybór matrycy determinuje zachowanie wysokiej aktywności katalitycznej oraz stabilności przez preparaty po immobilizacji. Stąd też selekcja odpowiedniego nośnika stanowi poważne wyzwanie i ma wpływ nie tylko na efektywne przeprowadzenie procesu immobilizacji oraz unieruchomienie satysfakcjonujących ilości enzymu, ale także w znaczący sposób wpływa na wydajność powstałego systemu biokatalitycznego. W immobilizacji zastosowanie znajduje bardzo wiele różnego rodzaju substancji. Selekcja matrycy związana jest zarówno z rodzajem unieruchamianego biokatalizatora, jak i warunkami reakcyjnymi, w których układ katalityczny będzie pracował. Najważniejszą z pożądanych cech matrycy jest to, aby wykazywała ona odpowiednio wysokie powinowactwo do danego typu enzymu. Dlatego też nośnik powinien charakteryzować się dobrymi właściwościami sorpcyjnymi i/lub rozwiniętą powierzchnią właściwą, oraz zawierać reaktywne grupy funkcyjne na swojej powierzchni. Właściwości te zapewniają trwałe związanie białka z materiałem nośnym, bez względu na zastosowaną technikę immobilizacji. Ważne jest też, aby matryca nie miała negatywnego wpływu na strukturę oraz właściwości enzymów, co może doprowadzić do denaturacji białka i utraty aktywności katalitycznej. Dodatkowo substancja, która może zostać wykorzystana jako nośnik, powinna spełniać także kilka innych warunków. Przede wszystkim nie może być rozpuszczalna w środowisku realizowanej przemiany, aby system enzymatyczny mógł spełniać funkcję katalizatora heterogenicznego. Materiał ten nie powinien reagować ze składnikami mieszaniny reakcyjnej, aby nie zachodziły przemiany uboczne i nie dochodziło do zanieczyszczenia produktów dodatkowymi składnikami. W przypadku odpowiedniego nośnika konieczna jest także wysoka stabilność oraz odporność wybranej substancji. Brak negatywnego wpływu rozpuszczalników, temperatury czy pH na nośnik, w trakcie katalizowanej przemiany, zapewnia wyższą stabilność oraz ochronę struktury immobilizowanego enzymu. Co więcej wysoka odporność mechaniczna matrycy powoduje, że układ biokatalityczny nie ulega degradacji w trakcie kolejnych cykli reakcyjnych, co zapewnia jego dobrą sprawność operacyjną. Potencjalne, przemysłowe wykorzystanie preparatów unieruchomionych enzymów powoduje, że spory nacisk położono na koszt ich wytworzenia. Stąd też istotnym parametrem warunkującym dobór nośnika jest jego dostępność oraz cena. Dlatego najpowszechniej stosowane są materiały o stosunkowo dużej dostępności, odznaczające się relatywnie niską ceną i łatwością pozyskania. Jak wykazano w rozdziale 3 niniejszej dysertacji, zasadniczy podział wszystkich nośników związany jest z wyróżnieniem dwóch grup: nośników pochodzenia nieorganicznego oraz organicznego. Te pierwsze odznaczają się dużą stabilnością oraz dobrymi właściwościami sorpcyjnymi. Matryce organiczne z kolei można podzielić na materiały pochodzenia naturalnego, biopolimery oraz syntetyczne polimery. Substancje te zawierają w swojej budowie wiele reaktywnych grup funkcyjnych zdolnych do trwałego IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 76 - przyłączenia enzymu. W skład obu głównych grup wchodzą materiały, które są komercyjnie dostępne. Ich największą zaletą jest cena, a szeroka gama tych preparatów powoduje, że stosunkowo łatwy jest dobór najbardziej odpowiedniego nośnika, pod kątem danego biokatalizatora. Interesującą grupę matryc stanowią także materiały kompozytowe. Powstają one poprzez połączenie dwóch prekursorów i tworzą finalny układ charakteryzujący się pożądanymi cechami. Wyróżnić można kompozyty powstałe poprzez zespolenie substancji wyjściowych różnego pochodzenia, które znajdują coraz szersze zastosowanie w immobilizacji białek enzymatycznych. Przy doborze odpowiedniego nośnika wziętych pod uwagę powinno być wiele zmiennych, a selekcja właściwego materiału ma kluczowy wpływ na właściwości układu po immobilizacji. Konieczne jest znalezienie kompromisu pomiędzy stabilnością matrycy i jej zdolnościami do wiązania białka, jak i uwzględnienie ceny nośnika oraz jego wpływu na unieruchomiony enzym. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 77 - CEL I ZAKRES PRACY Nadrzędnym celem przedkładanej dysertacji doktorskiej jest ocena możliwości immobilizacji wybranych enzymów z grupy hydrolaz na powierzchni nośników pochodzenia nieorganicznego, organicznego, jak i materiałów kompozytowych. Kluczowy etap prac obejmuje scharakteryzowanie wpływu początkowych parametrów procesu immobilizacji na jego przebieg oraz właściwości powstałych układów, a także zdefiniowanie aktywności katalitycznej oraz stabilności wytworzonych systemów enzymatycznych w oparciu o reakcje modelowe i rzeczywiste. Ze względu na szeroki zakres prowadzonych badań realizacja pracy została podzielona na poszczególne etapy: 1. Otrzymanie i/lub odpowiednie przygotowanie nośników, w tym: synteza krzemionki typu zol-żel, hydroksyapatytu, a także materiałów kompozytowych krzemionka-lignina i chityna-lignina, modyfikacja chityny związkami typu POSS oraz preparatyka gąbek Luffa cylindrica i Hippospongia communis. 2. Przeprowadzenie procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae, Amano Lipase A z Aspergillus niger, lipazy typu B z Candida antarctica oraz lipazy z Aspergillus niger na powierzchni przygotowanych wcześniej materiałów. 3. Weryfikacja skutecznego unieruchomienia enzymów oraz podjęcie próby zdefiniowania rodzaju interakcji powstałych pomiędzy nośnikiem a biokatalizatorem (zastosowane techniki m.in.: FTIR, XPS, AFM, SEM, 13C CP MAS NMR, analiza elementarna). 4. Zdefiniowanie wpływu czasu immobilizacji oraz początkowego stężenia roztworu białka na ilość unieruchomionego enzymu oraz właściwości powstałych produktów (m.in.: metoda Bradford). 5. Scharakteryzowanie wpływu początkowych parametrów procesu immobilizacji na aktywność katalityczną zachowaną przez otrzymane systemy biokatalityczne. 6. Określenie efektu pH, temperatury, ilości następujących po sobie cykli katalitycznych oraz czasu i temperatury magazynowania na aktywność hydrolityczną wytworzonych układów. 7. Zastosowanie wybranych produktów po immobilizacji w procesie transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem, jako potencjalnych, efektywnych katalizatorów w produkcji estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME). IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 80 - Do reaktora o pojemności 500 ml zaopatrzonego w mieszadło szybkoobrotowe EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy), wprowadzono 100 ml 96-proc. alkoholu etylowego (Chempur, Polska) oraz 11 ml 25-proc. roztworu wody amoniakalnej (Chempur, Polska) i rozpoczęto mieszanie z szybkością około 1200 obr/min. Następnie przy pomocy pompy perystaltycznej ZALIMP PP1B-05A (Polska), zadozowano 17 ml tetraetoksysilanu (TEOS) zakupionego w firmie VWR International (Polska), z szybkością około 1 ml/min. Cały proces prowadzono jeszcze przez 30 min w temperaturze 40 °C, w łaźni wodnej Julabo 13 EH, firmy Julabo Labortechnik GmbH (Niemcy). Powstały osad sączono pod zmniejszonym ciśnieniem na zestawie firmy Sartorius Stedim Biotech (Niemcy) po czym intensywnie przemywano alkoholem etylowym w celu deaglomeracji powstałych cząstek. W końcowym etapie krzemionkę suszono w suszarce stacjonarnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h, a następnie przesiano przez sito o wielkości oczek 63 µm. Uproszczony schemat otrzymywania krzemionki metodą zol-żel zaprezentowano na rys. 20. Rys. 20. Uproszczony schemat technologiczny syntezy krzemionki zol-żel, gdzie: 1 – pompa perystaltyczna, 2 – reaktor z mieszadłem, 3 – zestaw do filtracji, 4 – suszarka stacjonarna, na podstawie [342] 4.3. Otrzymywanie materiału hybrydowego krzemionka-lignina Synteza materiału hybrydowego krzemionka-lignina jest procesem złożonym z kilku etapów, które zostały szczegółowo opracowane w Zakładzie Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej [343-346]. W oparciu o te prace przeprowadzono syntezę tego materiału. W badaniach wykorzystano komercyjnie dostępną krzemionkę Syloid® 244, która została wyprodukowana przez firmę W.R. Grace & Co. (USA). Jest to białe, amorficzne ciało stałe o hydrofilowym charakterze i cząstkach o nieregularnych kształtach. W pierwszym etapie prac dotyczących otrzymania materiału krzemionka-lignina, powierzchnię krzemionki poddano modyfikacji silanowym związkiem wiążącym, którym był N-2-(aminoetylo)-3- aminopropylotrimetoksysilan dostarczony przez firmę Sigma-Aldrich, USA. Modyfikator, w ilości 96% C2H5OH 25% NH3·H2O IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 81 - 5 cz. wag. został rozpuszczony w mieszaninie alkoholu metylowego z wodą (4:1, v/v) i z wykorzystaniem atomizera naniesiony na powierzchnię krzemionki, a następnie całość dokładnie wymieszano. Zmodyfikowaną krzemionkę suszono następnie przez 24 h w temperaturze 105 °C. Drugim