Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
róŜnymi odczynnikami stanowi podstawę wielu metod wyodrębniania ich z ... o metody chemiczne: metoda Fehlinga, metoda Lane-Eynona, metoda Bertranda, metoda.
Typologia: Egzaminy
1 / 27
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Gdańsk, 2008
Analiza Ŝ ywno ś ci
UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII
I. Cz ęść teoretyczna
1.1.1. Struktura sacharydów Sacharydy (inaczej cukry) są to polihydroksyaldehydy i polihydroksyketony oraz niektóre ich pochodne (aminosacharydy, deoksysacharydy, kwasy uronowe). Nazwa sacharydy wywodzi się od sacharozy, sacharydu powszechnie uŜywanego w celach spoŜywczych i zwanego potocznie cukrem. Tradycyjnym wzorem ogólnym cukrów jest CnH2nOn, choć wiele sacharydów tego wzoru nie spełnia. W literaturze cukry znane są teŜ pod nazwą węglowodanów, jednak ta nazwa nie jest zalecana, poniewaŜ wzór sumarycznych nie wszystkich cukrów odpowiada wielokrotności ugrupowania C(HOH). RozróŜniane są dwie podstawowe grupy cukrów: aldozy , będące homologami aldehydu glicerynowego oraz ketozy , które są homologami dihydroksyacetonu. CH=O CH 2 OH | | HC-OH HC=O | | CH 2 OH CH 2 OH Aldehyd D-glicerynowy Dihydroksyaceton
W zaleŜności od liczby atomów węgla w cząsteczce, cukry dzielą się na triozy ( atomy C) , tetrozy (4 atomy C), pentozy (5 atomów C), heksozy (6 atomów C), heptozy ( atomów C) i oktozy (8 atomów C), np:
D-glukoza D-fruktoza D-ksyloza aldoheksoza ketoheksoza aldopentoza Łatwo zauwaŜyć, Ŝe nazwa cukru składa się z liczebnika podającego liczbę atomów węgla i charakterystycznej dla cukrów końcówki – oza. Monosacharydy charakteryzują się obecnością w cząsteczce asymetrycznych atomów węgla (połączonych z 4 róŜnymi grupami chemicznymi), zwanych centrami stereogenicznymi. Obecność asymetrycznych atomów węgla stwarza moŜliwość występowania licznych izomerów optycznych i przestrzennych.
C (^) HO H C (^) OH C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
C C C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
H 2 OH O
C (^) HO H C (^) OH C C CH 2 OH
H H OH
HO
W przyrodzie sacharydy występują zarówno w postaci wolnej, jak i związanej z peptydami (proteoglikany), proteinami (glikoproteiny) oraz lipidami (glikolipidy). Z uwagi na znaczenie Ŝywieniowe bardziej szczegółowo zostanie opisana budowa skrobi. Składa się ona z jednostek glukozylowych połączonych wiązaniemi 1,4–α-glikozydowymi z tym, Ŝe łańcuchy zawierają takŜe pewną liczbę odgałęzień. W wyniku częściowej hydrolizy skrobi powstaje maltoza (disacharyd), hydroliza całkowita prowadzi wyłącznie do D-glukozy:
H 2 O/H+^ H 2 O/H+ [C 12 H 20 O 10 ]n → n C 12 H 22 O 11 → 2n C 6 H 12 O 6 skrobia maltoza glukoza Skrobię moŜna rozdzielić na dwie frakcje amylozę i amylopektynę. W amylozie, która stanowi ok. 20% skrobi, cząsteczki glukozy (50-300) budują łańcuch prosty (nierozgałęziony), łącząc się wiązaniami 1,4. Długie, proste łańcuchy amylozy są zwinięte spiralnie, przyjmując postać helisy.
Amylopektyna, stanowiąca ok. 80% skrobi jest mocno rozgałęziona. Mimo, Ŝe kaŜda cząsteczka moŜe zawierać aŜ 300-5000 jednostek glukozowych, odcinki łańcucha, w którym wyłącznie występują wiązania 1,4 zawierają średnio tylko 25-30 takich jednostek. Łańcuchy te połączone są w punktach rozgałęzień wiązaniami 1,6.
