Ćwiczenie 6
Inwertaza
Izolowanie enzymu
i wykrywanie jego aktywności
ENZYMOLOGIA
Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa
Centrum Bioimmobilizacji
i Innowacyjnych Materiałów
Opakowaniowych
ul. Klemensa Janickiego 35
71-270 Szczecin
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Informacje i wskazówki
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Ranking uczelni
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Nasze e-booki ratujące uczniów i studentów!
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Inwertaza. Izolowanie enzymu i i wykrywanie jego aktywności, Ćwiczenia z Scienza Alimentare
Wprowadzenie teoretyczne do ćwiczeń
Typologia: Ćwiczenia
2019/2020
1 / 7
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Dokumenty powiązane
Podgląd częściowego tekstu
Pobierz Inwertaza. Izolowanie enzymu i i wykrywanie jego aktywności i więcej Ćwiczenia w PDF z Scienza Alimentare tylko na Docsity!
Ćwiczenie 6
Inwertaza
Izolowanie enzymu
i wykrywanie jego aktywności
ENZYMOLOGIA
Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa
Centrum Bioimmobilizacji i Innowacyjnych Materiałów Opakowaniowych
ul. Klemensa Janickiego 35 71 - 270 Szczecin
Ćwiczenie 6. Inwertaza – izolowanie enzymu i wykrywanie jego aktywności
Inwertaza (sacharaza, β-fruktofuranozydaza) - enzym należący do grupy hydrolaz, został po raz pierwszy wyizolowany z ekstraktu drożdży przez Berthelota w 1860 roku. Hydrolizuje wiązania glikozydowe utworzone z udziałem grupy hydroksylowej w położeniu β, związanej z węglem anomerycznym (C2) pierścienia fruktofuranozy. Sacharaza powoduje hydrolizę dwucukru sacharozy do glukozy i fruktozy, trójcukru rafinozy do fruktozy i dwucukru melibiozy. Głównym, naturalnym substratem β-fruktofuranozydazy jest sacharoza (Rys.1). Inwertazy występują w bakteriach i innych mikroorganizmach, w roślinach wyższych (w ścianie komórkowej) i u zwierząt. Przez pszczoły sacharaza wykorzystywana jest do hydrolizy sacharozy podczas produkcji miodu. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Bogatym źródłem inwertazy są drożdże. Inwertaza drożdżowa wykazuje optimum działania w pH 4.0—5.5. Aktywność enzymatyczną inwertazy można oznaczyć różnymi metodami np. metodą kolorymetryczną lub polarymetryczną.
Rys.1. Sacharoza (α-D-glukopiranozylo-β-D-fruktofuranozyd) z zaznaczonym miejscem działania inwertazy (Dubin i Turyna, 1999)
Sacharoza to disacharyd zbudowany z α-D-glukozy i β-D-fruktozy połączonych wiązaniem glikozydowym 1-2. W większych ilościach występuje w burakach cukrowych i trzcinie cukrowej. Nie posiada właściwości redukujących.
Zastosowanie sacharazy w technologii żywności Sacharaza otrzymywana jest głównie z drożdży Saccharomyces cerevisiae. Enzym ten może być stosowany w produkcji cukierniczej, do przygotowania syropów cukru inwertowanego używanego do wyrobu sztucznego miodu, cukierków, marmolad, konfitur, likierów itp.
redukujących stosuje się różne cząsteczki i jony: jod, jony metali ciężkich, jon żelazicyjankowy. W próbie Benedicta wykorzystuje się jony Cu (II), które pod wpływem cukrów redukujących tworzą Cu (I) dając w alkalicznym środowisku pomarańczowej barwy Cu 2 O.
Specyficzność działania enzymów. Najważniejszą cechą enzymów, odróżniającą je od innych katalizatorów, jest duża ich swoistość wyrażająca się katalizowaniem reakcji chemicznej określonego typu i ograniczonej tylko do określonej budowy substratu. Swoistość kierunku działania. Enzym ma zdolność wybierania i katalizowania tylko jednej reakcji spośród wielu możliwych. Energia aktywacji dla tej reakcji zostanie tak obniżona, że bardzo szybko ustala się stan równowagi. Zjawisko to wyraża specyficzność działania enzymu. Enzym katalizuje tylko jedno z wielu termodynamicznie możliwych przekształceń danej substancji. Inny enzym, o innej specyficzności działania, wyzwala inną reakcję, np.:
Specyficzność substratowa. Specyficzność w stosunku do substratu oznacza możliwość wyboru przez dany enzym lup grupy strukturalnie podobnych związków, z którymi wchodzi w kompleks zdolny do dalszej reakcji. Specyficzność enzymu wobec substratu może być bardzo duża. Najważniejszym jej wyrazem jest zdolność kierowania przemianą tylko jednego izomeru optycznego. W mieszaninie racemicznej DL-substratu pod wpływem enzymu o bezwzględnej swoistości przestrzennej zostaje przekształcony tylko jeden izomer przestrzenny. W reakcji odwrotnej syntetyzowany jest również tylko jeden izomer, podczas gdy ta sama reakcja w syntezie nieenzymatycznej daje mieszaninę racemiczną. Przykładem jest enzymatyczna redukcja pirogronianu do L-mleczanu. Podobny rodzaj specyficzności istnieje w odniesieniu do izomerów przestrzennych cis (Z)- trans (E). Enzym fumaraza działa tylko na fumarany, a nie przekształca maleinianów. 4.1.1.