etapem badań była aktywacja ligniny krafta (Sigma-Aldrich, USA), aby zwiększyć jej powinowactwo do krzemionki. W tym celu 1 g ligniny zawieszono w mieszaninie dioksanu i wody (9:1, v/v) i umieszczono w reaktorze. Do przestrzeni reakcyjnej, wyposażonej w mieszadło szybkoobrotowe EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) zadozowano roztwór powstały w wyniku rozpuszczenia 1,5 g jodanu(VII) sodu (Sigma-Aldrich, USA) w 30 ml wody, a po dodaniu aktywatora, proces prowadzono jeszcze przez 30 min, bez dostępu światła. Końcowym etapem prac nad syntezą materiału krzemionka-lignina było dodanie 5 g zmodyfikowanej uprzednio krzemionki i kontynuowanie mieszania przez 1 h. Po tym czasie, powstały materiał hybrydowy przeniesiono na wyparkę próżniową Rotavapor RII-HB 50Y (BÜCHI Labortechnik AG, Szwajcaria) w celu oddzielenia rozpuszczalników. Produkt suszono następnie w suszarce konwekcyjnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h. Na rys. 21. schematycznie zaprezentowano syntezę materiału krzemionka-lignina. Rys. 21. Schemat technologiczny syntezy materiału hybrydowego krzemionka-lignina, gdzie: 1 – pompa perystaltyczna, 2 – reaktor z mieszadłem, 3 – wyparka próżniowa, 4 – suszarka stacjonarna, na podstawie [343] 4.4. Synteza układu chityna-lignina Proces otrzymywania materiału chityna-lignina składał się z dwóch etapów, z których pierwszy polegał na odpowiednim przygotowaniu chityny, a drugi na syntezie finalnego układu. W badaniach wykorzystano doświadczenie pracowników zespołu Zakładu Technologii Chemicznej Politechniki Poznańskiej w zakresie syntezy tego materiału [347]. W pierwszej kolejności, komercyjnie dostępną chitynę z pancerzyków krewetek (Sigma-Aldrich, USA), rozdrobniono w ucieraku moździerzowym RM 100 (Retsch GmbH, Niemcy) w środowisku ciekłego azotu, a następnie, w celu klasyfikacji, przesiano przez sito o średnicy oczek 80 µm. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 82 - W trakcie syntezy przeprowadzono, analogicznie do procesu otrzymywania materiału krzemionka-lignina, aktywację ligniny wykorzystując do tego 15-proc. roztwór nadtlenku wodoru (Sigma-Aldrich, USA). W tym celu do reaktora wprowadzono 5 g ligniny oraz 15 ml H2O2 i całość mieszano przez 30 min za pomocą mieszadła szybkoobrotowego EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) z szybkością ok. 800 obr/min. Po tym czasie do układu wprowadzono 5 g przygotowanej uprzednio chityny i kontynuowano mieszanie przez 1 h. Ideę procesu modyfikacji opisano we wcześniej opublikowanych pracach [347]. Po zakończeniu mieszania gotowy produkt sączono pod zmniejszonym ciśnieniem na lejku Büchnera, intensywnie przemywając gorącą wodą w celu odmycia pozostałości ligniny. Układ suszono w suszarce stacjonarnej UFB 500 BASIC (Memmert GmbH & Co. KG, Niemcy) w temperaturze 105 °C przez 24 h i przesiano przez sito o wielkości oczek 80 µm. Na rys. 22. schematycznie przedstawiono poszczególne etapy syntezy układu chityna-lignina. Rys. 22. Schemat technologiczny syntezy układu chityna-lignina gdzie: 1 – reaktor z mieszadłem, 2 – zestaw do filtracji, 3 – suszarka stacjonarna 4.5. Modyfikacja chityny związkami typu POSS W pierwszym etapie prac chitynę pozyskaną z pancerzyków krewetek, zakupioną w firmie Sigma-Aldrich (USA) rozdrobniono w ucieraku moździerzowym RM 100 (Retsch GmbH, Niemcy) w obecności ciekłego azotu i przesiano przez sito o wielkości oczek 80 µm. Następnie 10 g tak przygotowanej chityny wprowadzono do reaktora i dodano 30 ml roztworu zawierającego 5 g odpowiedniego związku typu POSS. Jako modyfikatory wybrano Methacryl POSS Cage mixture (MPOSS) oraz Vinyl POSS Cage mixture (VPOSS), które zostały rozpuszczone odpowiednio w etanolu oraz w tetrahydrofuranie (THF). Powstałe roztwory poddano mieszaniu za pomocą mieszadła EUROSTAR Digital (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy) z szybkością ok. 800 obr/min przez okres 1 h. Kolejnym etapem było odparowanie rozpuszczalnika z wykorzystaniem wyparki próżniowej Rotavapor RII-HB 50Y firmy BÜCHI Labortechnik AG (Szwajcaria). Następnie zmodyfikowaną chitynę suszono w temperaturze 100 °C przez okres 12 h. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 85 - w temperaturach: 4, 20 oraz 50 °C oraz w pH w przedziale od 5 do 9. W celu otrzymania roztworu białka o pH 5 zastosowano bufor octanowy (Sigma-Aldrich, USA), z kolei bufor fosforanowy (Sigma-Aldrich, USA) wykorzystano do sporządzenia roztworów enzymu o pH 6 oraz 7, natomiast bufor trihydroksymetyloaminometanowy (TRIS, Sigma-Aldrich, USA) posłużył do otrzymania roztworów enzymu o pH 8 oraz 9. Po zakończonym procesie mieszaniny filtrowano pod zmniejszonym ciśnieniem na zestawie firmy Sartorius Stedim Biotech (Niemcy). Powstałe po immobilizacji produkty, w postaci ciała stałego, suszono przez 24 h w temperaturze otoczenia. Otrzymane osady oraz pozostałe przesącze poddano następnie dalszym analizom fizykochemicznym. 6. Analiza fizykochemiczna oraz morfologiczna preparatów unieruchomionych enzymów Zarówno nośniki przed immobilizacją, jak i preparaty unieruchomionych enzymów poddano wnikliwej analizie fizykochemicznej oraz morfologicznej. Zastosowano w tym celu zaawansowane metody oraz techniki pomiarowe i badawcze, których opis zaprezentowano w niniejszym rozdziale. Wyniki przeprowadzonych analiz nie tylko umożliwiły charakterystykę zastosowanych nośników, lecz również posłużyły do potwierdzenia efektywności i skuteczności zaproponowanych metod immobilizacji enzymów. Co więcej, w oparciu o otrzymane rezultaty możliwym było określenie wpływu poszczególnych parametrów procesu immobilizacji na właściwości wytworzonych układów biokatalitycznych. Dodatkowo wytypowano preparaty odznaczające się najlepszymi właściwościami wykorzystane następnie w testach katalitycznych. 6.1. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera oraz spektroskopia Ramana Spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) oraz spektroskopię ramanowską wykorzystano do identyfikacji grup funkcyjnych obecnych w badanym materiale, które mogą potencjalnie brać udział w przyłączeniu białka, a także do potwierdzenia skutecznej immobilizacji enzymu na powierzchni danego materiału [348,349]. Analizę FTIR wykonano na aparacie Vertex 70 firmy Bruker (Niemcy), natomiast analizę spektroskopii Ramana przeprowadzono we współpracy ze Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, na aparacie IFS 66v/s z przystawką Ramana FRA 106/S (Bruker, Niemcy). Przed przystąpieniem do analizy FTIR konieczne było przygotowanie próbki, którą analizowano w postaci pastylki z KBr. W tym celu 1,5 mg badanej substancji utarto w moździerzu z 250 mg bezwodnego bromku potasu (Sigma-Aldrich, USA). Następnie mieszaninę sprasowano pod ciśnieniem 10 MPa i powstałą pastylkę umieszczono w komorze pomiarowej spektrometru. Analizę FTIR zrealizowano w zakresie liczby falowej 4000–400 cm-1 z rozdzielczością 0,5 cm-1. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 86 - Widma ramanowskie analizowano w zakresie spektralnym 3500–250 cm-1 w kuwetach kwarcowych z rozdzielczością spektralną wynoszącą 4 cm-1. W pomiarach wykorzystano wstecznie rozproszone światło lasera o długości fali λ=520 nm. 6.2. Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim Spektroskopia fotoelektronów wzbudzonych promieniowaniem rentgenowskim – XPS (ang. X-ray Photoelectron Spectroscopy) została wykorzystana do zdefiniowania rodzaju oddziaływań powstałych w próbkach po immobilizacji, jak i do określenia pierwiastkowego składu powierzchniowego analizowanych materiałów [350]. Analizy XPS zrealizowano w Instytucie Technologii Chemicznej Nieorganicznej i Inżynierii Środowiska Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie, a w badaniach wykorzystano aparat firmy Prevac (Polska) z dołączonym hemisferycznym analizatorem energii elektronów SES 2002 firmy VG Scienta (Szwecja). Materiały analizowano w postaci proszku, który naklejono z wykorzystaniem grafitowych krążków, do folii aluminiowej. W dalszej kolejności materiały wprowadzono do śluzy aparatu, gdzie przebywały pod ciśnieniem 1·10-9 mbar. Emisja fotoelektronów została wymuszona poprzez lampę rentgenowską pracującą przy napięciu 15 kV i prądzie emisji 25 mA, zaopatrzoną w anodę glinową emitującą promieniowanie AlKα (hν=1486,6 eV). W czasie wykonywania widm przeglądowych energia przejścia PE wynosiła 100 eV, natomiast dla widm wysokiej rozdzielczości PE=50 eV. Przed przystąpieniem do pomiarów spektroskop został skalibrowany w oparciu o linię miedzi EB Cu 2p3/2=932,8 eV, srebra EB Ag 3d5/2 BE=368,3 eV oraz linię złota EB Au 4f7/2=84,0 eV. 6.3. Magnetyczny węglowy rezonans jądrowy – 13C CP MAS NMR Spektroskopia 13C CP MAS NMR, a więc spektroskopia węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Solid-state Cross-Polarization Magic Angle Spinning Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) to