O OH O
CH 2 OH HOO
HO
O OH O
CH 2 OH
O OH O
CH 2 OH
O OH O
CH 2 OH HO
HO amyloza
HO
O OH O
OH O CH 2 OH
O CH^2 OH
OH (^) O CH (^2) O HO
HO O
O HO OH O
CH 2 OH HOO CH 2 OHO
O OH O
HO O OH
CH 2 OH
amylopektyna
Amyloza i amylopektyna wykazują nieco inne właściwości fizyczne; amyloza rozpuszcza się w wodzie, amylopektyna jest w niej nierozpuszczalna. Wspólnie tworzą ziarenka (granulki) skrobi, które moŜna zobaczyć za pomocą mikroskopu i które są charakterystyczne dla roślin, z których pochodzą.
Granulki skrobi składają się z dwóch warstw: zewnętrznej - amylopektyny oraz wewnętrznej – amylozy. Z powodu mocno rozgałęzionej budowy, ziarna skrobi w zimnej wodzie pęcznieją, po ogrzaniu tworzą roztwór koloidalny, tzw. kleik skrobiowy, który po ochłodzeniu ulega koagulacji.
1.1.2. Wła ś ciwo ś ci fizykochemiczne sacharydów 1.1.2.1. Wła ś ciwo ś ci fizyczne sacharydów Monosacharydy i oligosacharydy są słodkie, rozpuszczalne w wodzie, łatwo krystalizują i mają określoną masę cząsteczkową. W przeciwieństwie do nich polisacharydy nie mają smaku słodkiego, są mniej lub wcale nierozpuszczalne w wodzie i są zróŜnicowane pod względem masy cząsteczkowej. Wszystkie cukry są nielotne i rozpadają się przed osiągnięciem temperatury wrzenia. Krystalizują z roztworów opornie (wyjątkiem jest sacharoza) i mają tendencję do tworzenia gęstych, syropowatych cieczy, zwłaszcza jeśli nie są czyste. Monosacharydy zawierają asymetryczne atomy węgla i dlatego są związkami optycznie czynnymi; wodne roztwory sacharydów wykazują zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego.
1.1.2.2. Wła ś ciwo ś ci chemiczne sacharydów Przy omawianiu właściwości chemicznych cukrów naleŜy uwzględniać zarówno ich budowę pierścieniową jak i łańcuchową. Tworzenie pierścieni heterocyklicznych jest wynikiem wewnątrzcząsteczkowej addycji grupy hydroksylowej do grupy aldehydowej lub ketonowej z utworzeniem wiązania półacetalowego (hemiacetalowego). Z powodu płaskiej budowy grupy aldehydowej i ketonowej tworzenie wiązania półacetalowego prowadzi do
mono-, di- i oligosacharydami lub alkoholami sacharydowymi prowadzi do otrzymania związków powierzchniowo czynnych, istotnych w produkcji Ŝywności; eteryfikacja ; chlorowcowanie ; dehydratacja – ogrzewanie monosacharydów powyŜej temperatury topnienia prowadzi początkowo do odwracalnego wydzielenia cząsteczki wody, a następnie do powstania bardziej odwodnionych produktów: karamelanu (C 12 H 12 O 9 ), karamelenu (C 36 H 18 O 24 ) i karamelinu (C 24 H 26 O 13 ). Reakcje te rozpoczynają karmelizację sacharydów; redukcja – prowadząca do otrzymania deoksycukrów; utlenianie ; tworzenie kompleksów - zdolność tworzenia kompleksów sacharydów z róŜnymi odczynnikami stanowi podstawę wielu metod wyodrębniania ich z mieszanin i oznaczania jakościowego i ilościowego (np. roztwór jodu w KJ słuŜy do wykrywania skrobi, gdyŜ tworzy ze skrobią charakterystyczny, ciemnogranatowy kompleks). o reakcje wi ą zania glikozydowego – dotyczą di- i oligosacharydów; wiązanie glikozydowe ulega hydrolitycznemu rozszczepieniu w wobec katalizatorów kwasowych, np. z sacharozy produkuje się na skalę przemysłową cukier inwertowany, który jest mieszaniną D-glukozy i D-fruktozy. Przemiany cukrów w ś rodowisku zasadowym. W środowisku zasadowym cukry redukujące ulegają enolizacji. Jako produkt przejściowy tworzy się bardzo nietrwały enol, i przekształca się w trzy epimery będące w stanie równowagi np. glukoza pozostaje w równowadze z mannozą i fruktozą i innymi produktami tych przemian.
