Interferencja RNA: potranskrypcyjne wyciszenie genów | Notatki Gastroenterologia

Interferencja RNA: potrąnskrypcyjne wyciszanie genów

Ja b ło ńsk a M onika, K oło m yck a Agnie szk a , Or łow ska Ka rina

Ka ted ra Fizjologii Zw ierząt

W yd z iał Biolo gii i Biote chnolo g ii

Un iw e r sy tet W a rm ińsko - Ma zurs ki

Olszty n

Proces interferencji RNA (RNAi) polega na zahamowaniu ekspresji doce

lowego genu, przez małe niekodujące cząsteczki RNA. Zjawisko RNAi mo

że być wywoływane przez występujące endogennie mikroRNA (miRNA) lub

dostające się do organizmu na drodze naturalnej egzogenne cząsteczki

RNA (materiał genetyczny wirusa, retrotranspozony). Obecnie, proces

RNAi może być również celowo aktywowany w warunkach laboratoryjnych,

poprzez wprowadzenie do wnętrza komórki syntetycznych cząsteczek RNA

(siRNA). Niezależnie od rodzaju aktywacji, krótkie cząsteczki RNA łączą

się w cytoplazmie

z kompleksem efektorowym odpowiedzialnym za degradację mRNA -

RISC. Aktywny kompleks rozpoznaje komplementarną sekwencję docelo

wego mRNA i prowadzi do jej hydrolizy. Brak obecności transkryptu po

woduje zahamowaniem translacji, tym samym przerwany zostaje przepływ

informacji genetycznej w komórce. Obecnie, proces RNAi jest szeroko wy

korzystywany do poznania funkcji poszczególnych genów.

Proces interferencji RN A (RNAi) polega na

zahamowaniu ekspresji docelowego trans

kryptu przez małe, niekodujące cząsteczki

RNA. Krótkie cząsteczki RN A w organizmie

występują endogennie (mikroRNA) lub też

dostają się do organizmu jako materiał

genetyczny wirusów albo produkt trans

krypcji retrotranspozonów. Proces interfe

rencji RNA może być również aktywowany

w wyniku działalności człowieka, tj. wpro

wadzenia syntetycznych dupleksów krót

kich RNA (siRNA, ang. short interfering

RNA) do wnętrza komórki [7,16].

Cząsteczki mikroRNA (miRNA) kodowane

są przez genom eukariontów. Stanowią one

grupę jednoniciowych fragmentów RNA

o długości od 21 do 23 nukleotydów.

W komórce odpowiadają za regulację eks-

presji różnych genów, dlatego nazywane są

endogennymi regulatorami ekspresji. U lu

dzi ekspresja ponad 1/3 genów kodujących

białka zależy od mikroRNA. Dowodzi to,

jak ważną rolę odgrywają te cząsteczki

w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu

oraz jego odpowiedzi na zmiany zachodzą

ce w środowisku [5,6]. Do chwili obecnej

odkryto ponad 35 000 miRNA

(http://www.mirbase.org), które opisano

u 223 gatunków.

Proces biog enezy miRNA można podzielić

na trzy etapy, z których dwa pierw sze za

chodzą w jądrze komórkowym, a trzeci

w cytoplazmie. W etapie pierwszym, geny,

które kodują miRNA są transkrybowane

przy udziale polimerazy RNA II. W efekcie

powstaje

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Interferencja RNA: potranskrypcyjne wyciszenie genów i więcej Notatki w PDF z Gastroenterologia tylko na Docsity!