technika analityczna, która umożliwia określenie rodzajów atomów węgla, jakie występują w badanym materiale [351]. Badania spektroskopowe NMR wykonano we współpracy z Centrum Badań Molekularnych i Makromolekularnych Polskiej Akademii Nauk w Łodzi, w Samodzielnej Pracowni Badań Strukturalnych – Środowiskowym Laboratorium Analizy Związków Organicznych i Polimerów. Analizę wykonano z wykorzystaniem spektrometru Avance DRX 500 (Bruker, Niemcy). Aparat ten pozwala na rejestrację widma w zakresie częstotliwości 12–600 MHz oraz wykonanie widm dwuwymiarowych. Analiza została wykonana poprzez umieszczenie ok. 100 mg analizowanej próbki na obrotowym statywie wykonanym z ditlenku cyrkonu o średnicy 4 mm, który umożliwia obrót próbki i jej odwirowanie pod kątem magicznym (ang. magic angle) przy częstotliwości 8 kHz. Widma 13C CP MAS NMR zarejestrowano przy częstotliwości 100,63 MHz w 4 mm próbniku. Do pomiarów wykorzystano pojedynczy IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 87 - impuls wzbudzający z rozprzęgającym protonem o wysokiej energii (powtarzalność impulsu 10 s, szybkość obrotu 8 kHz). 6.4. Ocena morfologii i mikrostruktury z zastosowaniem skaningowej mikroskopii elektronowej oraz mikroskopii cyfrowej Morfologię powierzchni wybranych nośników przed i po procesie immobilizacji enzymu oceniono z zastosowaniem skaningowego mikroskopu elektronowego – SEM (ang. Scanning Electron Microscope). Zasada działania mikroskopu skaningowego polega na bombardowaniu powierzchni analizowanej próbki wiązką elektronów, a następnie na detekcji, przez odpowiednie detektory, różnych sygnałów (np. elektronów wtórnych czy wstecznie rozproszonych), po odbiciu od powierzchni próbki [352]. Analizę SEM wykonano przy współpracy z Wydziałową Pracownią Mikroskopii Elektronowej i Konfokalnej Wydziału Biologii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu na mikroskopie EVO40 firmy Zeiss AG (Niemcy). Przed właściwym pomiarem powierzchnia próbki była pokrywana złotem przez 5 s przy użyciu napylarki PV205P (Balzers, Szwajcaria). Zdjęcia cyfrowe matrycy przed i po unieruchomieniu enzymu wykonano na mikroskopie optycznym VHX 5000 firmy Keyence (Japonia). 6.5. Mikroskopia sił atomowych Mikroskop sił atomowych – AFM (ang. Atomic Force Microscope) został wykorzystany w celu zobrazowania zmian zachodzących w topografii powierzchni nośnika przed oraz po procesie immobilizacji enzymu. Pomiar rozpoczęto od naniesienia analizowanej substancji na powierzchnię nośnika aparatu, który stanowiła uprzednio mechanicznie oczyszczona mika. Cienka warstwa badanego materiału została naniesiona na mikę z wykorzystaniem metody spin coating. Do przeprowadzenia pomiaru wykorzystano dźwignię typu BudgetSensors All-in-One (USA), której częstotliwość rezonansu wynosiła około 150 kHz. Do obróbki danych wykorzystano program WSxM [353]. Analizę AFM wykonano w Wielkopolskim Centrum Zaawansowanych Technologii na aparacie Agilent 5500 (USA), który pracował w trybie przerywanego kontaktu. 6.6. Ocena potencjału elektrokinetycznego (dzeta) Potencjał dzeta badanych układów po immobilizacji wyznaczono w celu oceny ich stabilności elektrokinetycznej w szerokim zakresie pH. Badania wykonano na aparacie Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Wielka Brytania), który dodatkowo wyposażony jest w autotitrator MPT-2 [354]. W pomiarach wykorzystuje się połączenie elektroforezy oraz laserowego pomiaru ruchliwości cząstek w oparciu o efekt Dopplera. Jest to metoda ELS, z ang. Electrophoretic Light Scattering IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 90 - roztworu enzymu i pozostawiono na 10 min, po czym zmierzono absorbancję. Stężenie białka w próbce określono przy pomocy krzywej wzorcowej, którą sporządzono w oparciu o roztwory surowiczej albuminy wołowej (ang. bovine serum albumin) o znanym stężeniu. 6.11. Określenie wydajności immobilizacji proteazy Wydajność procesu immobilizacji proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu została określona z wykorzystaniem pomiarów spektroskopowych realizowanych zgodnie z metodą Bradford, w oparciu o równanie 2: = ·% (2) gdzie: IY to wydajność immobilizacji [%], AI to ilość unieruchomionego enzymu, natomiast AT oznacza ilość unieruchomionego enzymu, przy 100-proc. wydajności. 