Pobierz Peptydoglikan - budowa, rola biologiczna oraz synteza i więcej Publikacje w PDF z Chimica tylko na Docsity!
2015, 69 , 7-
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA
ORAZ SYNTEZA
PEPTIDOGLYCAN – STRUCTURE, BIOLOGICAL
ACTIVITY AND CHEMICAL SYNTHESIS
Justyna Samaszko-Fiertek*, Barbara Dmochowska,
Janusz Madaj
Uniwersytet Gdański, Wydział Chemii, Pracownia Chemii Cukrów ul. Wita Stwosza 63, 80-303 Gdańsk *e-mail: [email protected]
Abstract Wykaz stosowanych symboli i oznaczeń Wprowadzenie
- Peptydoglikan 1.1. Budowa 1.2. Rola biologiczna 1.3. Struktura trzeciorzędowa 1.4. Biosynteza 1.5. Synteza chemiczna Uwagi końcowe Podziękowanie Piśmiennictwo cytowane
514 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
Dr hab. Janusz Madaj, prof. nadzw. UG , ukończył studia chemiczne na Wydziale Chemii Uniwersytetu Gdańskiego w roku 1989. W tym samym roku podjął pracę w Zakładzie Chemii Cukrów UG. Stopień doktora nauk chemicznych uzyskał w roku 1995. W latach 1997–8 odbył staż naukowy w Case Western Reserved Uni- versity w Cleveland, Ohio USA w grupie profesora Vincenta M. Monnier. W roku 2004 uzyskał stopień doktora habilitowanego nauk chemicznych po przedstawie- niu rozprawy na temat: „Badania dróg tworzenia i przemian wybranych związków cukrowych”. Jego aktualne zainteresowania naukowe skupiają się na chemii orga- nicznej ze szczególnym uwzględnieniem chemii węglowodanów. Ostatnio swoje prace koncentruje na badaniach mechanizmu oddziaływania wankomycyny ze ścianą komórkową bakterii Gram-dodatnich oraz wpływem na to oddziaływanie fragmentów cukrowych.
Dr Barbara Dmochowska w roku 1994 ukończyła Wydział Chemii Uniwersytetu Gdańskiego w Gdańsku. Jest adiunktem w Pracowni Chemii Cukrów na Wydziale Chemii Uniwersytetu Gdańskiego. Tematyka badawcza: tworzenie czwartorzędo- wych soli N- d-glikoamoniowych i alditoliloamoniowych z udziałem amin o poten- cjalnych właściwościach biologicznych.
Dr Justyna Samaszko-Fiertek w roku 2004 ukończyła Wydział Chemii Uniwersy- tetu Gdańskiego w Gdańsku. Stopień doktora nauk chemicznych uzyskała w roku
- Jest adiunktem w Pracowni Chemii Cukrów na Wydziale Chemii Uniwer- sytetu Gdańskiego. Tematyka badawcza: badaniach mechanizmu oddziaływania wankomycyny ze ścianą komórkową bakterii Gram-dodatnich, opracowanie metod syntezy nowych pochodnych antybiotyków glikopeptydowych.
516 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW
Używane w tekście symbole aminokwasów oraz ich pochodnych są zgodne z postanowieniami IUPAC-IUB Joint Commision on Biochemical Nomenclature zawartymi w Eur. J. Biochem., 1985, 138 , 9-37 oraz A Short Guide to Abbreviations and Their Use In Peptide Science, J. Peptide Sci., 1999, 5 , 465-471. W wypadkach nie objętych postanowieniami stosowano oznaczenia powszechnie przyjęte w chemii peptydów.
