Ćwiczenie nr 3
Gdańsk, 2008
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KOFEINY
Analiza żywności
UNIWERSYTET GDAŃ
SKI
WYDZIAŁ CHEMII
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Oznaczanie Zawartości Kofeiny: Ćwiczenie Laboratoryjne z Analizy Żywności, Ćwiczenia z Chemia
Kofeina znajduje się również w liściach herbaty (teina). Źródłami kofeiny są rośliny z rodziny Marzanowatych. (Rubiaceceae), miedzy innymi przedstawiciel flory ...
Typologia: Ćwiczenia
2022/2023
1 / 20
Pobierz cały dokument
poprzez zakup abonamentu Premium
i zdobądź brakujące punkty w ciągu 48 godzin
Dokumenty powiązane
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz Oznaczanie Zawartości Kofeiny: Ćwiczenie Laboratoryjne z Analizy Żywności i więcej Ćwiczenia w PDF z Chemia tylko na Docsity!
Ćwiczenie nr 3
Gdańsk, 2008
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KOFEINY
Analiza żywności
UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII
Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
Pracownia studencka
Katedry Analizy Środowiska
I. Część teoretyczna
1. Niebiałkowe związki azotowe
1.1. Wprowadzenie Niebiałkowymi związkami azotowymi są wolne aminokwasy i peptydy, kwasy nukleinowe, nukleotydy i produkty ich metabolizmu, tlenek trietyloaminy i mocznik oraz powstające z nich lotne aminy i amoniak, a także glukozydy i heterozydy cyjanogenne, alkaloidy oraz tiazole, oksazole, pirole i pirazyny. Duży udział w ogólnej ilości związków azotu mają składniki niebiałkowe w mięsie, rybach i bezkręgowcach morskich (od ok. 15% do 55% w przeliczeniu na azot). Mięśnie czerwone są z reguły znacznie bogatsze w azot niebiałkowy od mięśni białych. Niebiałkowe związki azotowe mięsa ryb wielu gatunków składają się przede wszystkim z kreatyny, wolnych aminokwasów białkowych, tlenku trimetyloaminy, nukleotydów i peptydów. W warzywach azot związków niebiałkowych stanowi 20-60% ogólnej ilości azotu. Niebiałkowe związki azotowe i powstające z ich rozkładu bezazotowe lotne produkty kształtują zapach i smak żywności, a niektóre z nich mogą być szkodliwe dla zdrowia człowieka.
1.2. Wolne aminokwasy i peptydy 1.2.1. Właściwości Aminokwasy są na ogół dobrze rozpuszczalne w wodzie. Dużą rozpuszczalnością wyróżnia się prolina, hydroksyprolina, glicyna i alanina, natomiast słabo rozpuszczalne są cystyna i tyrozyna. Rozpuszczalność aminokwasów w wodzie podano w tabeli 1.
Tabela 1. Rozpuszczalność aminokwasów w wodzie Aminokwas Rozpuszczalność [g/100g] prolina 162 hydroksyprolina 36 glicyna 25 alanina 17 walina 8, seryna 5, histydyna 4, izoleucyna 4, metionina 3, fenyloalanina 3, leucyna 2,
ryb zawartość wolnych aminokwasów zmienia się bardzo istotnie wskutek dojrzewania po uboju lub śnięciu. Na jakość produktów rybnych duży wpływ ma wolna histydyna, łatwo ulegająca dalszym przemianom. Na ogół białe mięso ryb zawiera niewiele związków imidazolowych (do ok. 7% azotu niebiałkowego, a mięso ciemne 30-80%). Zawartość histydyny w ciemnym mięsie ryb makrelowatych może wynosić nawet 2 g/100 g. W mięsie skorupiaków wśród wolnych aminokwasów jest najwięcej glicyny, argininy, proliny, alaniny, seryny i tauryny. Taurynę wykryto również w mięsie węgorza, dorsza i sepii w ilościach 0,03-0,3 g/100 g. Stanowi ona ok. 17% wolnych aminokwasów mięsa fok. Szczególnie bogate w taurynę są organy wewnętrzne i ciemne mięśnie ryb oraz bezkręgowców morskich. Tauryna spełnia w żywych organizmach funkcje osmoregulacyjne oraz uczestniczy w procesach regulacji metabolizmu mięśni i centralnego układu nerwowego. W bulwach ziemniaka azot niebiałkowy stanowi ok. 50% ogólnej ilości azotu. Około 50% ogólnej ilości wolnych aminokwasów w bulwach to kwas asparaginowy, kwas glutaminowy i walina. Utlenianie wolnej tyrozyny pod wpływem oksydazy polifenolowej powoduje ciemne przebarwienia bulw ziemniaków. Wśród wolnych aminokwasów warzyw i owoców jest kilkadziesiąt aminokwasów niebiałkowych. Miód w 100g suchej substancji zawiera ok. 0,12 g wolnych aminokwasów, w tym 50-85% stanowi prolina. W zielonej herbacie jest ok. 4,8%, a w czarnej ok. 1,6% wolnych aminokwasów w suchej substancji. W wielu artykułach roślinnych i zwierzęcych występują trimetylowe pochodne aminokwasów znane pod wspólną nazwą betain.