7. Ocena aktywności katalitycznej oraz stabilności preparatów immobilizowanych enzymów Aktywność katalityczna zachowana przez preparaty po immobilizacji lipazy, jak i wpływ na nią takich parametrów jak: pH oraz temperatura katalizowanego procesu, to najważniejsze czynniki determinujące potencjalne wykorzystanie otrzymanych preparatów. Istotna jest również ocena, w jaki sposób ilość cykli katalitycznych oraz czas magazynowania wpływają na zmiany właściwości hydrolitycznych otrzymanych systemów enzymatycznych. W ramach niniejszej dysertacji zdefiniowano również parametry kinetyczne unieruchomionych enzymów. Natomiast możliwość aplikacyjnego zastosowania preparatów po immobilizacji potwierdzono z wykorzystaniem reakcji transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem. 7.1. Aktywność katalityczna preparatów po immobilizacji Aktywność katalityczną zachowaną przez preparaty po immobilizacji lipazy zdefiniowano w oparciu o modelową reakcję hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu (p-NPP) do para-nitrofenolu (p-NP) oraz kwasu palmitynowego, której przebieg schematycznie zaprezentowano na rys. 24. W ramach przeprowadzonych badań sporządzono dwa roztwory R1 oraz R2. Roztwór pierwszy stanowił 10 mM roztwór p-NPP w propan-2-olu, który powstał w skutek rozpuszczenia 0,38 g p-NPP (Sigma-Aldrich, USA) w 100 ml propan-2-olu (Chempur, Polska). Roztwór R2 powstał poprzez rozpuszczenie 0,44 g Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) oraz 0,11 g gumy arabskiej (Sigma-Aldrich, USA) w 100 ml buforu fosforanowego o pH=7 (Sigma-Aldrich, USA). Oba roztwory zostały następnie zmieszane w stosunku objętościowym równym 1:9, tworząc mieszaninę reakcyjną. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 91 - NO2 O C C15H31 O H2O C15H31COOH OH NO2 Lipaza Rys. 24. Modelowa reakcja hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu do para-nitrofenolu oraz kwasu palmitynowego W celu przeprowadzenia modelowej reakcji enzymatycznej odmierzono 3 ml mieszaniny reakcyjnej do kuwety kwarcowej i dodano 5 mg wolnego enzymu oraz odpowiednią ilość preparatu po immobilizacji zawierającego 5 mg unieruchomionego białka. Reakcję prowadzono przez 120 s w kuwecie kwarcowej w temperaturze 30 °C, mieszając z szybkością 1000 obr/min, stale rejestrując zmiany absorbancji przy długości fali λ=410 nm. Pomiary prowadzono w termostatowanej komorze spektrofotometru Jasco UV 750 (Jasco, Japonia). Dla każdej z analizowanych próbek pomiary wykonano trzykrotnie w celu minimalizacji błędów. Stężenie uwolnionego para-nitrofenolu zostało określone z wykorzystaniem standardowej krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla roztworów p-NP o stałym stężeniu. Zachowaną aktywność katalityczną preparatów (AR) obliczono w oparciu o równanie 3: = · 100% (3) gdzie: AI charakteryzuje aktywność unieruchomionego enzymu, A0 to aktywność białka w formie wolnej. 7.2. Stabilność preparatów po immobilizacji W ramach zrealizowanych badań zdefiniowano wpływ pH, temperatury, ilości cykli reakcyjnych oraz czasu magazynowania na aktywność wolnego enzymu oraz preparatów po immobilizacji lipazy. W tym celu wykorzystano modelową reakcję hydrolizy p-NPP do p-NP, a do badań wybrano preparaty odznaczające się zachowaniem najwyższej aktywności katalitycznej. W każdym z przypadków pomiary spektrofotometryczne realizowano przy długości fali λ=410 nm, a wszystkie analizy wykonano w trzech powtórzeniach. Wpływ pH analizowano w szerokim zakresie pH od 3 do 11. Pomiary wykonano po inkubacji wybranego preparatu po immobilizacji przez 2 h, w roztworze buforowym o zdefiniowanym pH. Stabilność termiczną wolnych oraz unieruchomionych enzymów badano w zakresie temperatur 20–80 °C. Pomiary realizowano w termostatowanej komorze spektrofotometru Jasco UV 750. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 92 - Przed przystąpieniem do pomiarów, w przypadku każdej z analiz, odczekano 5 min po ustabilizowaniu się temperatury. Zmiany aktywności katalitycznej, a więc możliwość ponownego wykorzystania preparatów po immobilizacji określono na podstawie 15 lub 20 następujących po sobie cykli reakcyjnych. Po każdej z reakcji matrycę z unieruchomionym białkiem oddzielono od mieszaniny reakcyjnej poprzez odwirowanie i przemycie buforem fosforanowym. Dla każdego z otrzymanych systemów biokatalitycznych pomiary realizowano w pH i temperaturze, w których wykazują maksymalną aktywność katalityczną. Wpływ czasu magazynowania na aktywność wolnych oraz unieruchomionych białek katalitycznych analizowano na przestrzeni 20 dni. Enzym w formie natywnej oraz immobilizowanej przechowywano w temperaturze 4 oraz 20 °C, co dwa dni badając zachowaną aktywność katalityczną. 