Oznaczanie Aktywności Enzymu α-Amylazy: Ćwiczenie Laboratoryjne z Biotechnologii, Ćwiczenia z Biotecnologia

Pobierz Oznaczanie Aktywności Enzymu α-Amylazy: Ćwiczenie Laboratoryjne z Biotechnologii i więcej Ćwiczenia w PDF z Biotecnologia tylko na Docsity!

Instrukcja do zajęć laboratoryjnych z przedmiotu

Biotechnologia

Dla studentów kierunku Chemia specjalność Chemia Bioorganiczna

Materiały zostały wykonane w ramach realizowanego na Politechnice Śląskiej projektu nr UDA-POKL.04.01.01-00-114/09- pt.: „Unowocześnienie i rozszerzenie oferty edukacyjnej na kierunku Chemia na Wydziale Chemicznym Politechniki Śląskiej – otwarcie specjalności Chemia Bioorganiczna” współfinansowanego ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia jest oznaczanie aktywności enzymu z grupy hydrolaz na przykładzie α-amylazy zawartej w ślinie, a następnie zbadanie wpływu różnych czynników, takich jak: temperatura, obecność aktywatorów, czy pH środowiska na aktywność tej amylazy.

PODSTAWY TEORETYCZNE

Wstęp Ilość enzymu w układzie można oznaczyć na podstawie pomiaru szybkości katalizowanej przez niego reakcji. Szybkość reakcji nie zawsze jest jednak proporcjonalna do stężenia enzymu i najczęściej mierząc szybkość reakcji enzymatycznej określa się aktywność enzymu w określonych warunkach. Szybkość reakcji enzymatycznej, a więc konsekwentnie i aktywność enzymu jest zależna od wielu czynników zarówno fizycznych, jak i chemicznych. Oprócz stężenia enzymu i stężenia substratu, na aktywność enzymu mają wpływ takie czynniki jak: temperatura, pH roztworu w którym zachodzi reakcja, działanie aktywatorów lub inhibitorów oraz efektorów allosterycznych. Szybkość reakcji enzymatycznej wzrasta zwykle wraz ze wzrostem temperatury i dla większości enzymów temperatura optymalna zbliżona jest do 40oC. Nie jest to jednak reguła i znane są enzymy, dla których optymalna temperatura jest wyższa bądź niższa. Nadmierne podwyższenie temperatury prowadzi do ograniczenia lub zahamowania szybkości reakcji enzymatycznej na skutek denaturacji termicznej białka enzymatycznego. Termostabilość enzymu określa się podając najwyższą temperaturę, w której nie dochodzi do termicznej inaktywacji enzymu. Równie ważnym czynnikiem jak temperatura jest pH środowiska reakcji. Szybkość reakcji jest maksymalna przy optymalnym pH dla danego enzymu. Rozpiętość optimum pH dla reakcji enzymatycznych jest znaczna i waha się w zakresie od 1 do 9. Małe odchylenia od optymalnej wartości pH dla danego enzymu powodują zwykle nieznaczne zmniejszenie szybkości reakcji, jednak duże odchylenia pH od wartości optymalnej mogą prowadzić nawet do nieodwracalnej denaturacji białka enzymatycznego. Do innych czynników wpływających na szybkość reakcji enzymatycznych należą aktywatory i inhibitory. Mogą to być związki nisko- lub wielkocząsteczkowe zarówno nieorganiczne, jak i organiczne. Wiele enzymów wrażliwych jest nawet na małe stężenia soli metali ciężkich, które mają katalityczny wpływ na utlenianie grup hydrosulfidowych tlenem atmosferycznym. Inhibitorami mogą być również związki kompleksujące metale będące częścią centrum katalitycznego enzymu lub biorące udział w procesie katalitycznym. Do tej grupy związków zaliczane są cyjanki, azydki, H 2 S oraz CO. Za aktywowanie dużej grupy enzymów odpowiada z kolei obecność elektrolitów (Cl-, Br-, NO 3 - ). Do tej grupy enzymów należą amylazy. W ramach ćwiczenia oznaczana jest aktywność α-amylazy hydrolizującej jedynie wiązania α-1-4-glikozydowe więc jako hydrolizowany substrat zastosowano tzw. „skrobię rozpuszczalną” stanowiącą liniowy polimer zbudowany z jednostek D-glukozy połączonej wiązaniami α-1-4-glikozydowymi. Dodatkową zaletą użycia skrobi rozpuszczalnej jest możliwość przygotowania jej wodnego roztworu (podczas gdy frakcje skrobi zawierające amylopektynę są w wodzie nierozpuszczalne). Do oznaczenia aktywności α-amylazy posłużono się metodą bazującą na śledzeniu ubytku substratu w czasie i wyznaczaniu tzw. punktu achromowego.

