Pobierz Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii ... i więcej Ćwiczenia w PDF z Biotechnologia tylko na Docsity!
ANNA RASZKA, ALEKSANDRA ZIEMBIŃSKA, ANNA WIECHETEK∗
METODY I TECHNIKI BIOLOGII MOLEKULARNEJ
W BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ
MOLECULAR BIOTECHNOLOGY TECHNIQUES
AND METHODS IN ENVIRONMENTAL BIOTECHNOLOGY
S t r e s z c z e n i e
W ostatnich latach pojawiło się dużo różnorodnych metod pozwalających na analizę składu biocenozy oraz rozmieszczenia przestrzennego mikroorganizmów. Metody molekularne gó- rują nad tradycyjnymi technikami, gdyż nie są uzależnione od hodowli mikroorganizmów na podłożach mikrobiologicznych. Jest to ważna cecha metod analitycznych, ponieważ przyspie- sza to całą procedurę badawczą. Dodatkowo metody oparte na analizie materiału genetycz- nego charakteryzują się dużą czułością i powtarzalnością. W artykule opisano metody najczę- ściej wykorzystywane w biotechnologii środowiskowej. Słowa kluczowe : reakcja PCR , elektroforeza , klonowanie DNA , sekwencjonowanie DNA , hy- brydyzacja DNA , białka GFP
A b s t r a c t
During last several years a wide variety of methods useful in the analyzing of biocenosis’ composition and spatial microorganisms distribution appeared. A significant aspect of molecular techniques usage is its independence from traditional microbiological methods. It is an important analytical feature, because it enables a speedier research. Additionally, methods based on genetic material are more sensitive and repeatable. This article contains the description of the techniques of the most commonly used in environmental biotechnology. Keywords : PCR, electrophoresis , DNA cloning , DNA sequencing , DNA hybridization , GFP
∗ (^) Dr inż. Anna Raszka, dr Aleksandra Ziembińska, mgr Anna Wiechetek, Katedra Biotechnologii
Środowiskowej, Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki, Politechnika Śląska.
1. Wstęp
Zgłębianie tajników wielu dziedzin naukowych jest z racji przyspieszonego rozwoju technik badawczych oparte na analizie ich najbardziej elementarnych podstaw. Dzięki udoskonaleniu metod analitycznych w dziedzinach składających się na tę interdyscypli- narną gałąź wiedzy biotechnologia środowiskowa ma szansę na szybki rozwój. W bada- niach biotechnologii środowiskowej na szczególną uwagę zasługują metody biologii mole- kularnej, które pozwalają na poznawanie procesów biologicznych wykorzystywanych w skali technologicznej na poziomie materiału genetycznego. Zakres zagadnień, jakie obejmuje biotechnologia środowiskowa dotyczy zastosowania biotechnologii (a więc technologii, których sercem jest metabolizm mikroorganizmów) w ochronie i inżynierii środowiska. Dotyczy zatem m.in. oczyszczania różnego rodzaju ścieków i unieszkodliwiania powstających odpadów. Istotę technologii wykorzystywanej do eliminacji zanieczyszczeń stanowią bakterie (najczęściej, ale mogą to także być inne organizmy, np. grzyby), które są wyposażone w odpowiedni aparat enzymatyczny zdolny do biotransformacji lub biodegradacji zanieczyszczeń zawartych w ściekach lub w odpa- dach. Ze względu na zróżnicowany skład ścieków lub odpadów i ich niejednorodność, charakteryzującą się zmiennością zarówno co do rodzaju zawartych zanieczyszczeń, jak i ich stężeń, często niezbędne jest współdziałanie co najmniej kilku różnych gatunków mi- kroorganizmów. Zatem wykorzystuje się tutaj nie czyste szczepy bakteryjne (jak np. w bio- technologii farmaceutycznej), ale kultury mieszane. W ostatnich latach pojawiło się