Interferencja RNA: potrąnskrypcyjne wyciszanie genów

Ja b ło ń s k a M onika, K o ło m y ck a A g n ie s z k a , O rło w sk a Karina K ated ra Fizjologii Z w ie rz ą t W y d z ia ł B iolog ii i B io te c h n o lo g ii U n iw e rs y te t W a rm iń s k o - M a zu rsk i O lszty n

Proces interferencji RNA (RNAi) polega na zahamowaniu ekspresji doce

lowego genu, przez małe niekodujące cząsteczki RNA. Zjawisko RNAi mo

że być wywoływane przez występujące endogennie mikroRNA (miRNA) lub

dostające się do organizmu na drodze naturalnej egzogenne cząsteczki

RNA (materiał genetyczny wirusa, retrotranspozony). Obecnie, proces

RNAi może być również celowo aktywowany w warunkach laboratoryjnych,

poprzez wprowadzenie do wnętrza komórki syntetycznych cząsteczek RNA

(siRNA). Niezależnie od rodzaju aktywacji, krótkie cząsteczki RNA łączą

się w cytoplazmie

z kompleksem efektorowym odpowiedzialnym za degradację mRNA -

RISC. Aktywny kompleks rozpoznaje komplementarną sekwencję docelo

wego mRNA i prowadzi do jej hydrolizy. Brak obecności transkryptu po

woduje zahamowaniem translacji, tym samym przerwany zostaje przepływ

informacji genetycznej w komórce. Obecnie, proces RNAi jest szeroko wy

korzystywany do poznania funkcji poszczególnych genów.

Proces interferencji RNA (RNAi) polega na zahamowaniu ekspresji docelowego trans kryptu przez małe, niekodujące cząsteczki RNA. Krótkie cząsteczki RNA w organizmie występują endogennie (mikroRNA) lub też dostają się do organizmu jako materiał genetyczny wirusów albo produkt trans krypcji retrotranspozonów. Proces interfe rencji RNA może być również aktywowany w wyniku działalności człowieka, tj. wpro wadzenia syntetycznych dupleksów krót kich RNA (siRNA, ang. short interfering RNA) do wnętrza komórki [7,16]. Cząsteczki mikroRNA (miRNA) kodowane są przez genom eukariontów. Stanowią one grupę jednoniciowych fragmentów RNA o długości od 21 do 23 nukleotydów. W komórce odpowiadają za regulację eks-

presji różnych genów, dlatego nazywane są endogennymi regulatorami ekspresji. U lu dzi ekspresja ponad 1/3 genów kodujących białka zależy od mikroRNA. Dowodzi to, jak ważną rolę odgrywają te cząsteczki w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu oraz jego odpowiedzi na zmiany zachodzą ce w środowisku [5,6]. Do chwili obecnej odkryto ponad 35 000 miRNA (http://www.mirbase.org), które opisano u 223 gatunków. Proces biogenezy miRNA można podzielić na trzy etapy, z których dwa pierwsze za chodzą w jądrze komórkowym, a trzeci w cytoplazmie. W etapie pierwszym, geny, które kodują miRNA są transkrybowane przy udziale polimerazy RNA II. W efekcie powstaje

pri-miRNA będący pierwotnym transkryp- tem miRNA. Pri-miRNA składa się kilku ty sięcy nukleotydów i ma kształt spinki do włosów. Na końcu 5' pri-miRNA znajduje się ochronna czapeczka guanylowa, a na końcu 3' ogon poli(A). W następnym eta pie, obecny w jądrze komórkowym kom pleks enzymatyczny Drosha (posiadający aktywność RNazy) wycina z pierwotnego transkryptu miRNA fragment o długości 70 nukleotydów. Fragment ten charakteryzuje się wewnątrzcząsteczkowymi regionami komplementarności oraz dwunukleotydo- wymi wysunięciami na końcu 3'. Struktura taka nazywana jest pre-miRNA. W etapie trzecim pre-miRNA transporto wane jest do cytoplazmy za pośrednictwem eksportyny 5. Znajdująca się w cytoplazmie rybonukleaza Dicer, enzym należący do ro dziny RNaz III, tnie pre-miRNA na frag menty RNA o długości od 18 do 24 nukleotydów. W ten sposób powstają wła ściwe cząsteczki miRNA [3,5,6]. Następnie miRNA, dzięki aktywności biał ka Dicer, wprowadzane jest do kompleksu efektorowego odpowiedzialnego za degra dację mRNA - RISC (ang. RNA induced si lencing complex). Aktywność katalityczną RISC warunkuje białko Ago-2, należące do rodziny Argonaut (Ago). W komórkach nie- posiadających białka Ago-2 nie zachodzi proces interferencji RNA. W skład białka Ago-2 wchodzą dwie charakterystyczne domeny: PAZ i PIWI. Domena PAZ wiąże obecne w komórce miRNA. Domena PIWI, o aktywności RNazy H, odpowiedzialna jest za cięcie komplementarnego mRNA [8,9,12]. Po połączeniu dwuniciowego miRNA z kompleksem RISC, nić charakte ryzująca się bardziej stabilnym końcem 5' oddysocjowuje i ulega enzymatycznej de gradacji. Tym samym kompleks RISC staje