AFM – ang. Atomic Force Microscopy ATP – adenozyno-5’-trifosforan GalNAc – N-acetylo-d-galaktozamina GlcNAc – N-acetylo- d-glukozamina MDP – muramylodipeptyd MurG – N-acetyloglukozaminylotransferaza MraY – specyficzna translokazy MTP – muramylotripeptyd MurA – transferaza enoilopirogroniowa MurNAc – kwas N-acetylo-d-muraminowy NADPH – dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy PGN – ang. peptidoglycan TEM – transmisyjny mikroskop elektronowy UDP-GlcNAc – UDP-N-acetylo-d-glukozamina UTP – urydyno-5’-trifosforan
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 517
WPROWADZENIE
W życiu człowieka od zawsze towarzyszą jemu wszelkiego rodzaju drobno- ustroje – grzyby, bakterie, wirusy, itp. Niektóre z nich mają dobroczynny charakter, a niekiedy nawet ich obecność jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Część z nich odnalazła swoje zastosowanie w probiotykach np. bak- terie kwasu mlekowego, tak bardzo ważne do stosowania w trakcie prowadzonej kuracji antybiotykowej. Chronią one przed rozwojem innych infekcji, grzybów i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania jelit. Niestety wiele bakterii ma cha- rakter chorobotwórczy. Przyczyniają się do rozwoju wielu infekcji, prowadzących do groźnych, niekiedy wręcz nieuleczalnych chorób. W przeciągu ostatnich kilku lat powodem wielu poważnych schorzeń były bakterie Gram-dodatnie. Największa zjadliwość wśród nich przypisywana jest gronkowcowi złocistemu (Staphylococcus aureus). Szacuje się, że od 10 do 50% populacji ludzkiej jest na stałe lub okresowo nosicielami tego drobnoustroju, z czego u znacznej większości nie zaobserwowano występowania objawów chorobotwórczych. Żyją oni z tą bakterią w ciągłej symbio- zie, są dla niej pewnego rodzaju żywicielem, nieustannie dostarczają jej pokarm, a w zamian gronkowiec chroni swojego „dobroczyńcę” przed innymi bakteriami. Niestety Staphylococcus aureus pomimo swojego „dobroczynnego wpływu”, jeśli tylko spotka sprzyjające warunki (np. obniżona odporność organizmu) zaczyna siać powszechny postrach. Gronkowiec złocisty uważany jest od wielu lat za jeden z podstawowych patogenów odpowiedzialnych za zakażenia szpitalne i pozaszpi- talne ludzi. Odpowiedzialny jest on m.in. za zakażenia ran chirurgicznych, zapa- lenie płuc, zapalenie opon mózgowych oraz zakażenia noworodków na oddziałach intensywnej terapii. Pojawienie się coraz to nowszych, bardziej niebezpiecznych infekcji wywoła- nych przez kolejne szczepy bakteryjne przyczyniło się do konieczności poznania mechanizmów ich zjadliwości. Powstanie nowych i rozwinięcie się już istniejących technik analitycznych pozwoliło na kompleksową analizę budowy ściany komór- kowej, jak również próby jej syntetycznego „odtworzenia”, co niewątpliwie ułatwia poznanie ogromu czynników ich wirulentności i patogenności bakterii. Wśród nich wyróżniamy m. in. zdolność wytwarzania toksyn czy enzymów zewnątrz wydziel- niczych, jednakże w tym aspekcie dużą rolę odgrywa również sama budowa ściany komórkowej bakterii. Gronkowiec złocisty w głównej mierze zbudowany jest z pep- tydoglikanu (50–90%), który sam charakteryzuje się właściwościami immunosty- mulacyjnymi. Już w 1974 roku wykazano, że najmniejszym fragmentem adiutan- towo czynnym jest muramylodipeptyd (MDP), stymulujący wytwarzanie licznych cytokin. Jednakże fragmentu tego nie można wyodrębnić bezpośrednio ze ściany komórkowej bakterii, a można go otrzymać wyłącznie na drodze syntezy chemicz- nej. Obserwowane problemy w dopracowaniu technik izolowania materiału bio- logicznego, odznaczającego się wysoką czystością zwróciły uwagę na konieczność rozwoju technik syntezy chemicznej określonych fragmentów, stanowiących analogi
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 519
Rysunek 1. Przykłady peptydoglikanu występującego w przyrodzie [2] Figure 1. Examples of peptidoglycan fragments [2]
W przypadku bakterii Gram-ujemnych w miejsce l-Lys występuje najczęściej meso-Dap (np. Escherichia coli, Rys. 1b). Ważnym elementem budowy mureiny są mostki peptydowe. Łączą one poszczególne łańcuchy glikanu nadając silnie usie- ciowaną, trójwymiarową, sztywną strukturę, co stanowi istotną cechę tego typu związków. Mostki peptydowe mogą różnić się od siebie w zależności od bakterii zarówno składem, jak i długością. Powoduje to, że wyróżniamy kilka typów mureiny. W typie A wiązanie poprzeczne powstaje pomiędzy grupą karbonylową d-alaniny z pozycji 4, a wolną grupą aminową aminokwasu diaminowego w pozycji 3 z sąsied - niego peptydu. W obrębie tej klasy wyróżniamy dodatkowo kilka podtypów. W przy- padku A1 wiązanie peptydowe między obydwiema resztami jest bezpośrednie, ale może różnić się obecnością reszty diaminowej:
- A1α – w tworzeniu wiązania uczestniczy l-lizyna;
- A1β – grupa aminowa z łańcucha bocznego pochodzi od reszty l-ornityny;
- A1γ – obecny jest kwas diaminopimelinowy (charakterystyczny dla więk- szości bakterii Gram-ujemnych np. E. coli, rzadziej Gram-dodatnich, np. L. monocytogenes). W mureinie podtypu A2 w tworzeniu mostków peptydowych biorą udział te same reszty aminokwasowe, które obecne są w fragmencie peptydowym. W momencie gdy mostek składa się z dwóch do siedmiu reszt aminokwaso- wych, mamy do czynienia z podtypem A3, dla którego charakterystycznym przed- stawicielem jest gronkowiec złocisty. W skład jego peptydoglikanu wchodzą mostki pentaglicynowe, zaś w przypadku S. pyogenes dialanylowe [2]. Wiązania poprzeczne w mostkach utworzone przez aminokwasy dikarbosylowe (najczęściej d-asparaginę, d- lub l-glutaminę) występują w podtypie A4.
