Pobierz NOWOCZESNE METODY MIKROSKOPII OPTYCZNEJ W ... i więcej Schematy w PDF z Fizyka tylko na Docsity!
NOWOCZESNE METODY
MIKROSKOPII OPTYCZNEJ
W BADANIACH UKŁADÓW
BIOLOGICZNYCH
1. Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest obserwacja układów biologicznych za pomocą współczesnych technik mikroskopii optycznej, takich jak mikroskopia kontrastowo-fazowa, mikroskopia z kontrastem różnicowo – interferencyjnym i mikroskopia fluorescencyjna.
2. Aparatura
Mikroskop fluorescencyjny IX71 firmy Olympus z kamerą cyfrową
Zasilacze Komputer z oprogramowaniem
Zestaw odczynników chemicznych
3. Program ćwiczenia
Obserwacja preparatów biologicznych metodą mikroskopii optycznej jasnego pola
Obserwacja preparatów biologicznych metodą mikroskopii kontrastowo – fazowej
Obserwacja preparatów biologicznych metodą mikroskopii z kontrastem różnicowo – interferencyjnym
Przygotowanie preparatów do mikroskopii fluorescencyjnej Obserwacja preparatów biologicznych metodą mikroskopii fluorescencyjnej
Obserwacja procesu migracji komórkowej keratynocytów rybich
4. Tematy do kolokwium
Podstawowe zjawiska optyczne: dyfrakcja, interferencja, polaryzacja, fluorescencja
Budowa i zasada działania mikroskopu optycznego
Budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo – fazowego Budowa i zasada działania mikroskopu z kontrastem różnicowo – interferencyjnym
Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego
Budowa komórki
Migracja komórkowa
5. Procedura utrwalania i barwienia komórek (F-aktyna/jądra
komórkowe):
Komórki pobrane z hodowli wypłukać w buforowanym roztworze soli fizjologicznej
PBS, przed płukaniem bufor podgrzać do temperatury ok. 37 st. C
Następnie komórki utrwalać 3,6% formaldehydem przez 8 min. (roztwór
formaldehydu w PBS). Po upływie czasu utrwalania komórki 3-krotnie wypłukać w PBS.
W celu zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, komórki poddać działaniu TRITONu w stężeniu 0,1%, czas inkubacji z TRITONEMem 3 min. Po upływie tego czasu komórki dokładnie wypłukać w PBS.
W kolejnym kroku, komórki inkubować z 1% roztworem surowicy bydlęcej FBS
(roztwór przygotowany w PBS) przez 20 min, a następnie komórki wypłukać w PBS.
Dodać barwnik fluorescencyjny. W zależności od rodzaju barwnika, czas inkubacji wynosi:
- barwienie F-aktyny poprzez kompleks falloidyna-AlexaFluor488: 20-25 min
- barwienie jąder komórkowych stosując np. DAPI: 4-6 min Podczas inkubacji z barwnikiem preparat należy zabezpieczyć przed ekspozycją na światło.
Po upływie żądanego czasu inkubacji z barwnikiem próbkę należy dokładnie (3-4x) wypłukać w PBS.
Rysunek 1. Budowa i zasada działania mikroskopu optycznego: 1. okular osadzony w tubusie;
- rewolwer; 3. obiektyw; 4. śruba makrometryczna; 5. śruba mikrometryczna; 6. stolik; 7. źródło światła; 8. kondensor; 9. statyw [2, 3]
Powiększenie mikroskopu
Schemat biegu promieni w mikroskopie optycznym przedstawia Rysunek 2.
Rysunek 2. Schematyczny bieg promieni w mikroskopie optycznym.
Powiększenie mikroskopu M zależy od powiększenia obiektywu i okularu:
𝑀 = 𝑀 1 ∙ 𝑀 2 ≈
Zdolność rozdzielcza mikroskopu
Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość l dzieląca dwa punkty, które w obrazie mikroskopowym są dostrzegalne oddzielnie. Wielkością charakterystyczną, która określa możliwość optymalnego wykorzystania obiektywu w danym środowisku jest apertura numeryczna
𝑁𝐴 = 𝑛 ∙ sin 𝛼
Rysunek 3. Apertura numeryczna [4]
Dla obiektywu pracującego w świetle monochromatycznym zdolność rozdzielcza wyraża się wzorem:
Mikroskop kontrastowo – fazowy
Żywe komórki oraz innego rodzaju bezbarwne próbki są zwykle słabo widoczne pod tradycyjnym mikroskopem jasnego pola. Dlatego do obrazowania tego typu obiektów wykorzystywany jest zwykle kontrast fazowy, opracowany po raz pierwszy w 1930 roku przez holenderskiego fizyka Fritza Zernike.
Rysunek 4. Schemat działania mikroskopu kontrastowo – fazowego [5].