się aktywny. Nić, która pozostała w kom pleksie RISC (nić wiodąca) hybrydyzuje z komplementarnym mRNA. W przypadku gdy sekwencja miRNA i mRNA jest homo logiczna w 100%, białko Ago-2 w obecności jonów magnezu, rozrywa wiązanie fosfora nowe dokładnie pomiędzy 10. a 11. nukle- otydem mRNA, licząc od końca 5' nici miRNA. Następnie, kompleks oddysocjo wuje w celu znalezienia kolejnego komple mentarnego mRNA. Pocięte mRNA nie posiada ochronnej czapeczki 7-metylogu- aninowej i ogona poli-A, tym samym nara żone jest na działanie występujących w komórce RNaz. Brak mRNA doprowadza do zahamowania translacji, co prowadzi do przerwania przepływu informacji gene tycznej w komórce. W sytuacji gdy se kwencje miRNA i mRNA nie są stuprocentowo komplementarne, kompleks RISC-miRNA hybrydyzuje do mRNA bloku jąc translację, tym samym transkrypt nie zostaje zniszczony. Dzięki temu, przy nagłej zmianie warunków środowiskowych, moż liwe jest szybkie wznowienie translacji [3, 4, 5, 6]. Zjawisko interefencji RNA może być także wywoływane przez długie dwuniciowe czą steczki RNA (dsRNA, ang. double-strand RNA), będące materiałem genetycznym wirusa lub też produktem transkrypcji re- trotranspozonów [3]. Obecne w komórce egzogenne RNA aktywuje rybonukleazę Dicer. Enzym ten tnie obce RNA do krót kich interferujących RNA (siRNA) - czą steczek o długości od 20 do 25 nukleotydów. Cząsteczki siRNA charakte ryzują się obecnością dwóch niesparowa- nych nukleotydów na końcu 3' oraz grupą fosforanową na końcu 5'. Przy udziale białka Dicer, siRNA wprowadzane są do kompleksu efektorowego RISC. Dalej, pro-

ces interferencji RNA indukowany obecno ścią egzogennych kwasów nukleinowych przebiega tak jak w przypadku miRNA. Warto jednak zaznaczyć, że w wyniku wy ciszania genów przy udziale siRNA zawsze dochodzi do degradacji docelowego mRNA [2,7,8,10]. Niezależnie od opisanych powyżej zjawisk, które występują w przyrodzie, interferen cja RNA może być celowo wykorzystywana przez człowieka w warunkach laboratoryj nych poprzez wprowadzenie do wnętrza komórki syntetycznych cząsteczek RNA (siRNA). Stało się to możliwe dzięki odkry ciu dwójki naukowców A. Fire oraz C.C Mello, którzy w roku 1998 na łamach „N a turę" opublikowali wyniki swoich wielolet nich badań, przeprowadzonych na nicieniu Caenorhabditis elegans. Wynikało z nich, że wprowadzenie syntetycznych siRNA do komórek zwierzęcia prowadzi do ukierun kowanej degradacji komplementarnego transkryptu. Proces interferencji RNA aktywowany w wyniku pojawienia się w komórce synte tycznych siRNA przebiega w ten sam spo sób jak dla miRNA. Obecne w cytoplazmie siRNA łączy się z RISC, a następnie hybry- dyzuje do komplementarnego mRNA. Ho mologiczne mRNA jest rozkładane przez białko Ago-2, w efekcie czego zatrzymany zostaje proces translacji i nie powstaje do celowe białko [9]. Syntetyczna cząsteczka siRNA powinna hamować ekspresję homo logicznego genu i tym samym nie wywoły wać efektów niespecyficznych. Cząsteczki siRNA projektuje się w g następujących kryteriów: •długość od 21 do 23 nt, •homologia tylko do docelowego mRNA, •sekwencja docelowa, dla której projek towane jest siRNA, musi znajdować się