1.2.4. Wolne aminokwasy - zmiany podczas przechowywania i przetwarzania Pod wpływem endogennych enzymów, obróbki w procesach technologicznych oraz działania mikroflory zachodzą w żywności pożądane i niekorzystne przemiany wolnych aminokwasów i peptydów. Znane są reakcje syntezy, deaminacji aminokwasów i eliminacji amoniaku. Przykładowe reakcje:
amoniakoliaza
uwalnianie amoniaku z amidów
deaminacja przez odwodornienie lub przy udziale tlenu
bakteryjny rozkład tryptofanu
1.3.3. Histamina i alifatyczne poliaminy W wielu artykułach żywnościowych, przede wszystkim wytwarzanych i dojrzewających przy udziale procesów fermentacyjnych, a także nieświeżych lub silnie zanieczyszczonych mikrobiologicznie, występują histamina, putrescyna, kadaweryna, spermidyna i tyramina. Putrescyna i spermidyna są powszechne w komórkach roślinnych, w których pełnią funkcje regulacyjne w okresach wzrostu i dojrzewania. Prekursorami tych
amin są aminokwasy uwalniane z białek wskutek hydrolizy. W surowcach rybnych największe znaczenie ma histamina. Nagromadza się ona przede wszystkim w mięśniach bogatych w histydynę w postaci wolnej lub związanej w białkach. Główną przyczyną powstawania histaminy w śniętych rybach jest działanie enzymów bakteryjnych. Z ryb morskich wyizolowano drobnoustroje kilkunastu gatunków dekarboksylujące histydynę. Szybkość wytwarzania histaminy zależy od stężenia wolnej histydyny w mięśniach, od właściwości i liczebności populacji bakterii, od obecności aktywatorów i inhibitorów dekarboksylaz histydyny i od temperatury.
1.3.4. N-nitrozoaminy W żywności mogą powstawać w reakcji amin z azotanami(III) toksyczne związki N - nitrozowe. Wśród zbadanych ok. 300 takich związków ok 90% przejawia działanie rakotwórcze. Najsilniejsze działanie rakotwórcze wywiera N -nitrozodimetyloamina. Nitrozowaniu w reakcji z azotanami(III) ulegają drugorzędowe i trzeciorzędowe aminy oraz amidy. Szybkość nitrozowania jest największa przy pH 2-4, ponieważ ze wzrostem pH wprawdzie zwiększa się udział niezdysocjowanych amin, lecz jednocześnie maleje stężenie czynników nitrozujących. W kwaśnym środowisku powstaje z azotanu(III) słaby, nietrwały HNO 2 , a z niego bezwodnik N 2 O 3.
Czynnikami nitrozującymi są bezwodnik N 2 O 3 , bezwodnik protonowany i kation nitrozoniowy
oraz halogenki nitrozylu O=N-X i tiocyjanian nitrozoniowy O=N-NCS. Elektrofilowe odczynniki nitrozujące tworzą z aminami drugorzędowymi N -nitrozoaminy w reakcji:
Niektóre aromatyczne aminy trzeciorzędowe ulegają powolnemu nitrozowaniu w pierścieniu aromatycznym, a alifatyczne podlegają reakcji utleniającego dealkilowania.
cząsteczkowego. Związany w postaci amoniaku azot jest w glebie przekształcany do azotanów(III) przy udziale bakterii Nitrosomonas , a azotany(III) do azotanów(V) przy udziale bakterii Nitrobacter. Azotany(V) stanowią przyswajalne źródło azotu dla roślin.
