Pobierz Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 i więcej Notatki w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity! Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 1 - Ćwiczenie 3 i 4 Temat: Metody hodowli drobnoustrojów Podłoża hodowlane Do wykrywania mikroorganizmów, ich namnażania i identyfikacji w warunkach in vitro służą podłoża (inaczej pożywki) hodowlane. Są to mieszaniny dobranych składników, zawierające odpowiednie związki odżywcze, które pozwalają na wzrost i namnażanie się wielu rodzajów lub jednej grupy mikroorganizmów. Mogą to być pożywki płynne (bez dodatku czynnika zestalającego - żelującego) lub podłoża stałe, zawierające w składzie agar (1-2%). Pożywki przygotowuje się w laboratoriach mikrobiologicznych z poszczególnych komponentów (z zachowaniem składu ilościowego) lub (zdecydowanie częściej) z gotowego podłoża rozprowadzanego w postaci sproszkowanej przez firmy biotechnologiczne. Podłoża te każdorazowo dostarczane są z atestem jakościowym (dla każdej serii) oraz certyfikatem żyzności, wybiórczości itp. Ze względu na łatwość użycia cenione są podłoża rozprowadzane na płytkach Petriego czy w sterylnych butelkach lub próbówkach. Cechy prawidłowego podłoża odpowiedni skład (źródła pierwiastków biogennych: węgla, azotu, wodoru, tlenu, fosforu, siarki; źródła energii; soli mineralnych sodu, wapnia, potasu; mikroelementów: manganu, cynku, miedzi, molibdenu; substancje wzrostowe: aminokwasy, witaminy) umożliwiający wzrost hodowanych mikroorganizmów; obecność składników różnicujących i/lub wybiórczych – w podłożach specjalnych; jałowość (metody wyjaławiania omówiono w przewodniku do ćwiczenia 1); odpowiednie pH (najczęściej 7,2-7,4) i potencjał redox; izotoniczność (uzyskanie przez dodatek NaCl ciśnienia zbliżonego do panującego w komórce – w podłożu hipotonicznym (o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) może dojść do pęcznienia, a nawet pękania komórek, natomiast w podłożu hipertonicznym (o wyższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) następuje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielanie od ściany komórkowej (plazmoliza); przejrzystość (z wyjątkiem podłóż zawierających substancje nierozpuszczalne). Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 2 - Podział podłóż ze względu na pochodzenie poszczególnych składników naturalne – podłoże o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym zawierające wyciągi z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np. bulion, brzeczka, mleko, ziemniak itp.; syntetyczne – złożone ze związków chemicznych organicznych i nieorganicznych o ściśle określonym i znanym składzie chemicznym (jakościowym i ilościowym); półsyntetyczne – mieszane; ze względu na zawartość składników odżywczych minimalne – zawierają tylko składniki pokarmowe, które są niezbędne do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów; pełne – zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze, umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (np. bulion odżywczy); wzbogacone – podłoża z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników, zawierające dodatkowe czynniki wzrostowe, które umożliwiają hodowlę i rozwój drobnoustrojów słabo rosnących in vitro; ze względu na konsystencję płynne – służą głównie do namnażania drobnoustrojów; półpłynne – zawierają 0,1-0,7% agaru, służą m.in. do badania zdolności ruchu bakterii; stałe – zawierają 1,5-2% agaru, służą m.in. do izolacji drobnoustrojów, ich różnicowania oraz oznaczania liczby; Agar (czynnik zestalający) - wielocukier zawierający galaktozę, resztę siarczanową, jony Ca +2 i Mg +2 (uzyskuje się go z krasnorostów). Upłynnia się w wodzie w temperaturze 95- 99ºC, zestala się natomiast w temperaturze 45-49ºC. Drobnoustroje występujące w żywności nie rozkładają go (nieliczne glebowe mogą prowadzić rozkład agaru). W środowisku kwaśnym ulega hydrolizie i traci zdolność do tworzenia żelu. Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 5 - Metody posiewów W zależności od stosowanego podłoża (jego konsystencji) oraz celu oznaczenia, w analizie mikrobiologicznej stosuje się następujące metody posiewów: posiewy do pożywek płynnych w próbówkach za pomocą ezy (posiewy namnażające, oczko ezy może zetknąć się z podłożem); przy użyciu pipety – badania ilościowe np. obecności (posiew 1 cm 3 materiału, pipeta nie może zetknąć się z podłożem); posiewy do podłóż zestalonych w próbówkach (do słupków metodą kłutą za pomocą igły bakteriologicznej, posiew stosowany np. przy badaniu zapotrzebowania mikroorganizmów na tlen, na skosy metodą powierzchniową za pomocą ezy); posiewy do upłynnionych podłóż agarowych w próbówkach (posiew za pomocą pipety, m.in. tzw. metoda wstrząsana do badania właściwości gazotwórczych szczepu oraz oznaczanie obecności przetrwalnikujących laseczek beztlenowych z rodzaju Clostridium; posiewy do płytek Petriego metoda wgłębna (posiew 1 cm 3 materiału do jałowej płytki, następnie zalania posiewu upłynnionym i ostudzonym do ok. 45ºC podłożem agarowym, mieszanie materiału z podłożem, stosowana przy oznaczaniu liczby); powierzchniowa (wylanie do jałowej płytki upłynnionego podłoża, zestalenie podłoża, podsuszenie podłoża, posiew 0,1 cm 3 materiału na powierzchnię podsuszonego podłoża, wtarcie posiewu za pomocą bagietki w kształcie litery L w podłoże, stosowane przy oznaczaniu liczby, dodatkowo można określić morfologię uzyskanych kolonii); izolacyjna (wylanie do jałowej płytki upłynnionego podłoża, zestalenie podłoża, podsuszenie podłoża, posiew materiału za pomocą ezy na tzw. cztery takty, inaczej posiew redukcyjny, stosowana w celu rozizolowania materiału i uzyskania pojedynczych kolonii celem dalszej identyfikacji) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 6 - Metody hodowli Dostęp tlenu Zależnie od sposobu oddychania mikroorganizmów, zapewnia się odpowiednie warunki prowadzonych hodowli: tlenowe - dla ścisłych tlenowców i większości względnych beztlenowców; beztlenowe - dla ścisłych beztlenowców; ze zmodyfikowaną atmosferą (5-10% tlenu, zwiększona zawartość CO2) – dla mikroaerofili. Sposoby zapewniania beztlenowych warunków hodowli hodowla w wysokim słupie; zalanie posiewów drugą warstwą podłoża agarowego lub warstwą agaru wodnego (stosuje się w hodowlach prowadzonych w próbówkach i płytkach Petriego) lub zalanie posiewu warstwą jałowego oleju parafinowego (tylko w próbówkach); hodowla w anaerostatach (szczelnie zamkniętych „słojach”, do których przed zamknięciem wkłada się saszetki z substancjami pochłaniającymi tlen - anaeroculty); hodowla w specjalnych cieplarkach ze zmodyfikowaną atmosferą; hodowla z zastosowaniem tzw. korka pyrogallolowego (po posiewie, wystającą nad probówkę część korka z waty odcina się nożyczkami, pozostałą część wsuwa się w głąb probówki na ok. 0,5 cm, nanosi na nią 0,5 cm 3 nasyconego roztworu sody i 0,5 cm 3 roztworu kwasu pyrogallolowego (kwas w środowisku alkalicznym pochłania tlen), po czym próbówkę zamyka się wyjałowionym korkiem gumowym, stosowana w czasie hodowli na skosach). Temperatura inkubacji Hodowle drobnoustrojów prowadzi się w temperaturach optymalnych w czasie 24-72 godzin (bakterie) i 96 godzin (grzyby). Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 7 - Część praktyczna – ćwiczenie 3: 1. Posiewy celem wyizolowania z materiału Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Saccharomyces cerevisiae Materiał stanowią 3 kultury A, B, C i D – każde stanowisko bada jedną kulturę. Posiewy wykonać do następujących podłóż: Kultura A bulion z glukozą – posiew ezą, agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną, YGC-agar – posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 25ºC przez 96 godzin. Kultura B pożywka z żółcią, zielenią brylantową, laktozą i rurką Dürhama – posiew ezą, agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną, podłoże VRBL-agar – posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. Kultura C pożywka wg Burzyńskiej z azydkiem sodu, glukozą, fioletem krystalicznym i purpurą bromokrezolową – posiew ezą, agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną, podłoże Slanetza i Bartleya – posiew metodą izolacyjną, inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. Kultura D agar odżywczy (2 płytki) – posiew metodą izolacyjną (posiewy wykonać z kultury przed pasteryzacją i po pasteryzacji w temperaturze 80°C przez 15 minut), inkubacja w temp. 30ºC przez 48 godzin. 2. Badanie stosunku do tlenu szczepów (1/2 grupy) Materiał stanowią 3 monokultury: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep. posiew metodą kłutą hodowli do słupka bulion agar bez glukozy 3. Badanie właściwości gazotwórczych szczepów (1/2 grupy) Materiał stanowią 3 monokultury: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.