7.3. Parametry kinetyczne preparatów po immobilizacji Parametry kinetyczne, stałą Michaelisa-Menten (Km) oraz maksymalną szybkość reakcji (Vmax) [358] wolnych oraz unieruchomionych enzymów określono w oparciu o modelową reakcję hydrolizy palmitynianu para-nitrofenylu. W trakcie obliczeń wykorzystano wzory i zależności opracowane przez Lineweavera i Burka (równanie 4 oraz 5) [359]: = !"[$] &[$] (4) ' = !" · [$] + !" (5) gdzie: [S] jest stężeniem substratu [M], V oraz Vmax to odpowiednio początkowa oraz maksymalna szybkość reakcji [U], natomiast Km to stała Michaelisa-Menten [M]. Parametry kinetyczne charakteryzują enzym oraz określają jego powinowactwo do substratu, a także opisują powstające opory dyfuzyjne w transporcie substratów do centrum aktywnego enzymu. 7.4. Reakcja transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem W ramach niniejszej pracy doktorskiej podjęto także próbę praktycznego wykorzystania wytworzonych systemów biokatalitycznych w procesach transestryfikacji oleju rzepakowego z metanolem, które umożliwiają produkcję estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) – głównego składnika biodegradowalnego i nietoksycznego paliwa, jakim jest biodiesel. Ogólny schemat metanolizy trójglicerydów zawartych w olejach roślinnych katalizowanej przez lipazy został przedstawiony na rys. 25. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 95 - WYNIKI BADAŃ I ICH ANALIZA 8. Immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae na powierzchni hydroksyapatytu Pierwszym etapem prac realizowanych w ramach przedkładanej dysertacji była immobilizacja proteazy z Aspergillus oryzae (PRT) na powierzchni hydroksyapatytu (HA), otrzymanego syntetycznie nośnika pochodzenia nieorganicznego. Wykazywane właściwości, jak i biozgodność oraz brak negatywnego wpływu na białka, powodują, że jest to interesujący materiał pod kątem jego wykorzystania w immobilizacji biokatalizatorów. W toku zrealizowanych badań, potwierdzono skuteczne unieruchomienie enzymu, jak i zdefiniowano wpływ poszczególnych parametrów procesu, takich jak czas oraz wyjściowe stężenie roztworu białka na efektywność immobilizacji oraz ilość unieruchomionego białka [360]. Do tego celu zdecydowano się wykorzystać analizę spektroskopową i elementarną. Ponadto zdefiniowano parametry struktury porowatej, a ilość unieruchomionej proteazy oraz wydajność procesu obliczono bazując na wynikach pomiarów spektrofotometrycznych. 8.1. Analiza FTIR – charakterystyka grup funkcyjnych W celu potwierdzenia efektywnego osadzenia proteazy na powierzchni nieorganicznej matrycy wykonano analizę FTIR produktów po 24-godzinnej immobilizacji z wykorzystaniem wyjściowych roztworów białka o różnym stężeniu. Otrzymane widma porównano z widmem zsyntezowanego hydroksyapatytu (rys. 26a). Najbardziej istotny zakres widma (pomiędzy 1700 a 1200 cm-1) został powiększony i zamieszczony na rys. 26b. Rys. 26. Widma FTIR: a) hydroksyapatytu oraz układów po immobilizacji prowadzonej przez 24 h z roztworów enzymu o stężeniu 3, 5 oraz 7 mg/ml oraz b) widma FTIR analizowanych układów w zakresie liczby falowej 1700–1200 cm-1 Liczba falowa [cm-1] 4000 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 3500 3000 2500 2000 1500 1000 0 500 0,9 0,9 0,9 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1600 1600 1600 1600 1600 Liczba falowa [cm-1] Liczba falowa [cm-1] Hydroksyapatyt (HA) HA + PRT 3 mg/ml HA + PRT 5 mg/ml HA + PRT 7 mg/ml a) b) In te n sy w n o ść [ j.w .] In te n sy w n o ść [ j.w .] IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 96 - Na widmie zsyntezowanego hydroksyapatytu widoczny jest wyraźny sygnał w zakresie liczby falowej 3550–3200 cm-1, który generowany jest przez drgania rozciągające grup hydroksylowych, natomiast sygnał z maksimum przy 1630 cm-1 związany jest z obecnością wody fizycznie zaadsorbowanej na powierzchni analizowanego materiału. Wyniki analizy FTIR wykazują także obecność pasm przy liczbach falowych: 1200, 1050 oraz 600 cm-1, które są charakterystyczne dla hydroksyapatytu i są następstwem występowania w jego strukturze drgań rozciągających grup fosforanowych PO4 3-. Podobnie, sygnał z maksimum przy 800 cm-1, przypisany jest do drgań jonów wodorofosforanowych (HPO4 2-) [361]. Na widmach FTIR układów po immobilizacji widoczne są dodatkowe pasma, których