1.4.1. Azotany w produktach spożywczych Stosowanie nawozów naturalnych i sztucznych oraz spalanie paliw, powoduje zwiększenie ilości związanego azotu w przyrodzie. Nadmiar azotanów w glebie powoduje, że rośliny magazynują większą ich ilość niż potrzebują do wzrostu. Zawartość azotanów(V) w roślinach zależy przede wszystkim od właściwości gleby, intensywności nawożenia, gatunku rośliny, czasu wegetacji i warunków klimatycznych. Azotany(III) występują w niewielkich ilościach w materiale roślinnym, jednak na skutek ograniczenia dostępu tlenu może dojść do mikrobiologicznej redukcji azotanów(V) do azotanów(III).
1.4.2. Działanie toksyczne azotanów Azotany(V) są związkami o niewielkiej toksyczności, w przeciwieństwie do produktów ich przemiany – azotanów(III), nie stanowią bezpośredniego zagrożenia dla zdrowia. Azotany(V) są szybko wchłaniane z przewodu pokarmowego, częściowo ulegają redukcji, a następnie są wydalane z organizmu. Pewna ilość azotanów(III) jest wytwarzana w organizmie człowieka z azotanów(V) przy udziale mikroflory jamy ustnej, żołądka i jelit. Azotany(III) są zdolne do tworzenia nitrozo amin, trwałych związków o silnym działaniu kancerogennym. Należy jednak zaznaczyć, że nie stwierdzono rakotwórczego działania azotanów(III) i azotanów(V). Ustalone przez FAO/WHO wartości dawek dziennego pobrania, które przy codziennym spożyciu nie powodują ryzyka dla zdrowia człowieka, dla azotanów(V) wynoszą 5 mg/kg masy ciała, a dla azotanów(III) – 0,2 mg/kg. Stosowanie azotanów jako dodatków do żywności również zostało prawnie uregulowane. Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 17 marca 2003 (Dz. U. nr 87/2003, poz. 72) dopuszczalne jest stosowanie azotanu(III) sodu i potasu oraz azotanu(V) sodu i potasu jako środków konserwujących do przetworów mięsnych peklowanych i konserw mięsnych w puszkach. W tabeli 3 podano najwyższe dopuszczalne zanieczyszczenia azotanami warzyw.
Tabela 3. Najwyższe dopuszczalne zanieczyszczenia azotanami warzyw. Produkt mg NO 3 - /kg świeżego produktu Sałata świeża gruntowa i szklarniowa zbierana od 1 października do 31 marca
Sałata świeża gruntowa i szklarniowa zbierana od 1 kwietnia do 30 września
Szpinak świeży zbierany od 1 listopada do 31 marca
Szpinak świeży zbierany od 1 kwietnia do 31 października
Rzodkiewka, burak, rzepa, kalarepa, koper 1500 Kapusta, szczypior, fasolka szparagowa 750 Marchew, pietruszka, ogórek, kalafior, por, seler, brokuły
Pomidor, ziemniak, cebula papryka 200
1.4.3. Metody oznaczania zawartości azotanów(III) i azotanów(V) 1.4.3.1. Metoda enzymatyczna Metoda enzymatyczna służy do oznaczania azotanów(V), a jej zasada opiera się na redukcji azotanów(V) do azotanów(III) przez reduktazę azotanową, enzym wytwarzany przez bakterie zgodnie ze schematem: NO 3 -^ + NADPH 2 →NO 2 -^ + H 2 O +NADP Reakcja zachodzi w obecności NADPH 2 (zredukowana forma fosforanu nikotynamidoadeninowego). Związek ten utlenia się w ilości odpowiadającej zawartości azotanów(V), które uległy redukcji. Obniżenie stężenia NADPH 2 w układzie reakcyjnym jest mierzone spektrofotometrycznie.
1.4.3.2. Metody chromatograficzne Do oznaczania azotanów(III) i (V) zastosowanie znalazła wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) z użyciem detektora UV, a także chromatografia gazowa z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) lub detektorem wychwytu elektronów (ECD) do oznaczania azotanów(III).
2NH 3 + 2HCl 2NH 4 Cl Z reakcji tych wynika, że 1 mol H 2 SO 4 = 2 mole N = 28 g N 1 mol HCl = 1 mole N = 14 g N stąd: 1 cm^3 H 2 SO 4 (o stężeniu 0,1 mol/dm^3 ) = 0,0028 g N 1 cm^3 HCl (o stężeniu 0,1 mol/dm^3 ) = 0,0014 g N Do przeliczenia azotu na białko stosuje się mnożniki wyliczone z przeciętnej zawartości azotu w białkach, która wynosi 16% (100:16 = 6,25). Niektóre jednak białka mają większą lub mniejszą zawartość azotu, stąd należy stosować inne mnożniki. W tabeli 5 podano średnią zawartość azotu i odpowiadające im mnożniki dla niektórych białek.