Schemat 2. Budowa amylopektyny

Skrobia występuje w ziemniakach, ziarnie zbóż i w owocach, pestkach, bulwach oraz kłączach wielu innych roślin. Stosunek amylozy i amylopektyny jest zasadniczą cechą poszczególnych gatunków skrobi.

Enzymy amylolityczne

Enzymy stosowane do hydrolizy skrobi są zaliczane do podklasy hydrolaz (EC 3.2.). Typowymi enzymami trawiennymi, występującymi w ślinie i wydzielinie trzustki kręgowców są amylazy, które katalizują rozkład skrobi i glikogenu. Są one również obecne w roślinach, zwłaszcza w zarodkach ziarna zbóż, gdzie w procesie kiełkowania następuje ich gwałtowna synteza, mająca na celu szybkie uruchomienie energetycznego materiału zapasowego.

Podział amylaz

Znane są różne rodzaje amylaz, a podzielić je można w różny sposób. Z punktu widzenia możliwości hydrolizy różnych wiązań glikozydowych można je podzielić na:

• atakujące wiązania α-1,4-glikozydowe (α-amylazy, β-amylazy),
• atakujące wiązania α-1,6-glikozydowe (izoamylazy i pullulanazy) oraz
• hydrolizujące wiązania α-1,4-glikozydowe i α-1,6-glikozydowe (glukoamylazy i niektóre pullulanazy ). Biorąc pod uwagę miejsce cięcia wiązania glikozydowego w cząsteczce skrobi można je podzielić na:
• endoamylazy (α-amylazy, amylazy znoszące rozgałęzienia) oraz
• egzoamylazy (glukoamylazy i β-amylazy). Z punktu widzenia zachodzących procesów możemy je podzielić na enzymy:
• upłynniające (α-amylazy, izoamylazy, pululanazy) i
• scukrzające (β-amylazy, glukoamylazy i niektóre α-amylazy). Amylazy można tez podzielić z punktu widzenia źródeł ich pochodzenia, a także z punktu widzenia konfiguracji centrum anomerycznego uwalnianych produktów hydrolizy. Spośród licznych znanych amylaz głównymi są: α-amylaza zaliczana do endoamylaz oraz β-amylaza i glukoamylaza zaliczane do grupy egzoamylaz. Wszystkie katalizują hydrolizę wiązań 1-4-α-glikozydowych.

