Jakościowa i ilościowa analiza nukleotydów o znaczeniu ..., Schematy z Chemistry

Pobierz Jakościowa i ilościowa analiza nukleotydów o znaczeniu ... i więcej Schematy w PDF z Chemistry tylko na Docsity!

Uniwersytet Warszawski

Wydział Fizyki

Dominika Strzelecka

Nr albumu: 292212

Jakościowa i ilościowa analiza nukleotydów

o znaczeniu biologicznym lub

terapeutycznym przy użyciu spektrometrii

mas

Praca doktorska

Praca wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Jacka Jemielitego i dr hab. Joanny Kowalskiej w Zakładzie Biofizyki Instytutu Fizyki Doświadczalnej Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego

Warszawa, 2020

Badania zrealizowano w ramach projektu Iuventus Plus, finansowanego ze środków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (0222/IP3/2015/73) oraz stypendium ETIUDA 7, finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki (UMO-2019/32/T/ST4/00073) i projektu PRELUDIUM 12, finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki (UMO-2016/23/N/ST4/03186)

Spis treści

3.4.1. Metody badania właściwości fizycznych nukleotydów i kwasów nukleinowych 40

5.3.3. Metody syntezy związków znakowanych izotopowo ........................................ 72 5.3.4. Widma fragmentacyjne niemodyfikowanych 5’-monofosforanów nukleozydów (NMP) 73 5.3.5. Widma fragmentacyjne niemodyfikowanych difosforanów i trifosforanów nukleozydów (NDP i NTP) .............................................................................................. 75 5.3.6. Wpływ modyfikacji fosforanu i rybozy na widma fragmentacyjne nukleotydów 77 5.3.7. Rozróżnianie nukleotydów izobarycznych i izomerycznych na podstawie ich widm fragmentacyjnych ................................................................................................... 78 5.3.8. Biblioteka nukleotydów i baza danych .............................................................. 80 5.3.9. Podsumowanie rozdziału i zastosowanie wiedzy dotyczącej fragmentacji nukleotydów ..................................................................................................................... 81

5.4. Badanie degradacji końca 5’ mRNA za pomocą spektrometrii mas ......................... 84

5.4.1. Koncepcja badań i schemat eksperymentu......................................................... 84 5.4.2. Synteza związków wzorcowych do analizy metabolizmu w ekstraktach .......... 86 5.4.3. Wybór warunków chromatograficznych, parametrów źródła jonów oraz par MRM 87 5.4.4. Analiza metabolizmu [D 3 ]m^7 GpppG w ekstrakcie ............................................ 87 5.4.5. Udział enzymów DcpS i Fhit w degradacji kapu ............................................... 88 5.4.6. Wpływ inhibitorów cNIIIB na degradacje [D 3 ]m^7 GMP .................................... 90 5.4.7. Badanie metabolizmu m^7 GDP i m^7 GTP z użyciem potencjalnych inhibitorów białek zaangażowanych w ich degradację ........................................................................ 91 5.4.8. Podsumowanie rozdziału i najważniejsze wnioski ............................................ 92

5.5. Analiza narzędzi molekularnych do badań komórkowych i zastosowań terapeutycznych .................................................................................................................... 94

5.5.1. Analiza pronukleotydów w ekstraktach komórkowych ..................................... 94 5.5.2. Monitorowanie postępu degradacji fluorescencyjnych sond molekularnych .... 98

5.6. Analiza składu końca 3’mRNA za pomocą spektrometrii mas ............................... 100

5.6.1. Koncepcja badań i schemat eksperymentu....................................................... 100 5.6.2. Zaprojektowanie i walidacja metody LC-MS/MS ........................................... 102 5.6.2.1. Wybór warunków chromatograficznych, ustalenie parametrów źródła jonów i par MRM ....................................................................................................... 103 5.6.2.2. Przygotowanie krzywych kalibracyjnych ................................................. 104 5.6.2.3. Optymalizacja warunków wyczerpującej degradacji enzymatycznej RNA 106 5.6.2.4. Analiza fragmentu RNA o ściśle zdefiniowanej strukturze ...................... 107