dużo różnorodnych metod umożliwiających analizę składu biocenozy oraz rozmieszczenia przestrzennego mikroorganizmów wewnątrz sku- pisk, takich jak np. kłaczki osadu czynnego czy błona biologiczna, co pozwala na zbadanie ich właściwości i funkcjonowania. Nowo dostępna wiedza jest efektywnie wykorzystywana do tworzenia i doskonalenia modeli matematycznych sterujących konkretnym procesem biologicznym. Pomimo ogromu możliwości, jakie dają techniki molekularne, wielu scepty- ków neguje ich przydatność w ochronie środowiska, argumentując swoje stanowisko zbęd- nością sprowadzania badań jedynie do poziomu biologii komórki. Nasuwa się uwaga, czy nie lepiej i ekonomiczniej jest wprowadzać więcej danych i sprawdzonych parametrów do tworzonych modeli matematycznych, aniżeli doświadczalnie modyfikować model? Metody molekularne mają istotną przewagę nad tradycyjnymi technikami, gdyż nie są uzależnione od hodowli mikroorganizmów na podłożach mikrobiologicznych. Jest to ważna cecha, która pozwala na przyspieszenie procedury badawczej. Dodatkowo metody oparte na analizie materiału genetycznego charakteryzują się dużą czułością i powtarzalnością. Celem artykułu nie jest przedstawienie czytelnikowi szczegółowych opisów omawia- nych metod molekularnych stosowanych w biotechnologii środowiskowej, ale jedynie zapoznanie z ich możliwościami i wymaganiami w stosowaniu. Dostępność metod biologii molekularnej jest obecnie dość szeroka i często wybór odpowiedniej techniki oraz dotarcie do polskojęzycznych podstaw teoretycznych może stanowić jedną z pierwszych trudności. W związku z tym niniejszy artykuł może posłużyć jako pomoc inżynierom (i nie tylko), którzy rozpoczynają badania opierające się na zdobyczach dotychczasowej wiedzy z zakresu biologii molekularnej.
Istnieje co najmniej kilka modyfikacji reakcji PCR, dających nowe możliwości badaw- cze (tab. 1). 2.2. Elektroforeza żelowa [1, 5–7, 10]
Techniki elektroforetyczne wykorzystują zdolność migracji cząsteczek białek lub kwa- sów nukleinowych w żelach. Zarówno białka, jak i kwasy nukleinowe mają silny ładunek ujemny, wobec czego w polu elektrycznym przemieszczają się w kierunku od anody do katody. Stosowane w badaniach żele stanowią włóknistą sieć, która ogranicza swobodną migrację. Szybkość przemieszczania się białka czy DNA/RNA w żelu zależy od ładunku, wielkości i kształtu cząsteczki. Najszybciej poruszają się cząsteczki małe i nierozgałęzione. W zależności od rodzaju zastosowanego żelu (agarozowy lub poliakrylamidowy) i jego stężenia zmienia się zakres rodzaju cząsteczek, które można rozdzielić. W żelu agarozowym rozdzielić można cząsteczki o wielkości 5–5000 pz (par zasad), z zastrzeżeniem, że w porównaniu z żelem poliakrylamidowym siła rozdziału jest stosun- kowo niska. W tym ostatnim bardzo dokładnie rozdzielane są cząsteczki od 50 do 1500 pz. Jednak praca z poliakrylamidem jest trudniejsza (żele są cieńsze i szybciej polime- ryzują), a sam związek jest silną neurotoksyną. Istnieje kilka odmian elektroforez (tab. 2) ważnych z punktu widzenia badań nad mikroorganizmami w postaci czystych szczepów i mieszanin. T a b e l a 1
Modyfikacje reakcji PCR
“nested PCR”
Tak zwany „gniazdowy” PCR (inne nazwy to także zagnieżdżony lub wewnętrzny PCR) polega na przeprowadzeniu zwykłej reakcji PCR, a następnie powtórne przeprowadzenie reakcji PCR z drugą parą starterów (determinujących własny profil termiczny), które zlokalizowane są bliżej środka powielanego fragmentu DNA. Pozwala to na zwiększenie specy- ficzności wyniku [8].
