Docsity
Docsity

Przygotuj się do egzaminów
Przygotuj się do egzaminów

Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity


Otrzymaj punkty, aby pobrać
Otrzymaj punkty, aby pobrać

Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium


Informacje i wskazówki
Informacje i wskazówki

Oznaczanie zawartości kwaśnej fosfatazy w homogenacie z ziemniaka, Laboratoria z Chemia bioorganiczna

Opisane ćwiczenie laboratoryjne do wykonania

Typologia: Laboratoria

2019/2020

Załadowany 16.07.2020

Aleksander88
Aleksander88 🇵🇱

4.7

(120)

463 dokumenty

1 / 3

Toggle sidebar

Ta strona nie jest widoczna w podglądzie

Nie przegap ważnych części!

bg1
Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) jest enzymem znacznikowym (markerem) lizosomów.
Fosfa tazy należą do klasy hydrolaz (klasa 3 obejmująca e nzymy katalizujące hydrolityczny
rozpad wiązań chemicznych), podklasy esteraz (obejmującą enzymy hydrolizujące wiązania
estrowe), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych.
Tabela 1. Klasy enzymów
Klasa
Nazwa
Charakterystyka
EC 1
oksydoreduktazy
katalizują odwracalne reakcje utleniania i redukcji,
a więc przemiany związane z przeniesieniem
protonów i elektronów;
ważne podklasy: oksydazy, peroksydazy,
reduktazy,
monooksygenazy,
dioksygenazy
EC 2
transferazy
katalizują przenoszenie grup funkcyjnych z
cząsteczki jednej substancji (donor) na cząsteczkę
drugiej substancji (akceptor);
ważne podklasy: C1-transferazy (przenoszące
grupy jednowęglowe), acylotransferazy,
aminotransferazy, fosfotransferazy (kinazy),
glikozylotransferazy
EC 3
hydrolazy
katalizują rozpad substratu pod wpływem wody -
na drodze hydrolizy;
ważne podklasy: esterazy, glikozydazy, peptydazy
,
lipazy, nukleazy
EC 4
liazy
katalizują odszczepienie od substratów określonej
grupy chemicznej (niehydrolitycznie) z
wytworzeniem podwójnego wiązania lub
odwrotnie, przyłączają grupy do wiązania
podwójnego;
ważne podklasy: liazy C-C,
liazy C-O,
liazy C-N,
liazy C-S
EC 5
izomerazy
zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych
bez rozkładu szkieletu związku; powodują
wewnątrzcząsteczkową izomeryzację;
ważne podklasy: epimerazy, izomerazy cis trans,
transferazy wewnątrzcząsteczkowe
EC 6
ligazy (syntetazy)
powodują łączenie dwóch substratów kosztem
energii z ATP; uczestniczą w tworzeniu nowych
wiązań chemicznych;
ważne podklasy: syntetazy C-C
syntetazy C-O
syntetazy C-N
syntetazy C-S
Fosfatazy katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrów, białek, tłuszczy, nukleotydów
i wielu innych występujących w przyrodzie estrów kwasu fosforowego. Poniży schemat
przedstawia substraty i produkty tej reakcji:
4. Oznaczanie zawartości kwaśnej fosfatazy w homogenacie z ziemniaka
pf3

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Oznaczanie zawartości kwaśnej fosfatazy w homogenacie z ziemniaka i więcej Laboratoria w PDF z Chemia bioorganiczna tylko na Docsity!

Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) jest „ enzymem znacznikowym ” (markerem) lizosomów. Fosfatazy należą do klasy hydrolaz (klasa 3 obejmująca enzymy katalizujące hydrolityczny rozpad wiązań chemicznych), podklasy esteraz (obejmującą enzymy hydrolizujące wiązania estrowe), podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych.