C (^) HO H C (^) OH C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
C C C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
H 2 OH O
CHOH C (^) OH C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO C (^) HO C C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
HO H
Przemiany cukrów w ś rodowisku st ęŜ onych kwasów. Cukry o liczbie atomów węgla większej od 4 w cząsteczce, ogrzewane z mocnymi kwasami, ulegają odwodnieniu i cyklizacji. Z pentoz powstaje furfural, natomiast z heksoz powstaje 5-hydroksymetylofurfural, który dalej ogrzewany przekształca się w kwas mrówkowy i lewulinowy, którego pochodne dają barwne związki z pochodnymi fenolowymi. Reakcja ta pozwala odróŜnić pentozy od heksoz i aldozy od ketoz. Wła ś ciwo ś ci redukuj ą ce cukrów. Zarówno aldozy jak i ketozy w środowisku zasadowym wykazują właściwości redukujące, tzn. reagują np. z płynem Tollensa, dając lustro srebrowe. Warunkiem występowania właściwości redukujących jest obecność w cząsteczce cukru wolnej grupy aldehydowej lub ketonowej, a to moŜliwe jest w środowisku zasadowym. Próba Benedicta. Jest to najbardziej czuła próba na cukry redukujące, w której uŜywa się 1% wodny roztwór siarczanu(VI) miedzi(II), 10% roztwór cytrynianu sodu, 1% roztwór amoniaku i 10% roztwór węglanu sodu. Po dodaniu cukru redukującego i ogrzaniu pojawia się Ŝółty, pomarańczowy lub czerwony osad tlenku Cu 2 O. Za pomocą tej próby moŜna wykryć cukier redukujący juŜ przy stęŜeniu 0,1%.
Węglowodany redukujące odczynnik Fehlinga, odczynnik Benedicta lub odczynnik Tollensa noszą nazwę cukrów redukujących (np. glukoza). Sacharoza, powszechnie uŜywana w gospodarstwach domowych, jest cukrem nieredukującym.
Sacharydy charakteryzują się w większości przypadków słodkim smakiem. Za wzorzec smaku przyjmuje się 10% wodny roztwór sacharozy; jednostka słodkości, tzw. względna słodkość – RS (ang. relative sweetness) takiego roztworu wynosi 1. W Tabeli 1 zamieszczono wartości RS dla innych sacharydów.
CuCO 3 +
C (^) HO H C (^) OH C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO (^) Cu 2 O +
C O H C (^) OH C C C CH 2 OH
H H H
OH OH
HO
OH + (^) CO 2
Aspartam (200 razy słodszy od sacharozy)
Sacharyna (300 razy słodsza od sacharozy)
Acesulfam (200 razy słodszy od sacharozy) Termiczne lub enzymatyczne przekształcenia sacharydów mogą prowadzić do otrzymania związków zapachowych znanych jako wtórne aromaty Ŝywności. Pochodzą one z obróbki zarówno czystych sacharydów (wówczas za zapach odpowiadają pochodne furanu), jak i sacharydów z aminokwasami, czy sacharydów z α-hydroksykwasami. Sacharydy wykorzystuje się równieŜ do produkcji barwników Ŝywności. W wyniku tzw. palenia cukru, w temp. 200-240ºC przez kilka godzin, powstaje brunatny produkt zwany karmelem. Karmel, do celów barwiących, otrzymuje się przez palenie cukru w niŜszej temp. 130-200ºC wobec amoniaku (powstaje tzw. karmel amoniakalny lub inaczej brunatny barwnik). PoniewaŜ zawiera on w sobie niewielkie ilości neurotoksycznego związku - 4(5)- metyloimidazolu – dąŜy się do wyeliminowania