„Multiplex PCR”
Modyfikacja polegająca na namnażaniu jednocześnie kilku fragmentów DNA, używając w tej samej reakcji kilku par starterów. Technika pozwala przyspieszyć badanie większych obszarów DNA z jednoczesną kontrolą poprawności prowadzonego procesu.
PCR w czasie rzeczywistym (ang. real-time PCR)
Reakcja PCR w czasie rzeczywistym to reakcja amplifikacji DNA, któ- rego ilość jest monitorowana podczas przebiegu reakcji dzięki obecności w mieszaninie reakcyjnej barwników lub sond fluorescencyjnych. Barw- niki, łącząc się z kwasem nukleinowym, emitują sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do ilości produkowanego DNA [2]. Do zalet tej techniki należą duża czułość oraz szybkość wykonania. Jej zastosowanie pozwala na określenie względnej i bezwzględnej ilości matrycy, pomiar poziomu ekspresji genu, określenie liczby kopii genu i rozróżnianie alleli.
RT-PCR (ang. Reverse transcriptase PCR)
Odmiana PCR, w której matrycą jest mRNA. Do namnażania mRNA używa się enzymu zwanego odwrotną transkryptazą. Następnie uzyskane w ten sposób cDNA amplifikuje się z użyciem tradycyjnego PCR. Reak- cja ta ma znacznie większą czułość w stosunku do tradycyjnego PCR [9].
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego (DGGE, ang. Denaturing Gra- dient Gel Electrophoresis ) i w gradiencie temperatury (TGGE, ang. Temperature Gradient Gel Electrophoresis ) są metodami pierwotnie projektowanymi do wykrywania pojedynczych mutacji w genetycznym materiale ludzkim. Równie świetnie sprawdzają się w badaniach prób środowiskowych, czyli w rozdziale produktów PCR, w których wystę- puje mieszanina mikroorganizmów. Zastosowanie znalazły elektroforezy poliakrylami- dowe, w których wykorzystywano: rosnące stężenie mocznika w DGGE oraz gradient tem- peratury w TGGE jako czynnik denaturujący strukturę DNA. Cząsteczki DNA o różnej sekwencji, a zatem – różnej temperaturze topnienia, migrując w rosnącym stężeniu związku denaturującego (lub gradiencie temperatury), zatrzymują się na różnej wysokości. Ze względu na różnicę w sekwencji uzyskuje się w żelu tzw. finger- print , czyli wzór rozdziału mieszaniny na prążki, z których każdy odpowiada innemu frag- mentowi namnożonego DNA. Elektroforeza w pulsującym polu elektrycznym. Całe genomowe DNA czystych szczepów, poddane uprzednio pocięciu DNA enzymami restrykcyjnymi i zatopione w aga- rozie, można rozdzielić metodą elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym (PFGE, ang. Pluse Field Gel Elekctrophoresis ) [11]. Technika umożliwia precyzyjny rozdział du- żych cząstek DNA dzięki zastosowaniu pulsującej zmiany kierunku przepływu prądu. Czą- steczka DNA ze względu na okresowe zmiany kierunku działania prądu wędruje „zygza- kiem”, co umożliwia jej precyzyjny rozdział [12].
