Oznaczanie zawartości chlorofilu w liściach metodą UV-vis, Opracowania z Ekologia

Pobierz Oznaczanie zawartości chlorofilu w liściach metodą UV-vis i więcej Opracowania w PDF z Ekologia tylko na Docsity! Julia Pachniewska 22.12.2023 Ćwiczenie 7 Spektrofotometryczna metoda oznaczania chlorofilu w roślinach Cel zadania Celem ćwiczenia było oznaczenie ilościowe chlorofilu w liściach Lucerny za pomocą spektrofotometru UV-vis oraz zapoznanie z metodą ekstrakcji chlorofilu z próbek roślinnych. Opis ćwiczenia oraz zjawiska Ćwiczenie rozpoczęto od przygotowania próbki do analizy. W tym celu na wadze analitycznej odważono 0,2896g sproszkowanych liści Lucerny. Odważkę przeniesiono ilościowo do moździerza porcelanowego i ucierano z 2cm3 metanolu. Dodano kolejną porcję metanolu u ponownie roztarto pastę. Zawiesinę przeniesiono ilościowo do cylindra miarowego o objętości 25 cm3 przepłukując tłuczek i moździerz. Uzyskany roztwór dopełniono do objętości 10 cm3. Po wytrząsaniu próbki przez 15 sekund odstawiono ją w do szafki na okres 15 minut. Po tym czasie zawartość cylindra przesączono przez średni sączek na lejku szybkoschnącym. Otrzymany roztwór badano za pomocą spektrofotometru UV-vis stosując roztwór metanolu roztwór odniesienia. Zaobserwowano 5 maximów absorpcji przy długościach fali: 410, 469, 536, 611, 666 nm. Odczytano absorbancję w tych punktach i przedstawiono w tabeli 1: Tabela 1. Absorbancja dla danej długości fali w maximach lokalnych. λ [nm] A 410 3,013 469 1,687 536 0,359 611 0,514 666 1,692 Następnie ponownie zmierzono absorbancje przy długościach fali λ = 611 i λ = 666 nm. Otrzymano, że: Tabela 2. Absorbancja dla danej długości fali λ [nm] A 611 0,514 666 1,692 Stwierdzono, że otrzymana absorbancja nie mieści się w zakresie, dla którego można wyznaczyć stężenie chlorofilu w próbce A=0,10÷0,80. Próbkę rozcieńczono metanolem w stosunku 1:1 mieszając 2 cm3 roztworu chlorofilu oraz 2 cm3 metanolu. Ponownie zmierzono wartość absorbancji przy długościach fali λ = 611 i λ = 666 nm. Otrzymano, że: Tabela 3. Absorbancja dla danej długości fali w roztworze rozcieńczonym λ [nm] A 611 0,241 666 0,828 Opracowanie wyników Na podstawie powyższych wyników oraz zależności podanych przez MacKinney’a obliczono całkowitą zawartość chlorofilu: c [mg/dm3] =8,02 × A (666) + 20,2×A (611) c [mg/dm3] =8,02 × 0,828 + 20,2×0,241=11,51 [mg/dm3] Należy uwzględnić, że próbka z chlorofilem została rozcieńczona w stosunku 1:1. Należy więc wyznaczyć stężenie chlorofilu w nierozcieńczonej próbce. Skoro próbka został rozcieńczona w stosunku 1:1 to stężenie chlorofilu zmalało dwukrotnie. Oznacza to, że wyjściowe stężenie chlorofilu w próbce jest dwa razy większe niż to obliczone z powyższego wzoru. Całkowite stężenie chlorofilu wynosi więc 23,02 mg/dm3. Następnie przystąpiono do wyznaczeni poszczególnych zawartości chlorofilu a oraz chlorofilu b zgodnie ze wzorami: c (chlorofilu a) [mg/dm3] =12,7 × A (666) - 2,69× A (611) c (chlorofilu b) [mg/dm3] =22,9 × A (666) - 4,68 × A (611) c (chlorofilu a) [mg/dm3] =12,7 × 0,828 - 2,69× 0,241=9,87 mg/dm3 c (chlorofilu b) [mg/dm3] =22,9 × 0,241 - 4,68 × 0,828=1,64 mg/dm3 Należy ponownie uwzględnić efekt rozcieńczenia próbki. Również w tym wypadku stężenie rzeczywiste jest 2 razy większe niż to obliczone ze wzoru. Oznacza to, że stężenia wynoszą odpowiednio: 19,73 mg/dm3 w przypadku chlorofilu a oraz 3,29 mg//dm3 w przypadku chlorofilu b. Kolejnym krokiem było wyznaczenie zawartości chlorofilu w mg/kg badanej próbki. W tym celu obliczono zawartość chlorofilu w mg w 25 cm3 roztworu znajdującego się w cylindrze miarowym. Obliczono, że masa chlorofilu wynosi: m chlorofilu [mg]=0,025dm3× 23,02 mg/dm3=0,58 mg Wyznaczona zawartość chlorofilu pochodzi wyłącznie z 0,2896g sproszkowanych liści Lucerny. Z prostej proporcji wyznaczono więc masę chlorofilu w mg/kg analitu: m chlorofilu [mg/kg substancji] = 1000g/kg × 0,58mg×/0,2896g=1987,1mg/kg Według literatury chlorofil stanowi około 0,25% masy liścia. W tym przypadku masa chlorofilu masa chlorofilu wyrażona w g/kg analizowanej substancji wynosi 1,99g na 1kg