wiązanie α-1,6-glikozydowe

Zgodnie z nazwą „endoamylazy”, αααα -amylaza atakuje wiązania znajdujące się wewnątrz łańcucha (prowadząc do upłynniania skrobi i powstawania oligosacharydów ), natomiast ββββ -amylaza i glukoamylaza , jako egzoamylazy, rozrywają odpowiednio co drugie (β-amylaza) lub kolejne (glukoamylaza) wiązania glikozydowe, poczynając od nieredukującego końca łańcucha. Skrobia obok stosunkowo prostej do zhydrolizowania frakcji amylozy zawiera również frakcję amylopektyny złożoną z łańcuchów rozgałęzionych. Ponieważ wiązania α-1-6-glikozydowe, występujące przy rozgałęzieniach w amylopektynie, stanowią barierę dla działania ββββ -amylazy , rozkład tej frakcji skrobi jest inny: boczne łańcuchy są rozkładane przez β-amylazę do maltozy, podobnie jak prosty łańcuch amylozy, po czym reakcja zatrzymuje się w odległości trzech jednostek glukozy od miejsca rozgałęzienia (wiązania α-1,6-glikozydowego). Powstaje więc nierozłożona, wielkocząsteczkowa dekstryna graniczna , która stanowi około 40-45% masy amylopektyny i wykazuje znaczną lepkość w roztworze i fioletową barwę kompleksu z jodem. Tak powstała dekstryna graniczna ulega rozkładowi dopiero przy łącznym działaniu obu enzymów, gdyż α-amylaza jest w stanie „przeskakiwać” przez wiązania α-1,6-glikozydowe ( bez ich hydrolizy ), tworząc nowe, proste łańcuchy, które mogą już być dalej rozkładane przez β-amylazę. W wyniku łącznego działania α- i β-amylaz skrobia ulega hydrolizie do maltozy i izomaltozy oraz niewielkiej ilości wolnej glukozy. Najlepiej radzi sobie z amylopektyną (i glikogenem) glukoamylaza występująca w grzybach oraz u zwierząt. Rozkłada ona zarówno wiązania α-1,4-, jak i α-1,6-glikozydowe (o ile te ostatnie znajdują się przy nieredukujacej jednostce glukozy) i dlatego przy jej udziale amylopektyna i glikogen ulegają rozkładowi do glukozy. Zarówno sok jelitowy, jak i ziarna zbóż zawierają również α-1,4-glukozydazę i α-1,6-glukozydazę (izomaltazę). Enzymy te rozkładają wytworzone w wyniku działania β- amylazy disacharydy do cząsteczek glukozy, która jest końcowym produktem rozkładu enzymatycznego skrobi.

Nazwa EC Typ hydrolizowanych wiązań α-amylazy EC 3.2.1.1^ α-1,4-glikozydowe Β-amylazy EC 3.2.1.2 α-1,4-glikozydowe glukoamylazy EC 3.2.1.3 α-1,4- i α-1,6-glikozydowe pululanazy EC 3.2.1.41 (^) α-1,6-glikozydowe izoamylazy EC 3.2.1.68 (^) α-1,6-glikozydowe

Tabela 1. Wiązania hydrolizowane przez amylazy

ilości utworzonych cukrów redukujących w czasie działania enzymów amylolitycznych. Szybkość reakcji mierzona ilością przereagowanego związku w jednostce czasu w przeliczeniu na określoną ilość materiału badanego jest miarą aktywności enzymu. Aktywność ta jest wyrażana w jednostkach umownych i często różniących się w zależności od ustaleń autorów opracowujących daną metodę analityczną. Porównywanie wyników aktywności uzyskiwanych różnymi metodami może być mylące i dlatego Komisja Enzymowa Międzynarodowej Unii Biochemicznej wprowadziła pojęcie bezwzględnej międzynarodowej jednostki standardowej (U). Jednostką (U) każdego enzymu jest ta jego ilość, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu (lub 1 μmola odpowiednich grup chemicznych) w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30 oC i w optymalnych warunkach pH i temperatury dla danego enzymu.

PRZEBIEG ĆWICZENIA

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności αααα -amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny
• 0.5% roztwór skrobi: naważkę 0.5g skrobi rozpuszczalnej w kolbce miarowej na 100 ml rozpuścić w 80 ml wody ogrzewając do wrzenia, uzyskany roztwór ochłodzić pod bieżącą wodą i jeśli po ochłodzeniu pozostanie klarowny to uzupełnić wodą do 100 ml
• bufor fosforanowy pH 6.
• 1% roztwór NaCl
• odczynnik Lugola (roztwór I 2 w KI): 2g KI rozpuścić w 5 ml wody i w tym roztworze rozpuścić 1g jodu, po czym uzupełnić wodą do 100 ml. Podczas ćwiczenia używany jest roztwór macierzysty rozcieńczony 100-krotnie
• 1M HCl

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:

• cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem
• lejek szklany
• statyw z 11 probówkami
• pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml, 2 ml oraz 5 ml)
• gruszka do pipet
• łaźnia wodna ze statywem na probówki ustawiona na 37oC
• statyw metalowy wraz z łącznikiem i łapą trójkątną

Wykonanie ćwiczenia

1. W cylindrze miarowym z korkiem ( 1 ) zebrać 2 ml śliny i rozcieńczyć ją wodą do objętości 20 ml, całość wymieszać w celu ujednolicenia stężenia w całej objętości i odstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC.