2.3. Klonowanie DNA [5, 13]
Klonowanie, podobnie jak reakcja PCR, pozwala na powielenie genów. W tym jednak wypadku wykorzystuje się bakteriofagi (wirusy bakteryjne) lub plazmidy (małe, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA występujące u bakterii). Stanowią one swego rodzaju noś- nik genu, który chcemy powielić i mają zdolność do samoreplikacji. Nośnik taki nazywany jest wektorem. Zdolność do samoreplikacji jest bardzo ważnym czynnikiem, ponieważ samo wprowa- dzenie DNA do komórki bakteryjnej nie powoduje jego powielenia i w normalnych warun- kach większość fragmentów wprowadzonego DNA szybko ulega degradacji przez nukleazy. Zabieg klonowania można przeprowadzić, jeśli DNA poddawany klonowaniu został rozcięty enzymem restrykcyjnym, tak aby otrzymać kohezyjne końce w miejscu rozcięcia. Końce kohezyjne mają fragmenty jednoniciowe (tzw. lepkie końce), umożliwiające przyłą- czenie innego fragmentu DNA zawierającego komplementarne lepkie końce. W sytuacji, gdy fragment ma końce tępe (czyli takie, które nie zawierają wystającego fragmentu jednej nici DNA), konieczne jest zastosowanie odpowiedniego enzymu restrykcyjnego zarówno na fragment DNA, który chcemy powielić, jak i na wektorowy DNA, aby umożliwić połą- czenie tych cząstek w procesie ligacji, z użyciem enzymu zwanego ligazą. W wyniku liga- cji powstaje hybryda będąca kolistym DNA złożona z DNA plazmidowego (lub fagowego) z wbudowanym fragmentem wprowadzonego DNA. Tak przygotowany wektor wprowadza się do komórek bakteryjnych w procesie transformacji (najczęściej wykorzystuje się tutaj kompetentne, czyli zdolne do transformacji komórki E.coli ), gdzie może dojść do replika- cji, czyli namnożenia powstałej hybrydy. Na tym etapie ważna jest umiejętność znalezienia poszukiwanego genu w powstałej mieszaninie zawierającej także DNA wektora i bakterii. Aby selekcja komórek zawierających hybrydę była możliwa, najczęściej stosuje się wektory
żanie, ponieważ w pozycji 3’ nie mają grupy hydroksylowej, niezbędnej do utworzenia wiązania z kolejnym nukleotydem. Otrzymane w tej metodzie cząsteczki DNA rozdziela się w żelu poliakrylamidowym, a położenie prążków świadczy o rozmiarach uzyskanych fragmentów DNA. Dla rozwoju techniki sekwencjonowania istotna okazała się możliwość znakowania fluorescencyjnego dideoksyrybonukleotydów, z których każdy wyznakowany jest innym fluo- roforem, co umożliwia prowadzenie reakcji terminacji w jednej probówce. Dzięki zdolności detektora fluorescencyjnego do rozróżniania poszczególnych znaczników fluorescencyjnych, można wprowadzać na jedną ścieżkę w żelu poliakrylamidowym cząsteczki wyznakowane różnymi fluoroforami. Pomimo postępu automatyzacji sekwencjonowania DNA istotną wadę standardowych procedur stanowiły ograniczenia dotyczące długości sekwencji od- czytywanej w jednym eksperymencie. Szybsze uzyskiwanie sekwencji osiągnięto przez zastosowanie rozdziału cząsteczek w specjalnych kapilarach. Do zalet sekwencjonowania z zastosowaniem kapilar zaliczono: możliwość wymieniania polimeru rozdzielającego pomiędzy kolejnymi elektroforezami bez potrzeby rozmontowywania urządzenia, łatwość nakładania próbek, a także możliwość równoczesnej analizy kilkudziesięciu prób przy odpowiednim zagęszczeniu kapilar. Jedną z metod pozwalających na dalsze zwiększenie efektywności sekwencjonowania jest pirosekwencjonowanie, które nie wymaga elektroforezy ani innej formy rozdzielania fragmentów DNA, bowiem w czasie syntezy nowej nici rejestrowana jest kolejność wbu- dowywanych nukleotydów, co umożliwia bezpośrednie, zautomatyzowane odczytanie sekwencji powstającej nici. Ponadto do mieszaniny reakcyjnej dodawane są dideoksyrybo- nukleotydy, a ich kolejne przyłączanie do polimeryzowanej nici wiąże się z uwolnieniem cząsteczki pirofosforanu, której przekształcenie za pomocą enzymu – sulfurylazy daje błysk światła będący wynikiem chemiluminescencji.
