Mikroskopia w świetle przechodzącym, Laboratoria z Biotecnologia

Pobierz Mikroskopia w świetle przechodzącym i więcej Laboratoria w PDF z Biotecnologia tylko na Docsity!

BIOLOGIA KOMÓRKI

MIKROSKOPIA W ŚWIETLE PRZECHODZĄCYM- BUDOWA I

DZIAŁANIE MIKROSKOPU JASNEGO POLA, KONTRASTOWO-

FAZOWEGO I Z KONTRASTEM NOMARSKIEGO

1. Zasada działania mikroskopu z kontrastem fazowym (KF)

Mikroskop z kontrastem fazowym stereoskopowym jest szczególnie przydatny w obserwacjach preparatów cyto- i histologicznych komórek hodowanych in vitro. Umożliwia on obserwację przedmiotów fazowych tzn. nie wykazujących naturalnego kontrastu. Przedmioty fazowe - nie wykazują różnic w pochłanianiu światła, różnią się od otaczającego je środowiska współczynnikiem załamania lub grubością, promienie świetlne przechodzące przez nie ulegają tylko przesunięciu fazowemu, nie zmienia się ich amplituda Przedmioty amplitudowe - wykazują różnice w pochłanianiu światła, amplituda promieni świetlnych przez nie przechodzących ulega zmniejszeniu, co manifestuje się widoczną dla oka zmianą natężenia światła- naturalnym kontrastem obserwowanym w mikroskopie. Kontrast fazowy w mikroskopii polega na bezpośrednim przekształceniu zmian fazowych fali świetlnej w badanym preparacie na widoczne dla oka zmiany natężenia światła w obrazie mikroskopowym tego preparatu. Analizując przebieg promieni świetlnych w układzie optycznym mikroskopu KF (rys.1) oświetlających przedmiot fazowy, obserwuje się w płaszczyźnie ogniskowej obrazowej obiektywu wyraźne odgraniczenie światła dyfrakcyjnego Sd od światła bezpośrednio przechodzącego przez preparat Sb (rys.2). Od tego uzależniona jest techniczna realizacja kontrastu fazowego, ponieważ dzięki temu można w źrenicy wyjściowej obiektywu zmieniać fazę i amplitudę światła bezpośredniego bez oddziaływania na światło dyfrakcyjne i na odwrót. Kontrast fazowy polega na wytworzeniu między światłem bezpośrednim i dyfrakcyjnym dodatkowej różnicy fazy ψ = 90o, a także na zmniejszeniu natężenia światła bezpośredniego, ponieważ efektywnie interferują fale świetlne zgodne lub przeciwne w fazach i o takich samych amplitudach. Do takiej modulacji światła bezpośredniego służy płytka fazowa. Pierścień fazowy składa się z 2 warstw: substancji dielektrycznej (kriolit lub fluorek magnezu) zmieniającej fazę światła i substancji metalicznej (Cr, Al) osłabiającej jego natężenie.

źródło światła

Kondensor

płas zczyzna prz edmiotowa obiektywu - prz edm iot fazowy

Źrenica wyjściowa obiektywu

Sd

Sb

Płaszczyzna ogn iskowej obrazowej obiektywu

Pł aszczyzna obrazowa ob iektywu

I Sb

Płytka fazowa Sd

Rys.1. Zasada kontrastu fazowego

Rys.2. Typowy rozkład natężenia światła bezpośredniego i dyfrakcyjnego w źrenicy wyjściowej obiektywu; przedmiot fazowy strukturalnie złożony

USTAWIENIE MIKROSKOPU DO PRACY

a. złożyć mikroskop (wg instrukcji, str. 9) b. ustawić kondensor na pozycji „0” c. maksymalnie otworzyć diafragmy pola i aperturową, d. wyłączyć soczewkę Bertranda, e. wyłączyć polaryzatory w nasadce dwuocznej f. przygotować preparat i umieścić na stoliku mikroskopu g. zogniskować mikroskop na badanym preparacie h. ustawić oświetlenie mikroskopu wg zasady Köhlera do obserwacji w jasnym polu (patrz instrukcja obsługi, str.9) i. ustawić mikroskop do obserwacji kontrastowo-fazowej stereoskopowej (wg załączonej instrukcji str.9 i 10)