W przypadku kontrastu fazowego nie chodzi o zwiększenie kontrastu pomiędzy jasnymi i ciemnymi obszarami obrazu, ale o uwidocznienie deformacji czoła fali, jaka powstaje podczas przechodzenia fali płaskiej o stałej amplitudzie przez ośrodek o niejednorodnym współczynniku załamania, np. wodę z okruchami szkła, które nie są widoczne. W metodzie tej źródło światła jest odwzorowane na pierścieniowej przesłonie umieszczonej w płaszczyźnie ogniskowej kondensora. Światło przechodzące przez tę przesłonę i kondensor przechodzi więc przez obserwowany przedmiot jako wiązka promieni równoległych. Na strukturze przedmiotu następuje dyfrakcja, ale promienie nie ugięte biegną dalej, nie zmieniając kierunku i obiektyw mikroskopu skupia je na pierścieniowej przesłonie (płytce fazowej). Obszar 0 zerowego rzędu ugięcia, który w zwykłym mikroskopie jest mały i
Efekty widoczne na obrazach uzyskanych tą techniką, tj. kolor, różne natężenie oświetlenia, są związane ze zmianami współczynnika załamania oraz grubości oglądanej próbki w różnych jej rejonach. W związku z tym, obraz sprawia wrażenie trójwymiarowego, co nie oddaje jednak rzeczywistej geometrii próbki, a jest jedynie wizualizacją tego jaką drogę optyczną światło pokonuje przy przejściu przez nią. Dlatego też obrazy uzyskane za pomocą kontrastu różnicowo-interferencyjnego nie nadają się do precyzyjnego mierzenia rzeczywistych wysokości. Mikroskopia z kontrastem różnicowo-interferencyjnym ma wiele zalet. W porównaniu z mikroskopia kontrastowo-fazowa istnieje możliwość pełnego wykorzystania apertury numerycznej (brak przysłony pierścieniowej) oraz zastosowania tzw. barwienia optycznego (ang. optical staining). Pozwala także na osiągniecie znakomitej rozdzielczości. Użycie pełnej apertury numerycznej obiektywu umożliwia skupienie mikroskopu na cienkiej warstwie badanej próbki i unikniecie przenikania się obrazów z płaszczyzn położonych wyżej lub niżej. Wyeliminowany też został efekt halo, utrudniający interpretację obrazów uzyskanych za pomocą kontrastu fazowego. Wadą kontrastu interferencyjno-różnicowego jest fakt, iż naczynia do hodowli tkankowej wykonane z plastiku bądź szkła mogą wykazywać własności dwójłomne. Powodują one wówczas uzyskanie mylnych obrazów. [9]
Mikroskop fluorescencyjny
Mikroskopia fluorescencyjna stała się jedną z kluczowych technik stosowaną w biologii oraz naukach biomedycznych ze względu na zalety, których nie oferuje tradycyjna mikroskopia optyczna. Zastosowanie fluorochromów umożliwiło wysoce specyficzną identyfikację oraz obrazowanie komórek i struktur subkomórkowych, często bardzo trudnych, lub wręcz niemożliwych do zobrazowania za pomocą klasycznego mikroskopu świetlnego. W szczególności, mikroskopia fluorescencyjna jest zdolna do wykrycia pojedynczych cząsteczek lub organelli komórkowych. Mikroskop fluorescencyjny wykorzystuje zjawisko fluorescencji, czyli emisji promieniowania przez naświetlaną substancję, która jest związana z powrotem cząsteczek do stanu podstawowego o tej samej multipletowości spinowej co stan wzbudzony. Proces ten dobrze ilustruje tzw. diagram Jabłońskiego (Rysunek 6)
Rysunek 6. Diagram Jabłońskiego [10]
Podstawowym zadaniem mikroskopu fluorescencyjnego jest naświetlenie badanej próbki wiązką światła o zadanej, odpowiedniej dla zastosowanego fluorochromu, długości fali, a następnie wyodrębnienie znacznie słabszego światła wyemitowanego przez próbkę. W odpowiednio skonfigurowanym mikroskopie fluorescencyjnym do obserwatora powinno dotrzeć jedynie światło pochodzące z fluorescencji, obrazujące wybarwione struktury na ciemnym tle [11]. Zasadę działania mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia Rysunek 7.