2.5. Hybrydyzacja in situ [1, 5, 16, 17]
Hybrydyzacja in situ jest techniką, w której łączy się krótki fragment DNA lub RNA o znanej sekwencji (tzw. sondę) z materiałem genetycznym zawartym w badanej próbie, o sekwencji komplementarnej do sondy. W celu zidentyfikowania hybrydy sondy znakuje się. Ze względu na różne sposoby prowadzenia hybrydyzacji wyróżnia się kilka jej typów:
- Hybrydyzacja typu Southern Blot. Do lokalizacji konkretnej sekwencji DNA na żelu po elektroforezie wykorzystuje się hybrydyzację typu Southern. Polega ona na dyfuzyjnym przenoszeniu DNA z żelu na dogodniejszy nośnik, membranę nitrocelulo- zową lub nylonową, którą inkubuje się ze znakowanymi izotopowo sondami o sekwencji komplementarnej do poszukiwanego fragmentu. Zdjęcie rentgenowskie membrany pozwala zlokalizować poszukiwaną sekwencję. - Hybrydyzacja typu Northern Blot. Hybrydyzacja typu Northern, zwana też elektrofo- retyczno-hybrydyzacyjną detekcją transkryptów, jest metodą poszukiwania sekwencji RNA z użyciem znakowanych radioaktywnie sond DNA. Metoda pozwala na badanie aktywności pojedynczych genów. - Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Nazwa tej metody pochodzi od ang. fluorescent in situ hybrydization , w skrócie FISH. Metoda ta służy do wykrywania określonej sekwencji DNA w badanym materiale za pomocą znakowanej sondy oligonukleo- tydowej. Identyfikacja hybrydy polega na identyfikacji znakowanych sond, które
wchodzą w skład hybrydy. Sondy znakowane są znacznikami fluorescencyjnymi, a ich obecność w próbce obserwuje się, stosując mikroskop fluorescencyjny. Sondy można zaprojektować samodzielnie na podstawie wcześniejszej analizy materiału gene- tycznego. Takie rozwiązanie stosuje się wówczas, gdy nie istnieje jeszcze sonda dla poszukiwanej sekwencji. Zaprojektowanie sondy wymaga zaawansowanej wiedzy z zakresu biologii molekularnej, przy czym dostępność sond oraz baz danych o sondach i sposobie ich zastosowania jest bardzo szeroka. Próbki środowiskowe mogą zawierać elementy obdarzone zdolnością do „świecenia” pod wpływem promieniowania UV (tzw. autofluorescencja). Z tego względu niezbędne są badania wstępne mające na celu określenie wielkości autofluorescencji. Dlatego wykonuje się hybrydyzację próbki bez zastosowania sondy oraz z użyciem tzw. sondy nonsensownej, która nie wiąże prokariotycznego RNA. Sonda nonsensowna (ang. nonsense probe ) to sonda stanowiąca sekwencję DNA, która nie ma sekwencji komplementarnej wśród organizmów prokariotycznych. Prowadząc analizy metodą FISH w celu identyfikacji docelowego organizmu, należy wykorzystać co najmniej dwie różne sondy, aby umożliwić zidentyfikowanie artefaktów i potwierdzić, że zidentyfikowana sekwencja (specyficzna dla danego organizmu) jest sekwencją poszukiwaną. I tak na przykład, by identyfikować gatunek Kuenenia stutgartiensis , aktywny w procesie anammox, należało zastosować sondę charakterystyczną dla grupy bakterii anammox (np. sondę Amx820) oraz sondę zawierającą sekwencję charakterystyczną dla tego gatunku. Sygnał fluorescencyjny z obydwu sond pozwoli na jednoznaczną identyfikację tego gatunku. T a b e l a 3
Modyfikacje FISH [17]
CARD-FISH (CARD – z ang. Catalysed Reporter Deposition )
Metoda stosowana, gdy ilość rybosomów w próbce jest zbyt mała, co uniemożliwia detekcję komórek docelowych. W metodzie tej sygnał zostaje wzmocniony dzięki użyciu HRP (peroksydaza chrzanowa, ang. horseradish peroxidase ) i tyramidu (and. Tyramide Signal Amplification ).