2. Do zwykłej probówki ( 2 ) odmierzyć: 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml 1% roztworu NaCl, 2 ml buforu fosforanowego, całość zamieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37oC na co najmniej 5 minut.
3. Przygotować statyw z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl.
4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania cylindra ( 1 ) oraz probówki ( 2 ) w temperaturze 37oC, do probówki ( 2 ) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w łaźni wodnej o temperaturze 37oC). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 1 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki ( 2 ). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.
5. Wypełnić poniższą tabelkę wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „ + ” lub „ – ” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola.

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min.

min

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

6. Podać aktywność amylazy w ślinie w jednostkach/ml.

W tym ćwiczeniu za jednostkę aktywności amylazy przyjmujemy taką ilość enzymu, która hydrolizuje 25 mg skrobi w czasie 10 minut w temperaturze 37oC, w pH 6.6 w obecności jonów chlorkowych do produktów nie dających barwy z jodem.

Przykład obliczenia:

Jeśli do oznaczenie pobrano 1 ml dziesięciokrotnie rozcieńczonej śliny, a punkt achromowy osiągnięto po 5 minutach to aktywność amylazy wynosi: 10/5 x 10 = 20 jednostek/ml.

Zadanie 2. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność αααα -amylazy zawartej

w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny
• 0.5% roztwór skrobi
• bufor fosforanowy pH 6.
• woda destylowana

Zadanie 3. Wpływ temperatury na aktywność αααα -amylazy zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny
• 0.5% roztwór skrobi
• bufor fosforanowy pH 6.
• 1% roztwór NaCl
• odczynnik Lugola (roztwór I 2 w KI)
• 1M HCl

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:

• cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem
• 3 statywy z 11 probówkami każdy
• pipety szklane (po dwie pipety o poj. 1 ml i 2 ml oraz 4 pipety o poj. 5 ml)
• gruszki do pipet
• łaźnie wodne ustawione na 45oC i 80oC
• 2 statywy metalowe wraz z 2 łącznikami i 2 łapami trójkątnymi
• zlewka lub inne naczynie z lodem, w którym przygotowana zostanie łaźnia lodowa

Wykonanie ćwiczenia

1. W oznaczeniu tym skorzystać z roztworu śliny przygotowanego w zadaniu 1 w cylindrze miarowym z korkiem ( 1 ) i umieszczonego w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC.
2. Do trzech probówek ( 2 ) odmierzyć po 5 ml 0.5% roztworu skrobi, 2 ml buforu i 2 ml 1% roztworu NaCl. Każdą probówkę ( 2 ) umieścić w innej łaźni (0oC, 45oC i 80oC).
3. Przygotować 3 statywy z 10 probówkami zawierającymi po 0.5 ml odczynnika Lugola i 0.5 ml 1M HCl każdy.
4. Po co najmniej 5 minutach inkubowania probówki ( 2 ) w odpowiedniej temperaturze, do każdej probówki ( 2 ) dodać pipetą 1 ml roztworu śliny, zamieszać roztwór pipetą w celu ujednolicenia stężenia enzymu w całej objętości i zanotować czas rozpoczęcia kontaktu enzymu z substratem skrobiowym (wszystko odbywa się w danej łaźni o określonej temperaturze). W krótkich odstępach czasu (od 0.5 min. do 5 min.) do probówek zawierających płyn Lugola (umieszczonych w statywie na stole), wprowadzać pipetą 2-3 krople próbki hydrolizatu z probówki ( 2 ) (postępować w ten sposób z reakcją prowadzoną we wszystkich trzech temperaturach). Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Pobór próbek hydrolizatu kontynuować tylko do momentu, w którym nie obserwuje się już zmiany barwy roztworu jodu. Zanotować czas, po którym pobrana próbka nie zmienia barwy roztworu jodu, co znaczy że osiągnięto punkt achromowy.

5. Wypełnić poniższe tabelki wstawiając do odpowiednich rubryk czas oraz znak „ + ” lub „ – ” mówiący odpowiednio o zmianie barwy lub braku zmiany barwy w momencie zadozowania hydrolizatu do roztworu płynu Lugola

Temperatura 0oC

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

• Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w 0oC nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego.