520 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
W przypadku mureiny typu B, mostki powstają pomiędzy resztą d -glutaminy w pozycji 2 jednego peptydu, a czwartą resztą aminokwasową (d-alaniną) sąsiedniego. Reszty te połączone są ze sobą przy pomocy aminokwasu diaminowego.
1.2. ROLA BIOLOGICZNA
Pierwszą linią obrony układu immunologicznego organizmów przeciwko mikroorganizmom jest rozpoznanie podstawowych składników ich budowy takich, jak peptydoglikan, lipopolisacharydy, lipoproteiny czy DNA bakteryjne. Związki te posiadają pewnego rodzaju mediatory, do których zaliczamy cytokiny, prosta- glandynę czy tlenek azotu NO ułatwiające identyfikację obcych organizmów [36]. W wielu pracach peptydoglikanowi przypisuje się właściwości immunoadiuwan- towe (immunostymulacyjne, ang. immunopotentatior), jednakże mechanizm ich działania jak dotąd nie został dokładnie poznany [7, 8]. Przez długie lata prowadzono pracę nad toksycznością, zjadliwością frag- mentów mureiny i w 1974 roku odkryto, że najmniejszym fragmentem peptydo- glikanu wykazującym minimum aktywności bakteryjnej (adiuwantowo czynnym) jest muramylodipeptyd MDP, N-acetylo-d-muramylo-l-alanylo-d-izoglutamina (Rys. 2). Otrzymuje się go jedynie na drodze chemicznej syntezy [9], ponieważ enzymatyczna hydroliza materiału biologicznego prowadzi jedynie do otrzymania muramylotripeptydów (MTP), które wykazują się podobnie jak MDP właściwo- ściami immunostymulacyjnymi.
O
OH
O
HO OH CH (^3) O NHAc
L -Ala D-iGln
Rysunek 2. Budowa muramylodipeptydu (MDP) Figure 2. Structure of muramylodipeptide (MDP)
Ze względu na znaczne właściwości biologiczne tego najmniejszego fragmentu przeprowadzono szeroki zakres badań mających na celu otrzymanie jego analogów. Starano się zwiększyć, a niekiedy nawet polepszyć jego właściwości farmakologiczne [10]. Synteza tego typu fragmentów nastręcza niekiedy wielu problemów. Pionierem w tego typu pracy był Arendta wraz ze swoimi współpracownikami [11]. Przed- stawił on nowy sposób otrzymywania muramylopeptydów, będących pochodnymi peptydowymi o skomplikowanej strukturze. Zademonstrował syntezę muramylote- trapeptydu, stanowiącego odpowiednik naturalnego fragmentu ściany komórkowej bakterii [12].
522 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
W budowie komórki peptydoglikan pełni wiele funkcji, odpowiedzialny jest m.in. za utrzymanie ciśnienia osmotycznego, kształt oraz nadaje jej wielkość. Sta- nowi przykład cylindrycznego lub kulistego nierozpuszczalnego polimeru, zapew- niającego mechaniczną ochronę przed czynnikami zewnętrznymi oraz turgorem wewnątrzkomórkowym. Ważnym etapem prac nad peptydoglikanem były badania nad jego gru- bością, a wysuwane wnioski zależne były od zastosowanej metody. Początkowo do pomiarów wykorzystywano transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM), a próbkę odwadniano i utrwalano. Inna metoda opierała się na określeniu ilości znakowanych radioaktywnie składników mureiny, a następnie przy użyciu wzorów chemicznych dokonaniu odpowiednich wyliczeń. Na tej podstawie określono grubość mureiny dla E. coli wahającej się w granicach od 1 do 3 nm. Zastosowanie mikroskopii sił atomowych AFM (ang. Atomic Force Microscopy) odzwierciedlało wyniki bliższe warunkom panującym in vivo. Pomiary prowadzone były w środowisku wodnym i wskazywały, że grubość warstwy dla E. coli wynosi około 6 nm, zaś dla gronkowca złocistego 20–40 nm.