karmelu amoniakalnego z produkcji lub usiłuje się wprowadzić ograniczenia na dzienne spoŜycie produktów barwionych karmelem. Karmel uŜywany jako dodatek do Ŝywności podlega standaryzacji; dopuszcza się stosowanie 10 typów karmeli, które róŜnią się sposobem produkcji, przede wszystkim rodzajem zastosowanego katalizatora. Polisacharydy tworzą hydrokoloidy. Formują one swoją własną makrostrukturę, co widać pod postacią Ŝelowania, gęstnienia, delikatnienia masy, zwiększonej odporności na ogrzewanie i wstrząsy oraz starzenie. Wykorzystuje się to w teksturowaniu Ŝywności. Sacharydy mogą kompleksować z wieloma związkami, a teksturująca rola sacharydów zaleŜy
od ich stęŜenia, warunków reakcji (temperatury, pH czy składu mieszaniny reakcyjnej), zawartości lipidów i białek oraz ich budowy. Często czynnikami teksturującymi są skrobie sieciowane. Siarczan skrobi (ester kwasu siarkowego(VI) i skrobi) stosuje się jako zagęszczacz i stabilizator emulsji. Do tego celu moŜna wykorzystać teŜ inne anionowe polisacharydy, takie jak pektyny, kwas alginowy czy karageniny. Sacharydy występujące w błonniku pokarmowym pełnią rolę substancji balastowych. Błonnik pokarmowy jest mieszaniną substancji o charakterze polisacharydowym (celuloza, hemicelulozy, pektyny, gumy, śluzy) i niepolisacharydowym (ligniny). DuŜe jego ilości znajdują się w niskoprzetworzonych produktach zboŜowych (otrębach zboŜowych, kaszach, naturalnych płatkach zboŜowych, musli, niełuskanym ryŜu, pieczywie razowym i pełnoziarnistym) oraz warzywach i owocach. Skoncentrowanym źródłem błonnika pokarmowego są suszone owoce: śliwki, figi, morele. W teksturowaniu Ŝywności wykorzystuje się takŜe mikrokapsułujące właściwości cyklodekstryn. Znalazły one zastosowanie w ochronie utleniających się, nieodpornych na światło i ciepło składników Ŝywności, przy zatrzymywaniu składników lotnych (np. aromatów), słuŜą do usuwania składników szkodliwych i mających nieprzyjemny smak i/lub niemiłą woń. Cyklodekstryny zmniejszają higroskopijność, utrwalają piany i sprzyjają ich powstawaniu. Pewne właściwości mikrokapsułkujące w stosunku do róŜnych substancji wykazuje teŜ glukoza, skleikowana skrobia, skrobia ziemniaczana, a takŜe guma arabska i arabinogalaktan z modrzewia. Sacharydy, a zwłaszcza sacharoza, są środkami konserwującymi marmolady, soki, konfitury, galaretki, kisiele i budynie. Związki te wykorzystuje się takŜe do produkcji tworzyw biodegradowalnych oraz produktów o bardzo duŜej zdolności wiązania wody, tzw. superabsorbentów. Otrzymuje się je w wyniku połączenia polisacharydu (najczęściej skrobi) z białkiem. Do mieszaniny dodaje się emulgatory (glicerol, laktozę, trimetyloaminoetanoloaminę) oraz wypełniacze (syntetyczne polimery, hemicelulozy czy sproszkowaną celulozę). Ze skrobi tworzy się takŜe biodegradowalne tworzywa syntetyczno-skrobiowe, np. biodegradowalne folie polietylenowe zawierają 6-15% skrobi, pianki poliuretanowe – 20% skrobi, a kopolimery etylenu z chlorkiem winylu lub styrenu do 50% skrobi; są to doskonałe środki pochłaniające wilgoć.