Clone-FISH
Metoda stosowana wówczas, gdy konieczne jest zaprojektowanie sondy a organizm docelowy jest niedostępny, oraz przeszukiwanie biblioteki genów ze względu na czasochłonność i kosztowność zostaje wykluczone. Metoda polega na wywołaniu ekspresji docelowego genu 16S rRNA w E.coli , a następnie detekcji za pomocą FISH. Stanowi ona bardzo dobre narzędzie do zaprojektowania sondy. Cat-FISH Podobnie jak Clone-FISH stosowana w celu zaprojektowania sondy. RING-FISH (ang. Recognition of INdividual Genes in a single bacterial cell )
Stosowana ze względu na zbyt małą czułość techniki FISH do identyfi- kacji pojedynczych genów.
FISH-MAR (ang. FISH- -microautoradiography )
Połączenie dwóch metod in situ : FISH i mikroautoradiografii. Mi- kroautoradiografia polega na znakowaniu radioizotopowym substratów organicznych i nieorganicznych (np. 3 H, 14 C, 35 S, 33 P), których umiej- scowienie określa się następnie za pomocą obserwacji mikroskopo- wych. W tandemie z FISH pozwala na określenie poboru przez poszczególne mikroorganizmy badanych substratów zawartych w próbce.
Masa cząsteczkowa białka wynosi ok. 27 kDa, a struktura przyjmuje formę β-baryłki. Poszczególne harmonijki układają się względem siebie antyrównolegle, formując ściany zwartego cylindra. Po obu stronach baryłki łańcuch polipeptydowy tworzy pętle zabezpie- czające wnętrze struktury, która zawiera grupę fluoroforową. Na podstawie wyników badań dotyczących właściwości spektralnych GFP pochodzącego z Aequorea victoria stwier- dzono, Ŝe widmo absorpcji ma dwa maksima – główne przy 395 nm i dodatkowe przy 470 nm, natomiast widmo fluorescencyjnej emisji ma jedno maksimum przy 509 nm [19, 20].
Rys. 1. Schemat mechanizmu bioluminescencji Fig. 1. Scheme of bioluminescence mechanism
Modyfikacje białka dotyczące struktury molekularnej białka GFP, głównie poprzez wprowadzanie przypadkowych mutacji, ułatwiły i rozszerzyły jego wykorzystanie w bada- niach biologicznych. Opracowano sposoby zwiększenia intensywności fluorescencji GFP oraz dokonano zmian w długości emitowanego światła, czyli barwy światła, w jakim zmu- towane białka świecą [20]. Obecnie najpowszechniejszą formą wykorzystania GFP jest badanie lokalizacji białek w komórkach [21]. W tym celu projektuje się tzw. białka fuzyjne. Powstają one w wyniku transkrypcji i translacji sekwencji DNA, składającego się z cDNA GFP i genu kodującego badane białko. Dzięki łatwej wizualizacji moŜliwe jest śledzenie zmian lokalizacji bada- nych białek pod wpływem róŜnych czynników. GFP stosuje się równieŜ jako gen reporte- rowy, słuŜący do monitorowania poziomu ekspresji genów [22]. Doniesienia zawarte w literaturze przedmiotu z ostatnich lat wskazują, Ŝe białko GFP coraz częściej znajduje zastosowanie w biotechnologii środowiskowej [19]. W związku z łatwą wizualizacją znakowanych mikroorganizmów dzięki mikroskopii fluorescencyjnej oraz ze względu na liczne zalety, które przedstawiono w tab. 4 białko to moŜe być wyko- rzystywane do badania dynamiki rozmnaŜania i/lub przestrzennej lokalizacji bakterii w róŜnych środowiskach, m.in. takich, jak gleba, biofilm czy osad czynny. Znakowane genem gfp mikroorganizmy mogą posłuŜyć do monitorowania procesu bio- remediacji skaŜonych gleb [23]. Wiele przeprowadzonych dotąd badań dotyczyło wpływu węglowodorów aromatycznych na ilość, zdolność przeŜycia i przestrzenne rozmieszczenie