brak jest na widmie nośnika hydroksyapatytowego, a ich obecność jest pośrednim dowodem potwierdzającym skuteczne unieruchomienie białka katalitycznego. Są to pasma występujące przy liczbie falowej ok. 2900 cm-1, będące efektem obecności grup metylowych oraz metylenowych (–CH3 oraz –CH2) w strukturze enzymu. Sygnały potwierdzające immobilizację enzymu widoczne są także w zakresie 1700–1200 cm-1. Wśród nich warto odnotować pasmo z maksimum ok. 1650 cm-1, które pochodzi od drgań rozciągających wiązań C=C oraz pik przy 1400 cm-1, związany z obecnością wiązań –C–N w strukturze białka [362,363]. Widma FTIR układów po immobilizacji charakteryzują się również obecnością sygnałów przy liczbie falowej 700 oraz 490 cm-1, które pochodzą od drgań zginających oraz pozapłaszczyznowych wiązań węgiel-wodór budujących szkielet enzymu [364]. Warty odnotowania jest również fakt, że w przypadku widm produktów po immobilizacji zauważalny jest wzrost intensywności pasm, a także nieznaczne przesunięcia maksimów sygnałów w zakresie 1200–1000 cm-1, w porównaniu z widmem samego nośnika. Fakt ten tłumaczony jest obecnością w strukturze białka enzymatycznego wiązań –C–O oraz –C–O–C–, których maksima znajdują się odpowiednio przy ok. 1150 oraz 1050 cm-1. Podobne obserwacje dotyczą zwiększenia intensywności sygnału powyżej 3000 cm-1, związanego z obecnością grup hydroksylowych w białku oraz nośniku. Obecność opisanych wyżej sygnałów, a także wzrost ich intensywności, jak i przesunięcia maksimów absorpcji to dowody dodatkowo potwierdzające skuteczne unieruchomienie proteazy na powierzchni hydroksyapatytu. 8.2. Analiza elementarna – ocena składu pierwiastkowego analizowanych materiałów W celu potwierdzenia efektywnego osadzenia enzymu wykonano także analizę elementarną. Określono zmiany zawartości takich pierwiastków jak węgiel, azot oraz wodór w próbkach po immobilizacji, w porównaniu ze składem elementarnym hydroksyapatytu. Zmiany te są następstwem różnego czasu prowadzenia procesu, jak i zmiennych stężeń początkowych roztworów białka. Rezultaty otrzymane dla wybranych próbek, zaprezentowano w tabeli 6. Otrzymany w pierwszym etapie prac hydroksyapatyt charakteryzuje się zawartością węgla oraz wodoru na poziomie odpowiednio 0,22 oraz 1,07%, a także brakiem azotu w składzie pierwiastkowym. IMMOBILIZACJA ENZYMÓW NA WYBRANYCH NOŚNIKACH ORGANICZNYCH I NIEORGANICZNYCH - 97 - Zastosowana proteaza odznacza się natomiast zawartością w składzie pierwiastkowym 9,87% azotu, 38,45% węgla oraz 6,24% wodoru. Uzyskane rezultaty badań wykazały przyrost zawartości wszystkich analizowanych pierwiastków w układach po immobilizacji oraz obecność azotu. Zwiększenie procentowego udziału tych składników jest dowodem potwierdzającym skuteczną immobilizację enzymu ponieważ zarówno węgiel, azot, jak i wodór są podstawowymi pierwiastkami tworzącymi strukturę białkową proteazy [365]. Tabela 6. Wyniki analizy elementarnej zsyntezowanego hydroksyapatytu, proteazy z Aspergillu oryzae oraz wybranych układów powstałych po immobilizacji Stężenie roztworu enzymu [mg/ml] Czas immobilizacji [h] Zawartość [%] N C H Hydroksyapatyt – 0,22 1,07 Proteaza z Aspergillu oryzae 9,87 38,45 6,24 3 1 0,10 0,32 1,13 24 0,11 0,33 1,14 96 0,11 0,34 1,14 5 1 0,10 0,37 1,14 24 0,12 0,38 1,15 96 0,12 0,39 1,15 7 1 0,12 0,41 1,16 24 0,13 0,44 1,19 96 0,13 0,44 1,19 Uzyskane rezultaty udowadniają nie tylko efektywne unieruchomienie proteazy, ale wskazują również, że czas immobilizacji oraz początkowe stężenie roztworu enzymu mają wpływ na ilość osadzonego białka katalitycznego. Najbardziej wyraźny wzrost procentowej zawartości wszystkich analizowanych pierwiastków został odnotowany w przypadku immobilizacji prowadzonej przez 96 h z roztworu enzymu o stężeniu 7 mg/ml. Zbliżone rezultaty analizy elementarnej uzyskano także dla układów powstałych po 24 h prowadzenia procesu, co może wskazywać, że w przypadku tych układów (powstałych po 24 oraz 96 h prowadzenie procesu), unieruchomieniu uległa największa ilość proteazy. 8.3. Analiza parametrów struktury porowatej W kolejnym etapie badań zdefiniowano parametry struktury porowatej hydroksyapatytu oraz produktów po immobilizacji, w celu określenia wpływu czasu trwania procesu immobilizacji i początkowego stężenia roztworu białka na wielkość powierzchni właściwej, średnią średnicę porów, jak i ich całkowitą objętość. Uzyskane rezultaty przeprowadzonych analiz przedstawiono w tabeli 7.