Sacharydy spełniają w organizmie wiele waŜnych funkcji: o są głównym, najtańszym i najłatwiej dostępnym źródłem energii, słuŜącej przede wszystkim do utrzymywania stałej ciepłoty ciała, pracy narządów wewnętrznych oraz do wykonywania pracy fizycznej (z 1 g węglowodanów wyzwalają się 4 kcal energii); glukoza jest prawie wyłącznym źródłem energii dla mózgu; o są materiałem budulcowym elementów strukturalnych komórek lub substancji biologicznie czynnych, np. rybozy; biorą udział w budowie błon komórkowych; o pozwalają na oszczędną gospodarkę białkami i lipidami; o odgrywają znaczną rolę w gospodarce wodnej i mineralnej, zmniejszając wydalanie tych składników; o niektóre sacharydy (zawarte w błonniku pokarmowym), choć nie są przez organizm człowieka trawione i przyswajane, odgrywają istotną rolę w regulowaniu procesów zachodzących w przewodzie pokarmowym, m.in. wpływają na perystaltykę przewodu pokarmowego, stymulują wzrost i rozwój „dobrych” bakterii (bakterii kwasu mlekowego). Błonnik pokarmowy obniŜa takŜe poziom cholesterolu we krwi, reguluje metabolizm cukrów oraz pozwala na dłuŜej zachować uczucie sytości po posiłku. Zapotrzebowanie: Sacharydy powinny dostarczać 55-60% wartości energetycznej dziennej racji pokarmowej dorosłego człowieka. Dzienny poziom zalecanego spoŜycia węglowodanów dla róŜnych grup ludności podano w Tabeli 3.
Tabela 3. Dzienny poziom zalecanego spo Ŝ ycia w ę glowodanów dla ró Ŝ nych grup ludno ś ci (Szczygieł A. i inni: Normy Ŝ ywienia I śś , zaktualizowane w 1980 r. ś yw. Człow. i Metab ., 10, 2, 143, 1983.)
Grupy ludności Węglowodany Ogółem [g] [%] energii z sacharydów Dzieci 1-3 lat 165 51 Dzieci 4-6 lat 235 55 Dzieci 7-9 lat 290 55 Chłopcy 10-12 lat 370 57 Dziewczęta 10-12 lat 320 56 MłodzieŜ męska 13-15 lat 420-470 56- MłodzieŜ męska 16-20 lat 450-545 56- MłodzieŜ Ŝeńska 13-15 lat 365-400 56- MłodzieŜ Ŝeńska 16-20 lat 355-390 57- MęŜczyźni 21-64 lat praca lekka 345-385 58- MęŜczyźni 21-64 lat praca umiarkowana 400-480 57- MęŜczyźni 21-64 lat praca cięŜka 500-600 57-
MęŜczyźni 21-64 lat praca bardzo cięŜka 575-605 57- Kobiety 21-59 lat praca lekka 300-335 57- Kobiety 21-59 lat praca umiarkowana 330-405 55- Kobiety 21-59 lat praca cięŜka 400-460 55- Kobiety cięŜarne (II połowa ciąŜy) 400 57 Kobiety karmiące 490 58 MęŜczyźni 65-75 lat 335 58 MęŜczyźni powyŜej 75 lat 315 60 Kobiety 60-75 lat 320 58 Kobiety powyŜej 75 lat 300 60
1.6.1. Wprowadzenie Jak juŜ wspomniano, sacharydy tworzą zróŜnicowaną grupę związków, dlatego teŜ istnieje wiele metod ich oznaczania w produktach spoŜywczych. Najczęściej wykorzystują one następujące właściwości cukrów: zachowanie wobec silnych kwasów mineralnych, zdolność skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, zdolność tworzenia przez większość sacharydów jednorodnych roztworów wodnych, właściwości redukcyjne oraz zdolność do ulegania fermentacji. Czasami zawartość sacharydów ogółem oblicza się w sposób uproszczony i podaje jako: sacharydy ogółem = 100 – (woda + popiół + białko + tłuszcz) Wartości poszczególnych składników Ŝywności (wody, popiołu, białka tłuszczu) oznacza się analitycznie i wyraŜa w procentach. Metoda ta jest stosowana przede wszystkim do ustalania wartości energetycznej produktu, daje jednak wyniki przybliŜone, gdyŜ nie uwzględnia faktu, iŜ obliczona w ten sposób frakcja polisacharydowa zawiera inne składniki, np. kwasy organiczne. PoniewaŜ sacharydy obecne w Ŝywności składają się z przyswajalnych i nieprzyswajalnych, zaleca się, aby w przypadku obliczania wartości energetycznej produktu, zamiast sacharydów ogółem stosować sacharydy przyswajalne, będące róŜnicą zawartości sacharydów ogółem i błonnika pokarmowego. Wyznaczenie udziału frakcji błonnika pokarmowego (w tym tzw. skrobi opornej) wymaga zastosowania odmiennych metod oznaczania, gdyŜ charakteryzuje się on innymi właściwościami fizyko-chemicznymi w porównaniu z sacharydami przyswajalnymi.
