Docsity
Docsity

Przygotuj się do egzaminów
Przygotuj się do egzaminów

Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity


Otrzymaj punkty, aby pobrać
Otrzymaj punkty, aby pobrać

Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium


Informacje i wskazówki
Informacje i wskazówki

Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4, Notatki z Mikrobiologia

Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4. - 1 -. Ćwiczenie 3 i 4. Temat: Metody hodowli drobnoustrojów. Podłoża hodowlane.

Typologia: Notatki

2022/2023

Załadowany 24.02.2023

mellow_99
mellow_99 🇵🇱

4.3

(26)

170 dokumenty

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 i więcej Notatki w PDF z Mikrobiologia tylko na Docsity! Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 1 - Ćwiczenie 3 i 4 Temat: Metody hodowli drobnoustrojów Podłoża hodowlane Do wykrywania mikroorganizmów, ich namnażania i identyfikacji w warunkach in vitro służą podłoża (inaczej pożywki) hodowlane. Są to mieszaniny dobranych składników, zawierające odpowiednie związki odżywcze, które pozwalają na wzrost i namnażanie się wielu rodzajów lub jednej grupy mikroorganizmów. Mogą to być pożywki płynne (bez dodatku czynnika zestalającego - żelującego) lub podłoża stałe, zawierające w składzie agar (1-2%). Pożywki przygotowuje się w laboratoriach mikrobiologicznych z poszczególnych komponentów (z zachowaniem składu ilościowego) lub (zdecydowanie częściej) z gotowego podłoża rozprowadzanego w postaci sproszkowanej przez firmy biotechnologiczne. Podłoża te każdorazowo dostarczane są z atestem jakościowym (dla każdej serii) oraz certyfikatem żyzności, wybiórczości itp. Ze względu na łatwość użycia cenione są podłoża rozprowadzane na płytkach Petriego czy w sterylnych butelkach lub próbówkach. Cechy prawidłowego podłoża  odpowiedni skład (źródła pierwiastków biogennych: węgla, azotu, wodoru, tlenu, fosforu, siarki; źródła energii; soli mineralnych sodu, wapnia, potasu; mikroelementów: manganu, cynku, miedzi, molibdenu; substancje wzrostowe: aminokwasy, witaminy) umożliwiający wzrost hodowanych mikroorganizmów;  obecność składników różnicujących i/lub wybiórczych – w podłożach specjalnych;  jałowość (metody wyjaławiania omówiono w przewodniku do ćwiczenia 1);  odpowiednie pH (najczęściej 7,2-7,4) i potencjał redox;  izotoniczność (uzyskanie przez dodatek NaCl ciśnienia zbliżonego do panującego w komórce – w podłożu hipotonicznym (o niższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) może dojść do pęcznienia, a nawet pękania komórek, natomiast w podłożu hipertonicznym (o wyższym ciśnieniu osmotycznym, niż w komórkach) następuje kurczenie się plazmy komórkowej i oddzielanie od ściany komórkowej (plazmoliza);  przejrzystość (z wyjątkiem podłóż zawierających substancje nierozpuszczalne). Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 2 - Podział podłóż  ze względu na pochodzenie poszczególnych składników  naturalne – podłoże o nie w pełni zdefiniowanym składzie chemicznym zawierające wyciągi z tkanek roślinnych lub zwierzęcych, np. bulion, brzeczka, mleko, ziemniak itp.;  syntetyczne – złożone ze związków chemicznych organicznych i nieorganicznych o ściśle określonym i znanym składzie chemicznym (jakościowym i ilościowym);  półsyntetyczne – mieszane;  ze względu na zawartość składników odżywczych  minimalne – zawierają tylko składniki pokarmowe, które są niezbędne do podtrzymania wzrostu drobnoustrojów;  pełne – zawierają wszystkie niezbędne substancje odżywcze, umożliwiające dobry wzrost drobnoustrojów (np. bulion odżywczy);  wzbogacone – podłoża z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników, zawierające dodatkowe czynniki wzrostowe, które umożliwiają hodowlę i rozwój drobnoustrojów słabo rosnących in vitro;  ze względu na konsystencję  płynne – służą głównie do namnażania drobnoustrojów;  półpłynne – zawierają 0,1-0,7% agaru, służą m.in. do badania zdolności ruchu bakterii;  stałe – zawierają 1,5-2% agaru, służą m.in. do izolacji drobnoustrojów, ich różnicowania oraz oznaczania liczby; Agar (czynnik zestalający) - wielocukier zawierający galaktozę, resztę siarczanową, jony Ca +2 i Mg +2 (uzyskuje się go z krasnorostów). Upłynnia się w wodzie w temperaturze 95- 99ºC, zestala się natomiast w temperaturze 45-49ºC. Drobnoustroje występujące w żywności nie rozkładają go (nieliczne glebowe mogą prowadzić rozkład agaru). W środowisku kwaśnym ulega hydrolizie i traci zdolność do tworzenia żelu. Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 5 - Metody posiewów W zależności od stosowanego podłoża (jego konsystencji) oraz celu oznaczenia, w analizie mikrobiologicznej stosuje się następujące metody posiewów:  posiewy do pożywek płynnych w próbówkach  za pomocą ezy (posiewy namnażające, oczko ezy może zetknąć się z podłożem);  przy użyciu pipety – badania ilościowe np. obecności (posiew 1 cm 3 materiału, pipeta nie może zetknąć się z podłożem);  posiewy do podłóż zestalonych w próbówkach (do słupków metodą kłutą za pomocą igły bakteriologicznej, posiew stosowany np. przy badaniu zapotrzebowania mikroorganizmów na tlen, na skosy metodą powierzchniową za pomocą ezy);  posiewy do upłynnionych podłóż agarowych w próbówkach (posiew za pomocą pipety, m.in. tzw. metoda wstrząsana do badania właściwości gazotwórczych szczepu oraz oznaczanie obecności przetrwalnikujących laseczek beztlenowych z rodzaju Clostridium;  posiewy do płytek Petriego  metoda wgłębna (posiew 1 cm 3 materiału do jałowej płytki, następnie zalania posiewu upłynnionym i ostudzonym do ok. 45ºC podłożem agarowym, mieszanie materiału z podłożem, stosowana przy oznaczaniu liczby);  powierzchniowa (wylanie do jałowej płytki upłynnionego podłoża, zestalenie podłoża, podsuszenie podłoża, posiew 0,1 cm 3 materiału na powierzchnię podsuszonego podłoża, wtarcie posiewu za pomocą bagietki w kształcie litery L w podłoże, stosowane przy oznaczaniu liczby, dodatkowo można określić morfologię uzyskanych kolonii);  izolacyjna (wylanie do jałowej płytki upłynnionego podłoża, zestalenie podłoża, podsuszenie podłoża, posiew materiału za pomocą ezy na tzw. cztery takty, inaczej posiew redukcyjny, stosowana w celu rozizolowania materiału i uzyskania pojedynczych kolonii celem dalszej identyfikacji) Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 6 - Metody hodowli Dostęp tlenu Zależnie od sposobu oddychania mikroorganizmów, zapewnia się odpowiednie warunki prowadzonych hodowli:  tlenowe - dla ścisłych tlenowców i większości względnych beztlenowców;  beztlenowe - dla ścisłych beztlenowców;  ze zmodyfikowaną atmosferą (5-10% tlenu, zwiększona zawartość CO2) – dla mikroaerofili. Sposoby zapewniania beztlenowych warunków hodowli  hodowla w wysokim słupie;  zalanie posiewów drugą warstwą podłoża agarowego lub warstwą agaru wodnego (stosuje się w hodowlach prowadzonych w próbówkach i płytkach Petriego) lub zalanie posiewu warstwą jałowego oleju parafinowego (tylko w próbówkach);  hodowla w anaerostatach (szczelnie zamkniętych „słojach”, do których przed zamknięciem wkłada się saszetki z substancjami pochłaniającymi tlen - anaeroculty);  hodowla w specjalnych cieplarkach ze zmodyfikowaną atmosferą;  hodowla z zastosowaniem tzw. korka pyrogallolowego (po posiewie, wystającą nad probówkę część korka z waty odcina się nożyczkami, pozostałą część wsuwa się w głąb probówki na ok. 0,5 cm, nanosi na nią 0,5 cm 3 nasyconego roztworu sody i 0,5 cm 3 roztworu kwasu pyrogallolowego (kwas w środowisku alkalicznym pochłania tlen), po czym próbówkę zamyka się wyjałowionym korkiem gumowym, stosowana w czasie hodowli na skosach). Temperatura inkubacji Hodowle drobnoustrojów prowadzi się w temperaturach optymalnych w czasie 24-72 godzin (bakterie) i 96 godzin (grzyby). Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie; Katedra Mikrobiologii Przemysłowej i Żywności Przedmiot: Mikrobiologia Żywności, Ćwiczenie 3 i 4 - 7 - Część praktyczna – ćwiczenie 3: 1. Posiewy celem wyizolowania z materiału Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Saccharomyces cerevisiae Materiał stanowią 3 kultury A, B, C i D – każde stanowisko bada jedną kulturę. Posiewy wykonać do następujących podłóż: Kultura A  bulion z glukozą – posiew ezą,  agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,  YGC-agar – posiew metodą izolacyjną,  inkubacja w temp. 25ºC przez 96 godzin. Kultura B  pożywka z żółcią, zielenią brylantową, laktozą i rurką Dürhama – posiew ezą,  agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,  podłoże VRBL-agar – posiew metodą izolacyjną,  inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. Kultura C  pożywka wg Burzyńskiej z azydkiem sodu, glukozą, fioletem krystalicznym i purpurą bromokrezolową – posiew ezą,  agar odżywczy – posiew metodą izolacyjną,  podłoże Slanetza i Bartleya – posiew metodą izolacyjną,  inkubacja w temp. 37ºC przez 48 godzin. Kultura D  agar odżywczy (2 płytki) – posiew metodą izolacyjną (posiewy wykonać z kultury przed pasteryzacją i po pasteryzacji w temperaturze 80°C przez 15 minut),  inkubacja w temp. 30ºC przez 48 godzin. 2. Badanie stosunku do tlenu szczepów (1/2 grupy) Materiał stanowią 3 monokultury: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.  posiew metodą kłutą hodowli do słupka bulion agar bez glukozy 3. Badanie właściwości gazotwórczych szczepów (1/2 grupy) Materiał stanowią 3 monokultury: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Clostridium butyricum – każde stanowisko bada jeden szczep.