w odległości 50-100 nukleotydów od miej sca inicjacji translacji, •na końcu 3' każdej z nici powinny wystę pować dwa niesparowane nukleotydy, •zawartość par G-C w siRNA powinna wy nosić od 30 - 50%, •powinno się unikać sekwencji bogatych w guaninę, •temperatura topnienia konstruktu powin na być możliwie najniższa, •należy unikać długich powtórzeń jednego nukleotydu.

Obecnie dostępne są różne programy kom puterowe, które wykorzystując powyższe kryteria, projektują potencjalnie najbar dziej efektywne cząsteczki siRNA. Należą do nich m.in. siDESIGN Center Designer czy Block-iT RNAi [1, 9, 10, 12, 13]. Stan dardowo, jednorazowo projektuje się 3- siRNA o różnych sekwencjach. Niekiedy, aby uzyskać efekt wyciszenia genu, ko nieczne jest zaprojektowanie i sprawdzenie nawet 20 różnych sekwencji siRNA. Aktu alnie siRNA otrzymuje się głównie na dro dze syntezy chemicznej. Metoda ta pozwala na pełną kontrolę sekwencji istrukturyotrzymywanychzwiązków[ 14]. Cząsteczki siRNA wprowadzane są do cy- toplazmy komórek za pomocą różnych me tod transfekcyjnych. Najczęściej do wyciszenia genów w warunkach in vitro stosuje się liposomy i polimery. Są to ko mercyjnie dostępne kationowe nośniki siR NA, pozwalające na przezwyciężenie odpychania elektrostatycznego występują cego pomiędzy ujemnie naładowaną błoną komórkową a ujemnie naładowanym siR NA. Ponadto, w porównaniu do innych me tod, zastosowanie kationowych nośników siRNA jest proste i tanie. Inne metody to m.in. wektory wirusowe, elektroporacja

czy iniekcja [10, 14, 15]. Odkrycie, że pro ces RNAi może być celowo aktywowany w warunkach laboratoryjnych pozwoliło na wykorzystanie tego zjawiska w pracach doświadczalnych. Obecnie, wyciszanie ge-

Bibliografia:

Cejka D., Losert D., Wacheck V 2006. Short interfering RNA (siRNA): tool or therapeutic? Clinical Science, 110: 47-
Chromik I. 2008. Zastosowanie interferencji RNA (RNAi) w raku trzustki-nowe strategie leczenia. Gastroenterologia Polska, 15: 337-
Dykxhoorn D., Lieberman J. 2005. The Silent Revolution: RNA Interferences as Basic Biology, Research Tool, and Therapeutic. AR Reviews in Advance, 56: 401-
Filip A. 2006. Mikro-RNA - Małe cząsteczki o wielkim znaczeniu. Postępy Biologii Komórki, 1: 45 57
Grenda A., Budzyński M. 2013. Biogeneza cząsteczek mikroRNA oraz ich znaczenie w powstawaniu i przebiegu wybranych zaburzeń hematologicznych. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 67: 174-
Hukowska-Szematowicz B., Deptuła W. 2010. Biologiczna rola mikroRNA - nowe dane. Postępy Biologii Komórki, 3: 585-
Jabłońska M. 2014. Prace pilotowe nad wyciszeniem genu receptora węglowodorów aromatycznych (AhR) w komórkach ziarnistych linii AVG-16 za pomocą krótkich, interferujących RNA (siRNA). Mskr. Pracy magisterskiej. Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, Olsztyn, ss.
Jóźwiak P., Lipińska A. 2010, Zastosowanie interferencji RNA w diagnostyce i terapii niektórych chorób człowieka. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 64: 504-
Leung R., Whittaker R 2005. RNA interference:

nów metodą interferencji RNA jest szeroko stosowane w badaniach w zakresu biologii molekularnej i medycyny [7,15].

from gene silencing to gene-specific therapeutics. Pharmacology & Therapeutics, 107: 222-

Matokanovic M., Bariśić K. 2009. RNA Inteference as New Tool in Therapeutics. Food Technology and Biotechnology, 47: 229-
Piotrowska A., RybarczykA., Wierzbicki R, Kotwas M., Wrońska A., Kmieć Z. 2009. Interferencja RNA - Mechanizmy i Możliwości Terapeutycznego Wykorzystania. Polish Annals of Medicine, 16: 138 147
Potapińska O., Wąsik M. 2009. Wyciszenie nadekspresji genu MDRlza pomocą siRNA: nośniki, efekty, perspektywy. Jurnal of Oncology, 1: 33-
Sierant M. Kazmierczak-Baranska J. Paduszynska A. Sobczak M. Pietkiewicz A., Nawrot B.2010. Longer 19-base pair short interfering RNA duplexes rather than shorter duplexes trigger RNAinterference. Oligonucleotides, 20:199-
Sipa K., Nawrot B. 2008. Mechanizm interferencji RNA i wykorzystanie RNAi dla celów terapeutycznych. Farmakoterapia w Psychiatrii i Neurologii, 1: 7-
Stanisławska J., Olszewski W. L. 2005. RNA interference - significance and applications. Archivum Immunologiae et Therapia Experimentalis, 53: 39-
Szweykowska - Kuklińska Z., Szarzyńska B. 2007. Nagroda Nobla 2006 za fundamentalne odkrycia w regulacji ekspresji genów u eukariontów. Postępy Biologii Komórki, 1: 3-

Interferencja RNA: potranskrypcyjne wyciszenie genów, Notatki z Gastroenterologia

Dokumenty powiązane

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Interferencja RNA: potranskrypcyjne wyciszenie genów i więcej Notatki w PDF z Gastroenterologia tylko na Docsity!

Interferencja RNA: potrąnskrypcyjne wyciszanie genów

Proces interferencji RNA (RNAi) polega na zahamowaniu ekspresji doce

lowego genu, przez małe niekodujące cząsteczki RNA. Zjawisko RNAi mo

że być wywoływane przez występujące endogennie mikroRNA (miRNA) lub

dostające się do organizmu na drodze naturalnej egzogenne cząsteczki

RNA (materiał genetyczny wirusa, retrotranspozony). Obecnie, proces

RNAi może być również celowo aktywowany w warunkach laboratoryjnych,

poprzez wprowadzenie do wnętrza komórki syntetycznych cząsteczek RNA

(siRNA). Niezależnie od rodzaju aktywacji, krótkie cząsteczki RNA łączą

się w cytoplazmie

z kompleksem efektorowym odpowiedzialnym za degradację mRNA -

RISC. Aktywny kompleks rozpoznaje komplementarną sekwencję docelo

wego mRNA i prowadzi do jej hydrolizy. Brak obecności transkryptu po

woduje zahamowaniem translacji, tym samym przerwany zostaje przepływ

informacji genetycznej w komórce. Obecnie, proces RNAi jest szeroko wy

korzystywany do poznania funkcji poszczególnych genów.