Rysunek 7. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego [12]
Lampa łukowa lub inne źródło światła emituje wiązkę o szerokim zakresie długości fal. Wiązka przechodzi przez filtr, który z całego zakresu wybiera jedną długość fali (bądź wąski zakres długości fal) odpowiednio zdefiniowany dla użytego fluorochromu (zwykle jest to ultrafiolet bądź niebieski lub zielony zakres światła widzialnego). Wyselekcjonowana wiązka pada na powierzchnie zwierciadła dichroicznego, które przez odbicie kieruje ją na wysokoaperturowy obiektyw, a następnie w stronę obserwowanej próbki. Obserwowany preparat fluoryzuje pod wpływem padającej wiązki, a emitowane światło jest ponownie zbierane przez obiektyw. Emitowana wiązka przechodzi przez zwierciadło dichroiczne i pada na filtr fali emitowanej, którego zadaniem jest usuniecie światła nie pochodzącego z fluorescencji próbki. Wiązka przechodzi przez okular, a następnie trafia do detektora, którym może być ludzkie oko, kamera CCD lub fotopowielacz. [11]
Mikroskopia fluorescencyjna posiada wiele niezaprzeczalnych zalet. Umożliwia specyficzne znakowanie substancji i organelli komórkowych oraz ich obserwacje. Jest metoda czuła oraz zapewnia uzyskanie obrazów o wysokiej jakości, charakteryzujących się wysokim kontrastem. Z drugiej jednak strony techniki mikroskopii fluorescencyjnej wymagają odpowiedniego przygotowania preparatów (aplikacja barwnika fluorescencyjnego). Niektóre z wykorzystywanych fluorochromów są toksyczne dla komórek, co wymaga ich uprzedniego utrwalenia (ang. fixation), a tym samym uniemożliwia ich obserwacje in vivo. [1]
Rysunek 9. Znaczenie migracji komórkowej dla organizmu ludzkiego. [17]
Komórki często napotykają na swojej drodze gradienty czynników chemicznych i fizycznych, w związku z czym wykształciły one mechanizmy reagowania na te gradienty, w wyniku których komórka wykonuje ruch zgodny z kierunkiem nasilania się bodźca lub w stonę przeciwną. Taki kierunkowy ruch całych organizmów nazywamy taksją. Chemotaksja, będąca odpowiedzią na bodziec chemiczny oraz fototaksja, związana z bodźcami świetlnymi są dwoma najlepiej poznanymi rodzajami taksji [18]. Przykładami innych taksji może być aerotaksja, będąca ruchem ukierunkowanym ze względu na stężenie tlenu, hydrotaksja, związana z występowaniem wody w środowisku [18], czy galwanotaksja – ruch wywołany obecnością pól elektrycznych [17]. Badanymi od stosunkowo niedawna rodzajami ruchów kierunkowych są haptotaksja oraz durotaksja. Haptotaksja jest zależną od rodzaju podłoża migracją, w której komórka reaguje na gradient adhezyjności lub inne sygnały wiodące związane z macierzą pozakomórkowa [19]. Gdy komórki znajdują się na podłożu elastycznym obserwuje się durotaksję, czyli ukierunkowaną migrację do obszarów o większej sztywności [20]. Niektóre z komórek wykształciły wyspecjalizowane narządy ruchu tj. rzęski, wici, pseudopodia czy lamellipodia. Rzęski i wici są popularnymi wśród komórek eukariotycznych narządami ruchu umożliwiającymi pływanie. Rzęski są krótkimi strukturami, zwykle występującymi w dużej liczbie na powierzchni komórki. Wici z kolei są dłuższe i zwykle występują pojedynczo lub w niewielkich skupiskach. Pod względem budowy obie struktury są podobne – zawierają one układ stabilnych mikrotubul oraz białko motoryczne dyneinę, które przy zużyciu ATP wywołuje ślizganie się mikrotubul względem siebie, czego następstwem jest podobny do uderzeń ruch rzęsek (wici), a w konsekwencji przemieszczenie komórki [18]. Filamenty aktynowe znajdujące się w strefie frontalnej migrującej komórki ulegają szybkiej organizacji w pęczki i sieci w wiodącym regionie komórki, zwanym lamellipodium. Niektóre komórki, na tej samej zasadzie, wykształcają cienkie, przypominające palce wypustki, tzw. filopodia. Struktury te umożliwiają komórkom ruch pełzający [12].
Literatura
[1] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Molecular Biology of the Cell, 5th Edition, Garland Science, Taylor & Francis Group.
[2] http://pl.wikipedia.org/wiki/Mikroskop_optyczny
[3] http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/introduction.html
[4] http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasna.html
[5] http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/phasecontrast/phase.html
[6] http://www.oficyna.pwr.wroc.pl/e-book/instrum2.pdf
[7] http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dicoverview.html
[8] http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dicoverview.html
[9] http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dicintro.html
[10] W. Brutkowski, Mikroskopia konfokalna a mikroskopia szerokiego pola – dwa podejścia do badań przyżyciowych, Kosmos 62 (2013) 171-
[11] http://www.microscopyu.com/print/articles/fluorescence/fluorescencein
[12] H. Lodish, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. E. Darnell, Molecular Cell Biology , 5th Edition, W. H. Freeman and Company, 2000.
[13] http://pl.wikibooks.org/wiki/Biologia_dla_liceum/Budowa_komórek_człowieka
[14] http://www.pearltrees.com/bartunio/biologia/id10501393/item
[15] http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/livecellimaging/techniques.html
[16] W. Kłopocka, J. Barańska, Rola białek z rodziny Rho w kontroli migracji komórek pełzających, Postępy Biochemii 51(1), 2005.
[17] R. Horwitz, D. Webb, Cell migration , Current Biology, Vol 13, No 19.
[18] M. T. Madigan, J. M. Martinko, K. S. Bender, D. H. Buckley, D. A. Stahl, Brock Biology of Microorganisms, 14th Edition, Pearson.
[19] C. M. Wells, M. Parsons, Cell Migtarion, Developmental Methods and Protocols, 2nd Edition, Humana Press, 2011.
[20] B. Harland, S. Walcott, S. X. Sun, Adhesion dynamics and durotaxis in migrating cells, Phys. Biol., 8, February 2011.