5.6.2.5. Analiza krótkich fragmentów RNA zawierających modyfikacje

5.6.5. RNA zawierające boranofosforan uwalniają AMPH jako produkt degradacji

Dorobek naukowy

Publikacje bezpośrednio związane z tematem pracy

 Strzelecka D. , Chmielinski S., Bednarek S., Jemielity J., Kowalska J., Analysis of mononucleotides by tandem mass spectrometry: investigation of fragmentation pathways for phosphate- and ribose-modified nucleotide analogues, 2017, Scientific Reports, 7, 8931

 Wanat P., Kasprzyk R., Kopcial M., Sikorski P.J., Strzelecka D. , Jemielity J., Kowalska J., ExciTides: NTPderived probes for monitoring pyrophosphatase activity based on excimer-tomonomer transitions, 2018, Chemical Communications, 54, 9773-

 Gołojuch S., Kopciał M., Strzelecka D. , Kasprzyk R., Baran N., Sikorski P.J., Kowalska J., Jemielity J., Exploring tryptamine conjugates as pronucleotides of phosphate-modified 7-methylguanine nucleotides targeting cap-dependent translation, 2020, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 28, 115523

 Strzelecka D. , Śmietański M., Sikorski P.J., Warmiński M., Kowalska J., Jemielity J., Phosphodiester modifications in mRNA polyA tail prevent deadenylation without compromising protein expression, 2020, RNA, 26, 1815-

 Strzelecka D. , Baranowski M., Bednarczyk M., Golojuch S., Kaczmarska K., Kozarski M., Kubacka D., Jemielity J., Kowalska J., Revisiting 7-methylguanosine cap degradation pathways using novel chemical and analytical tools sheds new light on concerted action of DcpS, Fhit, and cNIIIB in ‘cap-tabolism’ – w przygotowaniu

Pozostałe publikacje

 Strzelecka D. , Holman S., Eyers C., Evaluation of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a mobile phase additive during top 3 label-free quantitative proteomics, 2015, International Journal of Mass Spectrometry, 391, 157-

 Marchand A., Strzelecka D ., Gabelica V., Selective and Cooperative Ligand Binding to Antiparallel Human Telomeric DNA G-Quadruplexes, 2016, Chemistry - A European Journal, 22, 28, 9551-

 Strzelecka D. , Chmieliński S., Bednarek S., Jemielity J., Kowalska J., Exploring fragmentation pathways of mononucleotides by ESI MS/MS: towards improved identification and quantification of therapeutically relevant nucleotide analogues, poster, Mass Spectrometry Application to the Clinical Lab, Salzburg, Austria (12- 15.09.2016)

 Strzelecka D. , Chmieliński S., Jemielity J., Kowalska J., Investigation on fragmentation pathways of nucleotides and their derivatives using tandem mass spectrometry, poster, Euroanalysis 2015 The European Conference on Analytical Chemistry, Bordeaux, Francja (6-10.09.2015)