Tabela 5. Średnia zawartość azotu i mnożniki do przeliczenia azotu na białko Badany materiał Średnia zawartość N w białku (x) Mnożnik dla białka (100x) Żółtko jaj 14,97 6, Mleko i produkty mleczarskie 15,66 6, Mięso 16,00 6, Zboża 16,54 5, Produkty mieszane 16,00 6,
Pozostała pula azotu pochodzi od niebiałkowych związków azotowych.
3. Kofeina
3.1. Budowa oraz właściwości fizyczne kofeiny
Kofeina (3,7-dihydro-1,3,7-trimetylo-1H-puryno-2,6-dion) znana również pod nazwą 1,3,7-trimetyloksantyna jest związkiem chemicznym o masie molowej 194,19 g/mol. W stanie czystym tworzy białe, długie, giętkie kryształy o temperaturze topnienia 237°C i o gęstości 1,2 g/cm³. Rozpuszcza się w gorącej wodzie, chloroformie i benzenie. Jest gorzka w
smaku. W budowie jest zbliżona do dwóch innych alkaloidów purynowych: teobrominy i teofiliny. Kofeina zbudowana jest z dwóch pierścieni: pierwszym sześciowęglowym, drugim natomiast pieciowęglowym, w których po dwa atomy węgla zastąpione zostały atomami azotu. Każdy atom azotu w pierścieniu sześciowęglowym połączony jest wiązaniem pojedynczym z grupą metylową –CH 3 , pozostałe wolne atomy węgla połączone są wiązaniem podwójnym z atomem tlenu. W drugim pierścieniu natomiast tylko jeden z atomów azotu połączony jest wiązaniem pojedynczym z grupą metylową – CH 3. Kofeina jest alkaloidem czyli związkiem organicznym pochodzenia roślinnego, zawierającym układ cykliczny z atomami azotu w pierścieniu. Alkaloidy wykazują silne działanie fizjologiczne na organizm człowieka, niejednokrotnie toksyczne. Do alkaloidów zaliczamy również związki takie jak:
morfina
(5α,6α)-7,8-didehydro-4,5-epoksy-17-metylmorfinan-3,6-diol) kodeina
(5 R ,6 S ,9 R ,13 S ,14 R )-3-metoksy-17-metylo-4,5-epoksymorfin-7-en-6-ol) (3-metylomorfina)
chinowiec (Cinchona ) , oraz rodziny Theace i Sterauliaceae. Znaczne ilości kofeiny znaleźć możemy również w guaranie ( Pasta Guarana), liściach mate ( Herba mate ) oraz w nasionach kawowca ( Theabroma caco L.).
3.4. Działanie kofeiny Kofeina do krwi dostaje się z przewodu pokarmowego. Jest wchłaniana już po około 30 - 45 minutach po jej spożyciu. Czas utrzymywania się jej we krwi to w przybliżeniu 4 godziny. W zależności od organizmu może się on wahać od 2 do 10 godzin. Kofeina jest stymulatorem centralnego układu nerwowego, łatwo przenika z krwi do mózgu, a tam ze względu na swoje znaczne podobieństwo w budowie do adenozyny wiąże się z receptorami adenozynowymi i blokuje je. Adenozyna jest substancją naturalnie występującą w organizmie człowieka, która pośredniczy w aktywności mózgu, wpływając na stan snu i czuwania. W konsekwencji podnosi się aktywność dopaminy. Dopamina jest to neuroprzekaźnik, który odpowiada ze większość efektów kawy takich jak poprawę koncentracji, zmniejszenie uczucia senności. Blokowanie receptorów adenozynowych może również wpłynąć na kurczeni się naczyń krwionośnych, co oddziałuje na napięcie naczyń znajdujących się w mózgu, a tym samym zmniejszyć objawy migreny oraz bólów głowy innego pochodzenia. Te właściwości kofeiny wykorzystane zostały przez producentów leków, którzy stosują ja jako istotny składnik leków przeciwbólowych. Spożywanie kofeiny może spowodować ogólne polepszenie koordynacji organizmu oraz poprawienie koncentracji. Jednakże zbyt duża dawka kofeiny może mieć negatywny wpływ na funkcjonowanie organizmu powodując uczucie zmęczenia lub zaburzenia koordynacji ruchowej. Dawki powyżej 2000 mg mogą również powodować bezsenność, drżenie mięśni lub przyśpieszenie oddechu. Częste picie napojów, których składnikiem jest kofeina może także przyczynić się do podniesienia się ciśnienia tętniczego krwi, a tym samym przyśpieszenia bicia serca, gdyż powoduje ona uwalniania się kortyzolu i adrenaliny, które są odpowiedzialne za występowanie takich efektów. Kofeina również posiada właściwości moczopędne, powoduje zwiększenie wydzielania kwasu żołądkowego oraz prowadzi do przyśpieszenia metabolizmu.