Tabela 1. Klasy enzymów Klasa Nazwa Charakterystyka EC 1 oksydoreduktazy (^) katalizują odwracalne reakcje utleniania i redukcji, a więc przemiany związane z przeniesieniem protonów i elektronów; ważne podklasy: oksydazy, peroksydazy, reduktazy, monooksygenazy, dioksygenazy EC 2 transferazy (^) katalizują przenoszenie grup funkcyjnych z cząsteczki jednej substancji (donor) na cząsteczkę drugiej substancji (akceptor); ważne podklasy: C 1 - transferazy (przenoszące grupy jednowęglowe), acylotransferazy, aminotransferazy, fosfotransferazy (kinazy), glikozylotransferazy EC 3 hydrolazy (^) katalizują rozpad substratu pod wpływem wody - na drodze hydrolizy; ważne podklasy: esterazy, glikozydazy, peptydazy, lipazy, nukleazy EC 4 liazy (^) katalizują odszczepienie od substratów określonej grupy chemicznej (niehydrolitycznie) z wytworzeniem podwójnego wiązania lub odwrotnie, przyłączają grupy do wiązania podwójnego; ważne podklasy: liazy C-C, liazy C-O, liazy C-N, liazy C-S EC 5 izomerazy (^) zmieniają wzajemne położenie grup chemicznych bez rozkładu szkieletu związku; powodują wewnątrzcząsteczkową izomeryzację; ważne podklasy: epimerazy, izomerazy cis trans, transferazy wewnątrzcząsteczkowe EC 6 ligazy (syntetazy) (^) powodują łączenie dwóch substratów kosztem energii z ATP; uczestniczą w tworzeniu nowych wiązań chemicznych; ważne podklasy: syntetazy C-C syntetazy C-O syntetazy C-N syntetazy C-S

Fosfatazy katalizują odszczepienie reszty fosforanowej od cukrów, białek, tłuszczy, nukleotydów i wielu innych występujących w przyrodzie estrów kwasu fosforowego. Poniży schemat przedstawia substraty i produkty tej reakcji:

4. Oznaczanie zawartości kwaśnej fosfatazy w homogenacie z ziemniaka

Wyróżnia się fosfatazy działające w środowisku alkalicznym (EC 3.1.3.1), w zakresie pH 9 - 11 oraz fosfatazy działające w środowisku kwaśnym, w zakresie pH 3,8 – 7,0. Te ostatnie są typowe dla komórek roślinnych, chociaż nie brakuje ich także w komórkach zwierzęcych, gdzie występują przede wszystkim w lizosomach - niewielkich błonowych pęcherzykach będących głównym miejscem trawienia wewnątrzkomórkowego. Lizosomy zawierają specyficzny zestaw hydrolaz (Rys. 1), aktywnych w środowisku kwaśnym, uczestniczących w rozkładzie organelli komórkowych i wszystkich rodzajów makrocząsteczek dostarczanych do komórki różnymi drogami. Wiodącym enzymem jest tu kwaśna fosfataza uznawana za tzw. „enzym znacznikowy” lizosomów. Kwaśne środowisko wnętrza lizosomu (pH~5) utrzymywane jest dzięki działaniu błonowej H+-ATPazy, pompującej H+^ z cytozolu do wnętrza lizosomu.

Rys. 1. Schemat lizosomu (wg Albertsa i wsp. 1999)

W obojętnym pH cytoplazmy (pH 7–7,3), hydrolityczne enzymy lizosomalne wykazują niską aktywność. Stanowi to przypuszczalnie mechanizm obronny przed samoistnym strawieniem komórki, w przypadku gdyby enzymy dostały się do cytoplazmy. W komórkach roślin i grzybów rolę lizosomów pełni wakuola komórkowa. Kwaśny odczyn wnętrza wakuoli, istotny dla aktywności występujących tam enzymów hydrolitycznych, utrzymywany jest dzięki działaniu dwóch pomp protonowych (H+-ATPazy i H+-PPazy) zlokalizowanych w błonie otaczającej wakuolę, tzw. tonoplaście. Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają także estry fosforanowe fenoli, np. p- nitrofenylofosforan.

Odczynniki i sprzęt:

  1. 50 g Ziemniaków
  2. Tarka do ziemniaków
  3. Próbówki szklane
  4. Statywy do próbówek
  5. Pipety automatyczne
  6. Łaźnia wodna
  7. Spektrofotometr UV-VIS
  8. 12 mL 0,005 M roztworu soli dwusodowej kwasu nitrofenylofosforanowego (M=371,14 g/mol) ( przygotować bezpośrednio przed użyciem )
  9. 5 mL 0,1 M Buforu cytrynianowego o pH 5,
  10. 15 mL 1 N roztworu NaOH
  11. 10 mL 0,005 M Roztworu p -nitrofenolu w wodzie (M=139 g/mol)