Są enzymy, które mają małą specyficzność, np. lipazy kierują hydrolizą wiązań estrowych niezależnie od rodzaju alkoholu i kwasu tworzącego substrat. Enzymem o większej swoistości
jest maltaza, która hydrolizuje wiązania α-glukozydowe D-glukozy w maltozie, natomiast nie działa na wiązania β-glukozydowe i na cukrowce nie zawierające D-glukozy. Natomiast sacharaza katalizuje hydrolizę wszystkich oligosacharydów zawierających resztę β-D- fruktofuranozy, takich jak sacharoza, rafinoza i inne (hydroliza wiązań β-glukozydowych). Pepsyna rozbija najchętniej wiązania peptydowe utworzone przez grupy aminowe aminokwasów aromatycznych, leucyny i aminokwasów kwasowych. Natomiast trypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe, w które zaangażowane są grupy karboksylowe L-argininy i L-lizyny. Obie te peptydazy „rozpoznają” nie tylko rodzaj wiązania, ale również budowę aminokwasów sąsiadujących z hydrolizowanym wiązaniem.
Izolowanie i oczyszczanie enzymów W izolowaniu i oczyszczaniu enzymów stosuje się metody pozwalające na otrzymanie ich w stanie jednorodnym i bez utraty aktywności katalitycznej. Enzymy są przeważnie nietrwałe w pH poniżej 5 i powyżej 9, ulegają łatwo denaturacji cieplnej i powierzchniowej (podczas pienienia się roztworów) oraz inaktywują się w obecności soli metali ciężkich, dlatego też ich preparatykę przeprowadza się w buforach o pH ok. 7, w niskich temperaturach, stosując wodę podwójnie destylowaną i środki kompleksujące metale ciężkie oraz w razie potrzeby związki tiolowe. Rozpuszczalne enzymy - szczególnie te, które znajdują się w cytoplazmie - łatwo można ekstrahować wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli o wartościach pH oddalonych od ich punktu izoelektrycznego. Ekstrakcję enzymu przeprowadza się zwykle po rozdrobnieniu tkanek w homogenizatorze. Aby oddzielić enzymy mocno wbudowane w ziarnistości komórek oraz w kompleksy białkowe, lipidowe i wielocukrowe, trzeba stosować dodatkowo takie sposoby, jak zamrażanie i odtajanie, ekstrakcję butanolem, wprowadzenie środków zmniejszających napięcie powierzchniowe, np. detergentów itp. Metody oczyszczania i frakcjonowania enzymów są bardzo różnorodne i rozpuszczalnikami organicznymi, głównie acetonem, etanolem w niskiej temperaturze lub eterem. Zastosowanie ponadto chromatografii, elektroforezy czy ultrawirowania pozwala oczyścić prawie każdy enzym. Duże możliwości otrzymywania jednorodnych preparatów enzymatycznych stworzył rozwój chromatografii powinowactwa. Ostatnim etapem oczyszczania może być krystalizacja, której wielokrotne powtórzenie zwykle dostarcza preparatów o dużej aktywności. Enzymy typu albumin łatwo krystalizują przez dosycenie roztworów siarczanem amonu w odpowiedniej temperaturze i pH, a enzymy typu globulin można wykrystalizować przez dializę wobec wody. Niekiedy można spowodować krystalizację przez dodanie środka odciągającego wodę (etanol lub aceton).
Schemat doświadczenia Numer probówki 1 2 3 4 Substrat (2 ml) sacharoza woda laktoza skrobia Odczynnik (1 ml) odczynnik Benedicta Wynik próby (+ lub -)
Właściwa próba a) Przygotować 4 probówki. Do pierwszej należy dodać 2 ml 1% sacharozy, do drugiej 2 ml wody destylowanej, do trzeciej 2 ml 1% laktozy, do czwartej 2 ml 1% skrobi. b) Do każdej próbówki dodać 2 ml otrzymanej inwertazy i inkubować w 37oC przez 10 minut. c) Do każdej próbówki dodać 1 ml odczynnika Benedicta. d) Wstawić probówki do wrzącej wody (na ok. 5 min.).
Wyjaśnienie: Cukry redukujące redukują miedź (II) z odczynnika Benedicta do miedzi (I). Powstający w reakcji osad Cu 2 O ma różne zabarwienie (od zielonego, przez żółty do pomarańczowego, a nawet czerwonego), w zależności od stężenia cukrów redukujących w próbie. Zanotować i zinterpretować wyniki.
Wyniki zapisz w tabeli: Obecność cukrów redukujących w badanych próbkach po dodaniu inwertazy (+/-) Schemat doświadczenia Numer probówki 1 2 3 4 Substrat (2 ml) sacharoza woda laktoza skrobia Enzym (2 ml) inwertaza inwertaza inwertaza inwertaza Odczynnik (1 ml) odczynnik Benedicta Wynik próby (+ lub -)
Literatura:
- Praktikum z biochemii. Praca zbiorowa pod red. A. Dubina i B. Turyny. Instytut Biologii Molekularnej Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999.
- Ćwiczenia z biochemii. Praca zbiorowa pod red. L. Kłyszejko-Stefanowicz. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2003.
- Biochemia Harpera ilustrowana. Murray R., Granner D., Rodwell V. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2010.
- Ogólna technologia żywności. Pijanowski E., Dłużewski M., Dłużewska A., Jarczyk A. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 2004.