II. Część doświadczalna
1. Zasada metody
Ćwiczenie polega na wyodrębnieniu i oznaczeniu kofeiny z próbki czerwonej herbaty z wykorzystaniem metody HPLC z detektorem UV.
2. Odczynniki, sprzęt i aparatura
o zlewki 250 ml, o kolby 250 ml, o zestaw HPLC, o waga, o pipety, o buteleczki zakręcane 2 ml, o strzykawka do HPLC, o kolumienka SPE.
3. Wykonanie oznaczenia zawartości kofeiny w kawie metodą HPLC
3.1. Przygotowanie roztworów o woda amoniakalna (0,3 mol/l) / metanol , 90+10 mieszanina objętościowa 11 ml (2 ml 25%NH 3 x H 2 O + 8ml H 2 O + 1ml MeOH),
o rozpuszczalnik wymywający do kolumny oczyszczającej metanol/woda/kwas octowy 75:25:1, mieszanina objętościowa 10.1ml (7,5ml MeOH + 2.5 ml H 2 O +0.1ml CH 3 COOH), o faza ruchoma metanol/woda 30:70, mieszanina objętościowa, o etanol/woda 1:4 mieszanina objętościowa – do sporządzenia roztworów wzorcowych.
3.2. Sporządzanie roztworów wzorcowych o kofeina roztwór podstawowy odważyć 1mg czystej kofeiny i rozpuścić w 20 ml mieszaniny etanol/woda (w proporcjach 1:4 (0,4 ml MeOH +1,6 ml H 2 O) uzyskuje się 2 ml roztworu podstawowego o stężeniu kofeiny 0,05g/l,
o poczekać aż rozpuszczalnik całkowicie spłynie z kolumny do kolby ( zbieranie głównej frakcji) , o dopełnić kolbę do 10 ml wodą destylowaną.
3.8. Regeneracja kolumny Kolumnę zregenerować metanolem i wodą, przepuszczając kolejno: o 5 ml MeOH, o 5ml H 2 O.
3.9. Analiza HPLC Wykonać analizę HPLC otrzymanych próbek oraz roztworów wzorcowych. Warunki pracy HPLC: o kolumna HPLC C 18 , o przepływ fazy ruchomej 1 ml/min, o długość fali λ = 272 nm, o faza ruchoma metanol/woda 30:70, mieszanina objętościowa.
3.10. Opracowanie wyników Obliczyć zawartość kofeiny w próbce, wyrażoną w gramach na 100 g suchej masy:
Ax – pole piku kofeiny otrzymanego dla roztworu badanego, Ac - pole piku kofeiny otrzymanego dla roztworu wzorcowego, c 1 – stężenie roztworu wzorcowego [g/l], m 0 – masa próbki analitycznej [g], RS – ułamek masowy suchej masy w próbce.
3.11. Interpretacja wyników Wyciągnąć wnioski dotyczące: o procedury wyodrębniania kofeiny, o analizy HPLC, o metody krzywej kalibracyjnej,
o zawartości kofeiny.
III. Literatura
- Sikorski Zdzisław E.(red.), Chemia Żywności , wyd. 4, WNT, Warszawa, 2002.
- Klepacka Mirosława (red.), Analiza żywności , Fundacja Rozwój SGGW, Warszawa 2005.
- Małecka Maria (red.), Wybrane metody analizy żywności, Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej w Poznaniu, Poznań, 2003.
- Krełowska-Kułas Maria, Badanie jakości produktów spożywczych , PWE, Warszawa 1993.
- Wojcieszak Anna, Walidacja metody oznaczania kofeiny. Praca magisterska, 2008.