Ryc. 1. Typowy obraz komórki w mikroskopie jasnego pola (A), w mikroskopie kontrastowo- fazowym (B), w mikroskopie interferencyjno-polaryzacyjnym (C) i w mikroskopie fluorescencyjnym (D)

PRZYGOTOWANIE PREPARATÓW MIKROSKOPOWYCH

Przygotowanie szkiełek przedmiotowych i nakrywkowych

• dokładnie z obu stron wymyć szkiełka watą, zanurzoną w alkoholu, nawiniętą na pęsetę
• dokładnie wytrzeć szkiełka gazą
• na odtłuszczone szkiełka podstawowe nałożyć a) skórkę łuski spichrzowej cebuli w kropli 0,9% NaCl – przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym; b) wazelinowy odcisk palca - na palec nabrać odrobinę wazeliny, wytrzeć palec gazą, a następnie zrobić odcisk palca na szkiełku podstawowym; preparatu nie przykrywać szkiełkiem nakrywkowym; c) nabłonek błony śluzowej jamy ustnej - palcem zeskrobać odrobinę nabłonka błony śluzowej jamy ustnej, a następnie przenieść go na czyste szkiełko podstawowe, nie przykrywać szkiełkiem nakrywkowym; preparaty oglądać w kontraście fazowym i w jasnym polu pod różnymi powiększeniami

Wszystkie preparaty, w tym również te gotowe z utrwalonymi komórkami

obserwować w kontraście fazowym i w jasnym polu pod różnymi

powiększeniami

Obserwacja obiektów biologicznych w dyferencjalnym (różnicowym)

polu interferencyjnym

Mikroskop polaryzacyjno-interferencyjny jest przyrządem opartym na podobnej zasadzie działania co mikroskop kontrastowo-fazowy. Jednak w porównaniu z mikroskopem kontrastowo-fazowym znajduje on znacznie szersze zastosowanie. Oprócz możliwości obserwacji obiektów fazowych pozwala on dokonywać licznych pomiarów, między innymi przesunięcia fazowego, grubości obiektów, współczynnika załamania światła, stężenia substancji, zawartości suchej masy w komórkach oraz wielu innych wielkości fizycznych. Zasada działania mikroskopu interferencyjnego opiera się na pomiarze przesunięcia fazowego światła przechodzącego przez dany obiekt w stosunku do środowiska o innym współczynniku załamania, np. tła. To przesunięcie fazowe jest proporcjonalne do współczynnika załamania światła. Jedną z odmian mikroskopu interferencyjnego, znajdującą obecnie szerokie zastosowanie w biologii komórki jest mikroskop interferencyjny o kontraście różnicowym Nomarskiego (DIC). Ten układ optyczny uwidacznia struktury różniące się współczynnikiem załamania światła, wykorzystując bardzo nieznaczne przesunięcie w fazie interferujących promieni świetlnych, rzędu zdolności rozdzielczej obiektywu mikroskopowego. Wytwarzane w ten sposób obrazy sprawiają wrażenie „trójwymiarowości”.

Elementami charakterystycznymi tego mikroskopu są:

1. Głowica interferencyjna, która mieści w sobie 3 pryzmaty dwójłomne oraz analizator. Oprócz możliwości włączania do układu optycznego mikroskopu pryzmaty mogą być przesuwane w dwóch kierunkach:

a) równoległym do osi optycznej mikroskopu, co umożliwia uzyskanie jednorodnego pola interferencyjnego oraz zmiany szerokości prążków interferencyjnych w polu widzenia b) prostopadłym, co umożliwia zmianę faz między interferującymi falami świetlnymi oraz pomiar różnicy drogi optycznej w badanym obiekcie

**2. Kondensor z przysłona szczelinową

3. Polaryzator
4. Filtry interferencyjne
5. Mikroskop pomocniczy** , służący do obserwacji źrenicy wyjściowej obiektywu i regulacji mikroskopu z urządzeniem polaryzacyjno-interferencyjnym