Docsity
Docsity

Przygotuj się do egzaminów
Przygotuj się do egzaminów

Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity


Otrzymaj punkty, aby pobrać
Otrzymaj punkty, aby pobrać

Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium


Informacje i wskazówki
Informacje i wskazówki

Oznaczanie aktywności enzymów, Ćwiczenia z Biotechnologia

i aktywność enzymu jest zależna od wielu czynników zarówno fizycznych, jak ... Do innych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych należą.

Typologia: Ćwiczenia

2022/2023

Załadowany 24.02.2023

Ania870
Ania870 🇵🇱

4.5

(30)

223 dokumenty

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Oznaczanie aktywności enzymów i więcej Ćwiczenia w PDF z Biotechnologia tylko na Docsity! Oznaczanie aktywności enzymów Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu Biotechnologia Enzymatyczna Prowadzący: mgr inż. Anna Byczek CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności enzymu z grupy hydrolaz na przykładzie α-amylazy zawartej w ślinie, a następnie zbadanie wpływu różnych czynników, takich jak: temperatura, obecność aktywatorów, czy pH środowiska na aktywność tej amylazy. PODSTAWY TEORETYCZNE Wstęp Ilość enzymu w układzie można oznaczyć na podstawie pomiaru szybkości katalizowanej przez niego reakcji. Szybkość reakcji nie zawsze jest jednak proporcjonalna do stężenia enzymu i najczęściej mierząc szybkość reakcji enzymatycznej określa się aktywność enzymu w określonych warunkach. Szybkość reakcji enzymatycznej, a więc konsekwentnie i aktywność enzymu jest zależna od wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych. Oprócz stężenia enzymu i stężenia substratu, na aktywność enzymu mają wpływ takie czynniki jak: temperatura, pH roztworu w którym zachodzi reakcja, działanie aktywatorów lub inhibitorów oraz efektorów allosterycznych. Szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta zwykle wraz ze wzrostem temperatury i dla większości enzymów temperatura optymalna zbliżona jest do 40oC. Nie jest to jednak reguła i znane są enzymy, dla których optymalna temperatura jest wyższa bądź niższa. Nadmierne podwyższenie temperatury prowadzi do ograniczenia lub zahamowania szybkości reakcji enzymatycznej na skutek denaturacji termicznej białka enzymatycznego. Termostabilość enzymu określa się podając najwyższą temperaturę, w której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu. Równie ważnym czynnikiem jak temperatura jest pH środowiska reakcji. Szybkość reakcji jest maksymalna przy optymalnym pH dla danego enzymu. Rozpiętość optimum pH dla reakcji enzymatycznych jest znaczna i waha się w zakresie od 1 do 9. Małe odchylenia od optymalnej wartości pH dla danego enzymu powodują zwykle nieznaczne zmniejszenie szybkości reakcji, jednak duże odchylenia pH od wartości optymalnej mogą prowadzić nawet do nieodwracalnej denaturacji białka enzymatycznego. Do innych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych należą aktywatory i inhibitory. Mogą to być związki nisko- lub wielkocząsteczkowe zarówno nieorganiczne, jak i organiczne. Wiele enzymów wrażliwych jest nawet na małe stężenia soli metali ciężkich, które mają katalityczny wpływ na utlenianie grup hydrosulfidowych tlenem atmosferycznym. Inhibitorami mogą być również związki kompleksujące metale będące częścią centrum katalitycznego enzymu lub biorące udział w procesie katalitycznym. Do tej grupy związków zaliczane są cyjanki, azydki, H2S oraz CO. Za aktywowanie dużej grupy enzymów odpowiada z kolei obecność elektrolitów (Cl-, Br-, NO3 -). Do tej grupy enzymów należą amylazy. W ramach ćwiczenia oznaczana jest aktywność α-amylazy hydrolizującej jedynie wiązania α-1-4-glikozydowe więc jako hydrolizowany substrat zastosowano tzw. „skrobię rozpuszczalną” stanowiącą liniowy polimer zbudowany z jednostek D-glukozy połączonej wiązaniami α-1-4-glikozydowymi. Dodatkową zaletą użycia skrobi rozpuszczalnej jest możliwość przygotowania jej wodnego roztworu (podczas gdy frakcje skrobi zawierające amylopektynę są w wodzie nierozpuszczalne). Do oznaczenia aktywności α-amylazy posłużono się metodą bazującą na śledzeniu ubytku substratu w czasie i wyznaczaniu tzw. punktu achromowego. Tak powstała dekstryna graniczna ulega rozkładowi dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż α-amylaza jest w stanie „przeskakiwać” przez wiązania α-1,6-glikozydowe (bez ich hydrolizy), tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być dalej rozkładane przez β-amylazę. W wyniku łącznego działania α- i β-amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy oraz niewielkiej ilości wolnej glukozy. Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt. Rozkłada ona zarówno wiązania α-1,4-, jak i α-1,6-glikozydowe (o ile te ostatnie znajdują się przy nieredukujacej jednostce glukozy) i dlatego przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy. Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również α-1,4-glukozydazę i α-1,6-glukozydazę (izomaltazę). Enzymy te rozkładają wytworzone w wyniku działania β-amylazy disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem rozkładu enzymatycznego skrobi. Nazwa EC Typ hydrolizowanych wiązań α-amylazy EC 3.2.1.1 α-1,4-glikozydowe β-amylazy EC 3.2.1.2 α-1,4-glikozydowe glukoamylazy EC 3.2.1.3 α-1,4- i α-1,6-glikozydowe pululanazy EC 3.2.1.41 α-1,6-glikozydowe izoamylazy EC 3.2.1.68 α-1,6-glikozydowe Tabela 1. Wiązania hydrolizowane przez amylazy Metody oznaczania aktywności enzymów amylolitycznych Szybkość reakcji enzymatycznej można oznaczać: • poprzez określenie szybkości ubytku substratu bądź też • poprzez określenie ilości powstałych produktów w jednostce czasu. W przypadku enzymów z grupy amylaz mogą być zastosowane obydwa sposoby oznaczania aktywności enzymatycznej. Produktami hydrolizy skrobi wobec α-amylazy są kolejno: • amylodekstryny zawierające powyżej 30 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi • erytrodekstryny zawierające 8-12 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi oraz • achrodekstryny zawierające poniżej 6 reszt D-glukozy połączonej wiązaniami glikozydowymi, • a także maltoteraoza, maltotrioza oraz maltoza. Początkowe produkty degradacji skrobi tworzą z jodem barwne kompleksy, jednak achrodekstryny już tych kompleksów barwnych nie tworzą. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych poprzez mierzenie ubytku substratu w czasie bazuje na zmniejszeniu się zabarwienia hydrolizatu po dodaniu jego porcji do roztworu jodu (aż do uzyskania tzw. punktu achromowego, w którym roztwór jodu nie zmienia zabarwienia po dodaniu próbki hydrolizatu). Do takich metod należy miedzy innymi metoda Heinkela pozwalająca na podanie aktywności α-amylazy w jednostkach Wohlgemutha. Inną metodą pozwalającą na oznaczenie w ten sposób aktywności α-amylazy jest metoda Sandstedta, Kneena i Blisha. Aktywność amylaz możemy również określić na podstawie przyrostu redukcyjności roztworu. Powstające w wyniku reakcji cukry redukujące możemy oznaczać na różne sposoby np.: • z wykorzystaniem metody polegającej na pomiarze stopnia osłabienia intensywności zabarwienia alkalicznego roztworu heksascyjanożelazianu(III) potasu. W metodzie tej cukry redukujące reagują z alkalicznym roztworem heksascyjanożelazianu(III) potasu (którego roztwór ma barwę intensywnie żółtą) przekształcając go w bezbarwny heksascyjanożelazian(II) potasu • z wykorzystaniem metody Bernfelda, która polega na utlenianiu kwasem 3,5-dinitrosalicylowym grup redukujących uwolnionych podczas hydrolizy skrobi w obecności amylaz. W środowisku zasadowym grupa nitrowa soli sodowej kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) w pozycji 3 zostaje zredukowana do grupy aminowej, a powstałe pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, silnie absorbują światło przy długości fali 530 nm. Intensywność barwy będącą pochodną ilości powstających produktów oznacza się fotometrycznie • z wykorzystaniem metody Somogyi i Nelsona wykorzystującej, podobnie jak w poprzednio opisanych metodach, właściwości redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują jony miedzi(II) do jonów miedzi(I) w obecności winianu sodowo-potasowego (odczynnik Somogyi) z wytworzeniem tlenku miedzi CuO w postaci ceglastego osadu. Po dodaniu kwasu arsenomolibdenowego (odczynnik Nelsona) do utworzonego tlenku miedzi zachodzi redukcja tego kwasu do odpowiedniego barwnika o kolorze błękitnym, intensywność otrzymanej barwy można mierzyć w zakresie długości fali od 500-620 nm i jest ona proporcjonalna do ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych. Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość materiału badanego jest miarą aktywności enzymu. Aktywność ta jest wyrażana w jednostkach umownych i często różniących się w zależności od ustaleń autorów opracowujących daną metodę analityczną. Porównywanie wyników aktywności uzyskiwanych różnymi metodami może być mylące i dlatego Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U). Jednostką (U) każdego enzymu jest ta jego ilość, która katalizuje przemianę 1 µmola substratu (lub 1 µmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30oC i w optymalnych warunkach pH i temperatury dla danego enzymu. PRZEBIEG ĆWICZENIA Zadanie 1. Oznaczanie aktywności α-amylazy zawartej w ślinie Odczynniki: • roztwór śliny • 0.5% roztwór skrobi: naważkę 0.5g skrobi rozpuszczalnej w kolbce miarowej na 100 ml rozpuścić w 80 ml wody ogrzewając do wrzenia, uzyskany roztwór ochłodzić pod bieżącą wodą i jeśli po ochłodzeniu pozostanie klarowny to uzupełnić wodą do 100 ml • bufor fosforanowy pH 6.6 • 1% roztwór NaCl • odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI): 2g KI rozpuścić w 5 ml wody i w tym roztworze rozpuścić 1g jodu, po czym uzupełnić wodą do 100 ml. Podczas ćwiczenia używany jest roztwór macierzysty rozcieńczony 100-krotnie • 1M HCl Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: • cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem • lejek szklany • statyw z 11 probówkami • pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml, 2 ml oraz 5 ml) • gruszka do pipet • łaźnia wodna ze statywem na probówki ustawiona na 37oC • statyw metalowy wraz z łącznikiem i łapą trójkątną Wykonanie ćwiczenia 1. W cylindrze miarowym z korkiem (1) zebrać 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, całość wymieszać w celu ujednolicenia stężenia w całej objętości i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC. 2. Do zwykłej probówki (2) odmierzyć: 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, całość zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na co najmniej 5 minut. 3. Przygotować statyw z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl. 4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania cylindra (1) oraz probówki (2) w temperaturze 37oC, do probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w łaźni wodnej o temperaturze 37oC). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 1 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować Wykonanie ćwiczenia 1. W oznaczeniu tym skorzystać z roztworu śliny przygotowanego w zadaniu 1 w cylindrze miarowym z korkiem (1) i umieszczonego w łaźni wodnej o temperaturze 37oC. 2. Do trzech probówek (2) odmierzyć po 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml buforu i 2 ml 1% roztworu NaCl. Każdą probówkę (2) umieścić w innej łaźni (0oC i 80oC) oraz w zlewce na blacie (temperatura pokojowa). 3. Przygotować 3 statywy z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl każdy. 4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania probówki (2) w odpowiedniej temperaturze, do każdej probówki (2) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać roztwór pipetą w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w danej łaźni o określonej temperaturze). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 5 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2) (postępować w ten sposób z reakcją prowadzoną we wszystkich trzech temperaturach). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy. 5. Wypełnić poniższe tabelki wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+” lub „–” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola Temperatura 0oC Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 1 min. 2 min 3 min 4 min. 5 min. 7 min. 9 min. 11 min 13 min. 15* min. Zmiana barwy płynu Lugola * Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w 0oC nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego. Temperatura pokojowej Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 0.5 min. 1 min 1.5 min 2 min. 3 min. 4 min. 5 min. 7 min 9 min. 11 min. Zmiana barwy płynu Lugola Temperatura 80oC Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 1 min. 5 min 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min 40 min. 50 min. 60 min. Zmiana barwy płynu Lugola Zadanie 4. Wpływ dodatku silnych kwasów i zasad na aktywność α-amylazy zawartej w ślinie Odczynniki: • roztwór śliny • 0.5% roztwór skrobi • bufor fosforanowy pH 6.6 • 1% roztwór NaCl • woda destylowana • odczynnik Lugola (roztwór I2 w KI) • 1M HCl • 1M NaOH Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny: • cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem • 3 statywy z 12 probówkami każdy • pipety szklane (cztery pipety o poj. 1 ml, dwie pipety o poj. 2 ml oraz 5 pipet o poj. 5 ml) • gruszki do pipet • łaźnia wodna ustawiona na 37oC • statyw metalowy wraz z łącznikiem i łapą trójkątną • mała zlewka Wykonanie ćwiczenia 1. W oznaczeniu tym skorzystać z roztworu śliny przygotowanego w zadaniu 1 w cylindrze miarowym z korkiem (1) i umieszczonego w łaźni wodnej o temperaturze 37oC. 2. Do trzech probówek (2) odmierzyć po 2 ml 0.5% roztworu skrobi skrobi, 1 ml 1% roztworu NaCl, 1 ml buforu fosforanowego Probówki pozostawić w temperaturze pokojowej w trzech różnych statywach na stole. 3. Do trzech następnych probówek (3) odmierzyć po 1 ml roztworu śliny z cylindra (1). Do pierwszej z nich dodać 1 ml wody, do drugiej 1 ml 1M HCl, do trzeciej 1 ml 1M NaOH, zamieszać i umieścić wszystkie trzy probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na 15 minut. 4. Przygotować 3 statywy z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl każdy. 5. Po 15 minutach inkubacji enzymu z kwasem, ługiem lub wodą, zawartość probówek (3) zobojętnić wobec papierka wskaźnikowego (odpowiednio zasadą sodową lub kwasem solnym) i uzupełnić roztwór buforem fosforanowym do objętości 5 ml. 6. Następnie dodawać do probówek z substratem (2) roztwory enzymu z probówek (3) w następujący sposób: do pierwszej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej wodą, do drugiej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej kwasem, a do trzeciej probówki dodać 1 ml śliny traktowanej zasadą. Zawartość probówek wymieszać pipetą w całej objętości w celu ujednolicenia stężenia enzymu i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (reakcje prowadzone w temperaturze pokojowej, która należy sprawdzić i zanotować). W krótkich odstępach czasu (od 1 min. do 5 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki (2) (postępować w ten sposób z reakcją prowadzoną we wszystkich trzech probówkach). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy. 7. Wypełnić poniższe tabelki wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „+” lub „–” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola. Enzym traktowany wodą Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 1 min. 2 min 3 min 4 min. 5 min. 7 min. 9 min. 11 min 13 min. 15* min. Zmiana barwy płynu Lugola * Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w wodzie nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego. Enzym traktowany ługiem Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 1 min. 5 min 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min 40 min. 50 min. 60 min. Zmiana barwy płynu Lugola Enzym traktowany kwasem Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej 1 min. 5 min 10 min. 15 min. 20 min. 25 min. 30 min 40 min. 50 min. 60 min. Zmiana barwy płynu Lugola