bakterii zdolnych do rozkładu tych związków. Metoda znakowania genem gfp może być zastosowana do badania rozmieszczenia poszczególnych gatunków, a także może posłużyć do monitorowania zmian zachodzących w zespołach bakteryjnych tworzących biofilmy [24]. Technika znakowania genem gfp pozwala na obserwowanie zależności między po- szczególnymi gatunkami bakterii, dzięki czemu możliwe jest ustalenie właściwości bio- filmu i podjęcie prób jego modyfikacji na potrzeby danego procesu. T a b e l a 4
Zalety oraz wady wykorzystywania GFP jako znacznika w badaniach środowiskowych [20]
ZALETY
- łatwość detekcji – do wykrycia ekspresji nie potrzeba egzogennych substratów, kofaktorów lub energii chemicznej,
- możliwość monitorowania pojedynczych komórek bakteryjnych,
- niska destruktywność – detekcja może odbywać się bez niszczenia struktur złożonych z mikroorganizmów,
- wykrywanie znaczonych komórek odbywa się bez ich wcześniejszego barwienia,
- możliwość detekcji on-line bądź w czasie rzeczywistym,
- stabilność sygnału: GFP jest odporne na denaturację termiczną i utrzymuje fluorescencję do temperatury ok. 65 °C, GFP wykazuje odporność na denaturację chemiczną i wykazuje fluorescencję w zakresie pH 6–12, GFP ze względu na zwartą strukturę nie ulega działaniu wielu enzymów proteolitycznych, m.in. trypsyny, chymotrypsyny, subtylizyny, papainy aż do stężenia 1 mg/ml, GFP poddane działaniu bardzo wysokiego ciśnienia, aż do 600 MPa (ok. 6 tys. atmosfer), w dalszym ciągu utrzymuje stały poziom fluorescencji,
- minimalny wpływ na dynamikę procesów zachodzących na powierzchni komórek ze względu na ekspresję GFP zachodzącą w cytoplazmie,
- ciągła synteza GFP w komórkach – minimalne obniżenie sygnału fluorescencji podczas bakte- ryjnej replikacji,
- możliwość detekcji sygnału pochodzącego z żywych komórek – powtarzalne odczyty w tych samych warunkach dla tych samych komórek,
- brak tła emitowanego przez autochtoniczne populacje bakteryjne zakłócającego detekcję,
- możliwa podwójna detekcja ze znacznikami emitującymi światło o innych długościach fal (innego koloru). WADY
- niezbadana zmienność ekspresji GFP w komórkach różnych gatunków,
- niestabilność plazmidów zawierających geny kodujące GFP (bardziej stabilne są inserty wpro- wadzone w chromosom bakteryjny – w ten sposób możliwe jest obniżenie ryzyka transferu genu kodującego GFP do genomów bakterii autochtonicznych),
- niezbadany wpływ czynników środowiskowych na ekspresję GFP,
- możliwość zakłócenia sygnału emitowanego przez GFP przez inne cząsteczki wykazujące zdolność fluorescencji w komórkach bakterii,
- brak zdolności GFP do emitowania sygnału w warunkach beztlenowych,
- potrzeba wyznaczenia czasu życia komórkom zawierającym gen kodujący GFP.