Temperatura 45oC

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

Temperatura 80oC

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

Zadanie 4. Wpływ dodatku silnych kwasów i zasad na aktywność αααα -amylazy

zawartej w ślinie

Odczynniki:

• roztwór śliny
• 0.5% roztwór skrobi
• bufor fosforanowy pH 6.
• 1% roztwór NaCl
• woda destylowana
• odczynnik Lugola (roztwór I 2 w KI)
• 1M HCl
• 1M NaOH

Szkło i inne materiały oraz potrzebny sprzęt laboratoryjny:

• cylinder miarowy o poj. 25 ml z korkiem
• 3 statywy z 12 probówkami każdy

Enzym traktowany wodą

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

• Jeśli po 15 minutach od rozpoczęcia reakcji hydrolizy skrobi prowadzonej w 0oC nie uda się osiągnąć punktu achromowego, należy przygotować kolejnych 9 probówek z płynem Lugola i r-rem HCl i kontynuować pobieranie hydrolizatu w odstępach co 5 minut aż do uzyskania punktu achromowego.

Enzym traktowany ługiem

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

Enzym traktowany kwasem

Czas od rozpoczęcia reakcji enzymatycznej

min.

min

min.

min.

min.

min.

min

min.

min.

min.

Zmiana barwy płynu Lugola

PRZYGOTOWANIE DO ZAJĘĆ

1. Przeczytaj uważnie instrukcję i dokładnie przeanalizuj czynności oraz techniki laboratoryjne opisane w części eksperymentalnej.
2. Zapoznaj się z zagrożeniami związanymi z stosowanymi odczynnikami oraz poszczególnymi czynnościami wykonywanymi na zajęciach (karty charakterystyk).
3. Zwróć uwagę czy znasz następujące pojęcia: enzym, aktywatory i inhibitory enzymów, pH, denaturacja białek, homopolimer, wiązanie α-glikozydowe, amylazy, cukry redukujące.
4. Zastanów się czy wiesz: a) jak jest zbudowana skrobia (różnice w budowie amylozy i amylopektyny), b) do jakiej klasy enzymatycznej należą amylazy i jakie reakcje katalizują, c) jaki jest podział amylaz ze względu na mechanizm hydrolizy łańcuchów skrobi i jaka jest pomiędzy nimi różnica w działaniu, d) w jaki sposób możemy oznaczać postęp reakcji hydrolizy skrobi w obecności amylaz i oznaczyć aktywność tych enzymów, e) w jaki sposób tworzy się barwny kompleks skrobi z jodem f) co rozumiemy pod pojęciem jednostki aktywności amylazy.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

W celu opracowania sprawozdania należy: a) Na początku zamieścić dokładny opis przeprowadzonych oznaczeń z uwzględnieniem obserwacji poczynionych w trakcie dokonywania każdego oznaczenia (w sprawozdaniu nie zamieszczamy wstępu teoretycznego) b) Zestawić tabele z wynikami uzyskanymi w poszczególnych punktach wykonywanego ćwiczenia (czas uzyskania punktu chromowego w zależności od warunków prowadzonej reakcji) c) Tam, gdzie to możliwe, wyliczyć aktywność α-amylazy d) Na podstawie uzyskanych wyników podsumować wpływ poszczególnych czynników na aktywność badanego enzymu e) Sprawozdanie zakończyć wnioskami wyciągniętymi na podstawie uzyskanych wyników.

W całym sprawozdaniu należy zwracać uwagę aby opis dotyczył faktycznego !!! przebiegu ćwiczenia i nie był „kalką” instrukcji.

LITERATURA

• T. Kędryna, M. Gałka-Walczak, B. Ostrowska, Wybrane Zagadnienia z Biochemii Ogólnej z Ćwiczeniami , Wyd. Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków (2001).
• L. Kłyszejko-Stefanowicz, Ćwiczenia z Biochemii , Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, (2003).
• J-L. Reymond, Enzyme Assays , Weinheim: Wiley-VCH (2006)
• J. M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemia , PWN, Warszawa (2005).
• J. Kączkowski, Podstawy biochemii , WNT, Warszawa, (1993).