1.6.2. Przygotowanie prób do oznaczania sacharydów Sposoby przygotowania prób dostosowane są do konkretnego produktu i podaje się je wraz z procedurą oznaczania ilościowego. W przypadku oznaczania sacharydów w
oprócz sacharydów inne składniki rozpuszczalne w wodzie, uzyskany wynik odpowiada ekstraktowi ogólnemu i ma charakter przybliŜony. Metody rafraktometryczne – mierzy się w nich współczynnik załamania światła (refrakcji) przez cząsteczki sacharydu rozpuszczonego w wodzie. W przypadku czystych roztworów sacharydów uzyskuje się bardzo dokładne i powtarzalne wyniki, ale dla roztworów wieloskładnikowych, w których pomiar współczynnika załamania jest wypadkową wszystkich rozpuszczonych w wodzie substancji, wynik ten określa ekstrakt ogólny, analogicznie jak w metodach densymetrycznych. Metoda ta znalazła szerokie zastosowanie w badaniach produktów spoŜywczych z uwagi na prostotę i szybkość analizy oraz moŜliwość wykonywania oznaczeń seryjnych. Metody polarymetryczne – polegają na pomiarze kąta skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, przechodzącego przez badany roztwór sacharydu. Analizy wykonuje się za pomocą specjalnych polarymetrów zwanych sacharymetrami; badany roztwór musi być bezbarwny, klarowny i bez zawiesin koloidalnych.
1.6.3.2. Metody chemiczne W metodach chemicznych wykorzystuje się redukcyjne właściwości sacharydów, związane z obecnością w cząsteczce wolnej grupy karbonylowej (aldehydowej lub ketonowej); tak oznaczoną zawartość sacharydów nazywa się zawartością „cukrów redukujących”. Sacharydy, które są pozbawione właściwości redukcyjnych (mają zablokowane grupy karbonylowe), poddaje się hydrolizie (inwersji) do monosacharydów i oznacza jako tzw. „cukry ogółem”. Najczęściej stosowaną metodą inwersji jest metoda Clergeta-Herzfelda , polegająca na hydrolizie sacharydów w kwaśnych warunkach, w podwyŜszonej temperaturze: C 12 H 22 O 11 + H 2 O pH < 7, temp. C 6 H 6 O 6 + C 6 H 6 O 6 sacharoza glukoza fruktoza NaleŜy ściśle przestrzegać warunków hydrolizy, gdyŜ przy zbyt niskim stęŜeniu kwasu lub przy zbyt niskiej temperaturze moŜe nastąpić niecałkowite rozszczepienie wiązań glikozydowych, podczas gdy zbyt wysokie wartości powyŜszych parametrów reakcji mogą doprowadzić do rozkładu produktów inwersji. Metody oparte na właściwościach redukcyjnych nie są specyficzne tylko dla sacharydów, gdyŜ inne substancje obecne produktach spoŜywczych (niektóre kwasy organiczne, np. kwas askorbinowy, zasady purynowe, niektóre aldehydy i aminokwasy, np. cysteina, kwas asparaginowy), takŜe wykazują w tych warunkach właściwości redukcyjne.