[4] M o r e i r a D., Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations , Nucleic Acids Research 26(13), 1998, 3309-3310. [5] W ę g l e ń s k i P. (red.), Genetyka molekularna , PWN, Warszawa 2006. [6] D o v i c h N.J., DNA sequencing by capillary electrophoresis , Electrophoresis 18, 1997, 2393-2399. [7] D o l n i k V., DNA sequencing by capillary electrophoresis (review) , J. Biochem. Biophys. Methods 41, 1999, 103-119. [8] K o w a l c h u k G.A., N a o u m e n k o Z.S., D e r i k x P.J.L., F e l s k e A., S t e p h e n J.R., A r k h i p c h e n k o I.A., Applied Environmental Microbiology 65(2), 1999, 396-403. [9] W i l l i a m s J., K u b e l i k A., L i v a k K., R a f a l s k y J., T i n g e y S., DNA poly- morphism amplified by arbitrary primers are useful genetic markers , Nucleid Acids Res. 18, 1990, 7213-7218. [10] H a m e s B., H o o p e r N., H o u g h t o n J., Krótkie wykłady z biochemii , PWN, Warszawa 2002. [11] O l i v e D.M., B e a n P., Principles and Applications of Methods for DNA-Based Typing of Microbial Organisms , Journal of Clinical Microbiology 37(6), 1999, 1661-1669. [12] Y a v u z E., G u n e s H., H a r s a S., B u l u t C., Y e n i d u n y a A., Optimization of pulsed eld gel electrophoresis (PFGE) conditions for thermophilic bacilli , World Journal of Microbiology and Biotechnology 20, 2004, 871-874. [13] T u r n e r P., M c L e n n e n A., B a t e s A., W h i t e M., Biologia molekularna – krótkie wykłady , PWN, Warszawa 1999. [14] D o r i g o U., V o l a t i e r L., H u m b e r t J.-F., Molecular approach to the assessment of biodiversity in aquatic microbial communities , Water Research 39, 2005, 2207-2218. [15] B r o w n T., Genomy , PWN, Warszawa 2001. [16] D a i m s H., S t o e c k e r K., W a g n e r M., Fluorescence in situ hybridization for the detection of procaryotes , [in:] Advanced methods in molecular microbial ecology , O s b o r n A.M., S m i t h C.J. (eds.), Bios-Garland, Abingdon, UK, 2005, 213-239. [17] W a g n e r M., H o r n M., D a i m s H., Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes , Current Opinion in Microbiology 6, 2003, 302-309. [18] K i s i e l A., S k ą p s k a A., M a r k i e w i c z W., F i g l e r o w i c z M., Mikromacie- rze DNA , Kosmos 3–4, 2003, 295-303. [19] K e n d a l l J.M., B a d m i n t o n M.N., Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era , Trends Biotechnol. 16, 1998, 216-224. [20] E r r a m p a l l i D., L e u n g K., C a s s i d y M.B., K o s t r z y n s k a M., B l e a r s M., L e e H., T r e v o r s J.T., Applications of the green fluorescent protein as a molecular marker in environmental microorganisms , Journal of Microbiological Methods 35, 1999, 187-199. [21] B a s t o s A.E.R., C a s s i d y M.B., T r e v o r s J.T., L e e H., R o s s i A., Introduction of green fluorescent protein gene into phenol-degrading Alcaligenes faecalis cells and their monitoring in phenol-contaminated soil , Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 2001, 225-260.
[22] S k i l l m a n L.C., S u t h e r l a n d I.W., J o n e s M.V., G o u l s b r a A., Green fluorescent protein as a novel species-specific marker in enteric dual-species biofilms , Microbiology 144, 1998, 2095-2101. [23] O l o f s s o n A.C., Z i t a A., H e r m a n s s o n M., Floc stability and adhesion of green-fluorescent-protein-marked bacteria to flocs in activated sludge , Microbiology, 144, 1998, 519-528. [24] Y a g i K., Applications of whole-cell bacterial sensors in biotechnology and environmental science , Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 2007, 1251-1258. [25] M a t e j c z y k M., Bakteryjne biosensory , Post. Mikrobiol. 43(2), 2004, 155-165. [26] L e i Y., C h e n W., M u l c h a n d a n i A., Microbial biosensors , Analytica Chimica Acta 568, 2006, 200-210.