Wykaz wybranych skrótów

A/Am – adenozyna / 2’- O -metyloadenozyna

AcONH 4 – octan amonu

AMP – 5’-monofosforan adenozyny

AMPS – 5’-tiofosforan adenozyny

ATP – 5’-trifosforan adenozyny

cAMP – cykliczny 5’,3’-monofosforan adenozyny

CDP - 5’-difosforan cytozyny

CID – ang. collision-induced dissociation – dysocjacja indukowana kolizyjnie

CTP – 5’-trifosforan cytozyny

DcpS – ang. Deccaping Scavenger Enzyme – enzym zaangażowany w degradację kapu

DMF – diemtyloformamid

DMSO – dimetylosulfotlenek

DNA – ang. deoxyribonucleic acid – kwas deoksyrybonukleinowy

Fhit – ang. fragile histidine triad protein – enzym zaangażowany w degradację

dinukleotydów

GMP – 5’-monofosforan guanozyny

LC – ang. Liquid chromatography – chromatografia cieczowa

LC-MS/MS - ang. Liquid chromatography tandem mass spectrometry – chromatografia

cieczowa połączona ze spektrometrią mas

m^7 GMP – 5’-monofosforan 7-metyloguanozyny

mRNA – ang. messenger RNA – informacyjny RNA

PNP – ang. purine nucleoside phosphorylase – fosforylaza nukleozydów purynowych

RNA – ang. ribonucleic acid – kwas rybonukleinowy

SVPDE – ang. snake venom phosphodiesterase – fosfodiesteraza z jadu węża

metody, która pozwoliłaby na określenie wydajności wbudowywania modyfikowanych nukleotydów w obręb struktury RNA, w szczególności do ogona poli(A), jak również poznanie preferencji substratowych polimeraz używanych do transkrypcji in vitro. Metoda LC-MS/MS polegała na oznaczaniu ilościowym 5’-monofosofranów nukleozydów otrzymanych po trawieniu enzymatycznym niemodyfikowanego lub modyfikowanego mRNA. Po dokonaniu operacji matematycznych możliwe było wyznaczenia zawartości modyfikacji oraz wyznaczenie długości ogona poli(A). Dzięki tej metodzie pokazano, że analogi ATP są substratami dla polimeraz RNA, co umożliwia wprowadzanie modyfikacji do wiązań fosfodiestrowych RNA. Proces wbudowywania analogów ATP zachodzi stereospecyficznie, dzięki czemu konfiguracja absolutna modyfikowanych wiązań fosfodiestrowych jest ściśle zdefiniowana w produktach RNA. Może to być wykorzystane do tworzenia cennych narzędzi molekularnych. Otrzymane i scharakteryzowane mRNA zostały poddane badaniom biologicznym, które wykazały, że mRNA zawierające modyfikację tiofosforanową w obrębie ogona poli(A) są odporne na degradację enzymatyczną, a jednocześnie obecność tych modyfikacji nie wpływa na wydajność translacji. Opracowane metody do analizy nukleotydów i RNA pozwolą na lepsze poznanie właściwości, potencjału biologicznego oraz terapeutycznego tych cząsteczek, jak również przyczynią się do projektowania nowych związków, które mają szanse w przyszłości stać się skutecznymi lekami.

1.2. Abstract

Nucleotides play many important roles in living organisms. Synthetic nucleotide analogues exert often anticancer or antiviral properties. Also they can act as biological tool to monitor processes in cell. They serve as monomeric units of the nucleic acid including messenger RNA (mRNA), which is crucial in gene expression process. mRNA carries codes from the DNA in the nucleus to the sites of protein synthesis in the cytoplasm. On the 5’ end of eukaryotic mRNA cap structure is presented. Cap regulates crucial processes such as mRNA maturation, nuclear export, initiation of translation and degradation. 5’cap analogues influence mRNA stability but also modification within 3’ end (poly(A) tail) may improve mRNA properties. Modified mRNA is widely studied and may be used in gene therapy. Therefore detection, identification, and quantitation of natural nucleotides, nucleic acids and their analogues combined with deciphering their metabolic pathways are instrumental in understanding natural metabolic processes as well as disease diagnostic and discover their therapeutic properties. First part of this project focused on the qualitative analysis of nucleotides by tandem mass spectrometry (or MS/MS) – a technique that enables controlled fragmentation of molecules. The goal was to apply mass spectrometry to understand fragmentation pathways of nucleotides, to elaborate general rules of fragmentation, and propose possible fragmentation pathways. To this end, over 150 nucleotides including natural nucleotides and their base-, ribose-, and phosphate-modified analogues, among them several compounds of therapeutic interest, were investigated. The careful analysis of the fragmentation spectra enabled distinguishing between structurally related isomers and isobars and determine both the type and the position of the modification. The results of MS/MS were collected in a database available in public domain (http://mstide-db.com) – arguably the first MS database for this class of compounds. The database might be used in studying drug and prodrug metabolism, try to discover new natural nucleotide modifications and biomarkers, as well as perform chemical synthesis of nucleotide analogues and to develop quantitative LC-MS/MS methods. The results obtained during first stage of the project were used to develop LC-MS/MS method to analyse nucleotides fluorescence probes, dinucleotides and mRNA. The methods enabled analysis of mRNA cap and cap analogues degradation in cell extracts provided insights into cap metabolism, and thereby, mRNA turnover. Moreover selective inhibitors of particular cap degradation steps were used. The inhibitors were developed in our group to investigate the interdependence of various cap degradation pathways and identify metabolites with key biological importance. In the next stage of this project an LC- MS/MS method for quantitative assessment of incorporation of ATP analogues modified at the α-phosphate into transcripts by RNA polymerases was developed and improved. The results showed that polymerases evince similar incorporation efficiency towards ATP and its analogues however they recognise only one stereoisomer. Furthermore incorporation of ATP analogues is stereospecific so absolute configuration of the product is strictly defined what can be used to create new biological tools. Also, mRNA with modified poly(A) tail was obtained. Experiments showed that phosphodiester modifications in mRNA poly(A) tail prevent deadenylation without compromising protein expression.