Aby uniknąć podwyŜszenia wyników oznaczania, usuwa się je w procesie odbiałczania i/lub klarowania, jak opisano w rozdziale 1.6.2. Największe znaczenie w ilościowym oznaczaniu sacharydów w produktach spoŜywczych mają metody oparte na redukcji soli miedzi(II) w środowisku alkalicznym. Odczynniki miedziowe stosowane w metodach miareczkowych to zasadowe roztwory siarczanu(VI) miedzi(II), zawierające winian sodu i potasu lub cytrynian sodu, glicerynę lub inny związek tworzący rozpuszczalny kompleks z jonami miedzi:
W środowisku zasadowym w podwyŜszonej temperaturze następuje przeprowadzenie sacharydów w formę łańcuchową, która ulega enolizacji. Powstałe endiolowe formy sacharydów utleniają się do kwasów (np. z glukozy powstaje kwas glukonowy); jednocześnie następuje redukcja jonów Cu+2^ do jonów Cu+1, które łącząc się z jonami wodorotlenkowymi, dają czerwony osad tlenku miedzi(I):
W metodzie tej bardzo waŜne jest ścisłe przestrzeganie warunków oznaczania, m.in. utrzymywanie stanu wrzenia, gdyŜ zabezpiecza się wtedy próbkę przed dostępem powietrza, które moŜe ponownie utlenić zredukowaną miedź i barwnik. Wśród metod miareczkowych najczęściej stosowane są: Metoda Fehlinga - polega ona na miareczkowym oznaczaniu ilości redukujących sacharydów w roztworze, odpowiadających całkowitej redukcji miedzi zawartej w roztworze odczynników Fehlinga I (CuSO 4 x 5H 2 O) i Fehlinga II (winian sodu i potasu: NaK 4 C 4 H 4 O 6 · 4H 2 O) wprowadzonych w jednakowej objętości (po 10 ml). Winian sodu i potasu tworzy z jonami Cu+2^ ciemnoniebieski, rozpuszczalny w wodzie kompleks; koniec miareczkowania rozpoznaje się po zaniku barwy niebieskiej , świadczącej o braku jonów Cu+2. Metoda Lane – Eynona – jest rozwinięciem metody Fehlinga i moŜe być stosowana do oznaczania sacharydów w roztworach bezbarwnych. Oznaczanie polega na bezpośrednim miareczkowaniu wrzącej mieszaniny roztworów Fehlinga I i II odpowiednio rozcieńczonym roztworem sacharydu (0,1 – 0,4%) w obecności błękitu metylenowego jako wskaźnika końca
W metodzie Bertranda, nie ma potrzeby dokładnego oznaczania miana odczynnika miedziowego (mieszaniny roztworów Bertranda I i II); musi być on jedynie dodany w nadmiarze do redukujących sacharydów. Metoda Luffa – Schoorla – zasada oznaczenia opiera się na reakcji redukcji jonów Cu+2^ zawartych w płynie Luffa przez sacharydy redukujące obecne w badanym roztworze. Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym (pH ok. 9,5) w temperaturze wrzenia. W skład płynu Luffa wchodzi: siarczan(VI) miedzi(II) (CuSO 4 · 5H 2 O), węglan sodu (Na 2 CO 3 · 10H 2 O), kwas cytrynowy (C 6 H 8 O 7 · H 2 O) - w porównaniu z poprzednimi metodami zastąpiono wodorotlenek sodu węglanem sodu, a winian sodu i potasu kwasem cytrynowym. W środowisku zasadowym sacharydy redukują siarczan(VI) miedzi(II) do tlenku miedzi(I). Wprowadzenie do roztworu jodku potasu (KI) i kwasu siarkowego(VI) powoduje wydzielenie jodowodoru (HI). Ulega on reakcji z niezredukowanym przez sacharydy siarczanem (VI) miedzi(II) i powstaje jodek miedzi(I). Nadmiar jodu (z dodatku KI) odmiareczkowuje się tiosiarczanem(VI) sodu (Na 2 S 2 O 3 ): 2 CuSO 4 + 4 KI → 2 K 2 SO 4 + Cu 2 I 2 + I 2 I 2 + 2 Na 2 S 2 O 3 → 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Wykonuje się ślepą próbę, aby ustalić zuŜycie roztworu tiosiarczanu(VI) sodu na zmiareczkowanie jodu wydzielonego przez całkowitą ilość miedzi zawartej w płynie Luffa. Objętość tiosiarczanu(VI) sodu odpowiadająca ilości miedzi(II) podlegającej redukcji przez sacharydy oblicza się jako róŜnicę objętości uzyskanych z dwóch miareczkowań (próby ślepej i właściwej), a następnie z odpowiednich tablic odczytuje się zawartość sacharydów redukujących w analizowanej próbce. Zawartość sacharydów w roztworze uŜytym do oznaczeń nie powinna być wyŜsza niŜ 0,1-0,5%.