2. CELE PROJEKTU i KONCEPCJA PRACY

Ogólnym celem badań będących podstawą niniejszej rozprawy doktorskiej było opracowanie uniwersalnych metod opartych na tandemowej spektrometrii mas, pozwalających na analizę jakościową i ilościową nukleotydów, oligonukleotydów, ich syntetycznych analogów oraz kwasów nukleinowych o potencjale biologicznym lub terapeutycznym. Projekt składał się z dwóch głównych części. Pierwsza część dotyczyła jakościowej analizy nukleotydów, natomiast druga badania nukleotydów w próbkach biologicznych takich jak ekstrakty komórkowe czy mieszaniny po reakcjach enzymatycznych.

Celem badań jakościowych nukleotydów było:

 otrzymanie widm fragmentacyjnych (MS/MS) szerokiego zestawu nukleotydów i ich syntetycznych analogów,  poznanie ścieżek fragmentacji nukleotydów i ich syntetycznych analogów,  sformułowanie ogólnych reguł rządzących procesem fragmentacji,  przygotowanie bazy danych dostępnej online dla szerokiego grona odbiorców.

Ta część projektu oraz przygotowana baza danych ma znaczenie w identyfikacji metabolitów leków będących pochodnymi nukleotydów, poszukiwaniu nowych naturalnych modyfikacji nukleotydów, szybkiej identyfikacji produktów syntezy chemicznej oraz w projektowaniu metod LC-MS/MS, co było celem drugiej części.

Celem drugiej części było:  zaprojektowanie metod LC-MS/MS do analizy metabolizmu pronukleotydów, nukleotydów, analogów nukleotydów, w tym analogów końca 5’mRNA w ekstraktach komórkowych, badanie ich stabilności oraz identyfikacja metabolitów;  zweryfikowanie wpływu, na metabolizm mRNA, znanych oraz nowych inhibitorów białek zaangażowanych w proces degradacji kapu, przy użyciu zaprojektowanej metody;  weryfikacja znanych z literatury ścieżek degradacji mRNA;  zaprojektowanie metody LC-MS/MS służącej do analizy efektywności wbudowywania analogów ATP przez polimerazy RNA w obrębie RNA, w szczególności ogona poli(A);  zweryfikowanie specyficzności substratowej polimeraz RNA;  analiza składu modyfikowanych mRNA otrzymywanych w reakcji transkrypcji in vitro w zależności od składu mieszaniny reakcyjnej;  powiązanie struktury analogów mRNA z ich funkcją i potencjałem terapeutycznym.

Podsumowując, celem niniejszej rozprawy doktorskiej było zaprojektowanie zestawu metod opartych na spektrometrii mas do analizy nukleotydów oraz analizy końca 3’ i 5’ mRNA. Zastosowanie tych metod przyczyni się do kompleksowego poznania kluczowych elementów struktury mRNA. Co więcej, została przygotowana danych, która może być użyta w szerokim kontekście poszukiwania modyfikowanych nukleotydów w próbkach biologicznych.