1.6.3.3. Metody fizykochemiczne W najczęściej stosowanych metodach fizykochemicznych oznaczane sacharydy przeprowadza się w związki barwne, a następnie kolorymetrycznie mierzy intensywność powstałego zabarwienia. Do metod tych naleŜy: Metoda antronowa – polega ona na odwodnieniu sacharydów przez ogrzewanie ze stęŜonymi kwasami (octowym, siarkowym(VI), solnym). Powstały z pentoz - furfural i z heksoz - 5- hydroksymetylofurfural tworzą z antronem barwny roztwór. Pomiar intensywności zabarwienia (proporcjonalny do stęŜenia sacharydów) wykonuje się za pomocą metod spektrofotometrycznych przy długości fali λ = 620 nm.
Metoda rezorcynowa – pozwala oznaczyć ketosacharydy, a takŜe wyznaczyć zawartość ketopentoz i ketoheksoz obok siebie. Metoda ta polega na odwodnieniu ketosacharydów przez ogrzewanie z kwasem solnym, a następnie reakcji powstałych produktów z rezorcyną, w wyniku której tworzą się barwne kompleksy. Pomiar intensywności zabarwienia wykonuje się: dla ketoheksoz, przy długości fali λ = 520 nm, dla ketopentoz, przy długości fali λ = 620 nm. Metoda heksacyjano Ŝ elazianowa – stosowana jest do oznaczania aldosacharydów i polega na redukcji w środowisku zasadowym heksacyjanoŜelazianu(III) do heksacyjanoŜelazianu(II) przez aldosacharydy. Powstały heksacyjanoŜelazianu(II) tworzy z jonami Fe+3^ błękit pruski; pomiar intensywności powstałego zabarwienia wykonuje się przy długości fali λ = 690 nm.
1.6.3.4. Metody chromatograficzne Metody chromatograficzne wykorzystuje się zarówno do oznaczeń jakościowych, jak i ilościowych poszczególnych sacharydów. Do najczęściej stosowanych technik chromatograficznych naleŜą: Chromatografia cienkowarstwowa lub bibułowa (TLC) – pozwala m.in. na zidentyfikowanie pentoz, heksoz i disacharydów w mieszaninie cukrów. Identyfikację przeprowadza się przez porównanie współczynników Rf (ang. retention factor - wskaźnik opóźnienia, wskaźnik retencji) oraz na podstawie charakterystycznych dla poszczególnych sacharydów reakcji barwnych z odpowiednimi odczynnikami. Jako fazę stacjonarną stosuje się najczęściej Ŝel krzemionkowy. Chromatografia kolumnowa (LC) – odpowiednio dobrane warunki rozdziału pozwalają nie tylko dokonać analizy jakościowej (identyfikacja sacharydów), ale takŜe oznaczyć je ilościowo za pomocą omówionych metod, np. metod chemicznych, fizykochemicznych czy enzymatycznych. Chromatografia gazowa (GC) – sacharydy są nielotne, stąd aby moŜna było analizować je metodą chromatografii gazowej, muszą zostać przekształcone w bardziej lotne pochodne, np. trimetylosililowe. Po rozdziale na odpowiednio dobranej kolumnie chromatograficznej identyfikacji sacharydów dokonuje się na podstawie porównania czasów retencji analizowanych związków z czasami retencji wzorców, natomiast ich ilość określa się na podstawie wielkości pików chromatograficznych, które są proporcjonalne do ilości sacharydów w próbce. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) – w analizie sacharydów najczęściej stosowanym detektorem jest detektor refraktometryczny, który mierzy współczynnik