1.3. STRUKTURA TRZECIORZĘDOWA
Pomimo intensywnych badań i zdobycia znacznej wiedzy o właściwościach fizycz- nych i biologicznych, syntezie chemicznej czy biosyntezie peptydoglikanu, nie udało się jak dotąd w sposób jednoznaczny określić jej trójwymiarowej struktury. Pierwsze hipotezy na jej temat powstawały już w latach 70-tych. Wówczas, ze względu na obec- ność wiązania β(1→4) O-glikozydowego w mureinie, sądzono, że polimery glikanowe wykazują analogię do chityny. Budowa jej wydaje się stosunkowo prosta i sztywna, do reszty MurNAc przyłączone są dodatkowo łańcuchy peptydowe, ułożone w jed- nym kierunku [15]. Kolejne hipotezy zwracały uwagę na konieczność tworzenia się wiązań wodo- rowych w obrębie struktury. Kelman i Rogers zasugerowali, że oddziaływania te powstają pomiędzy sąsiadującymi łańcuchami peptydowymi, pochodzącymi od dwóch różnych łańcuchów glikanu. Dalsze badania wskazywały, że wiązania wodo- rowe tworzą się w obrębie jednego peptydu, a nie jak wcześniej przypuszczano dwóch sąsiadujących, przyjmując postać 2,2 7 helisy [15]. Wykorzystanie spektroskopii w podczerwieni i analizy rentgenograficznej pozwoliło ustalić, że łańcuchy cukrowe w przeciwieństwie do chityny nie są ani proste ani sztywne, lecz przyjmują postać prawoskrętnej helisy. Obrót następuje co 4 dwucukrowe podjednostki, z których pod kątem prostym wychodzą łańcuchy peptydowe, ułożone prostopadle względem siebie. Kolejny proponowany model zakładał, że łańcuchy glikanu przyjmują kształt długich cylindrów (ang. long cylinders) [16] lub rozciągniętej liny (ang. stretched ropes) [17] otoczonej ciasną spiralą pojedynczych podstawników peptydowych. Poszczególne warstwy glikanu ułożone były względem siebie i powierzchni komórki
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 523
równolegle, dodatkowo obrócone o kąt 60° względem sąsiedniego łańcucha. W ten sposób warstwa mureiny przyjmowała kształt „sklejki” (ang. „plywood”-type). Wymusza ona duże konformacyjne zniekształcenie względem łańcuchów peptydo- wych, osiągając tym samym duży stopień ich usieciowania. Zastosowanie metod modelowania molekularnego pozwoliło na zaproponowa- nie prostopadłego ułożenia łańcuchów glikanu do powierzchni komórki bakteryj- nej, tzw. model rusztowy (ang. scaffold model). Gwarantuje on wysoki stopień usie- ciowania sięgający nawet 80–90%, co zgodne jest z uzyskanymi wcześnie danymi eksperymentalnymi [18, 19]. Za tym modelem przemawiają obliczenia i badania wykonane m.in. przez Dimitrieva [20]. Do czasu opracowania metod wizualizacji in vivo budowy komórki na pozio- mie molekularnym trudno będzie wskazać właściwą teorię ułożenia łańcuchów mureiny. Związane jest to z różnorodnością typów peptydoglikanu występujących w przyrodzie, stopniem ich usieciowania oraz ilością tworzących się warstw. Zasadni- cze różnice dotyczą mureiny bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Przypusz- cza się, że S. aureus jest przykładem najbardziej usieciowanego i niezwykłego typy mureiny i jedynie metoda rusztowa może w pełni odzwierciedlać jego strukturę.
1.4. BIOSYNTEZA
Historia badań nad biosyntezą fragmentu peptydoglikanu ściany komórkowej bakterii sięga już półwiecza. Park jako pierwszy wyizolował z hodowli gronkowca złocistego „traktowanego” penicyliną prekursor nukleotydu odpowiedzialnego za rozrost peptydoglikanu, a było to w wczasach gdy nie wiedziano jeszcze o istnieniu takiej makromolekuły [21]. Lata intensywnych badań doprowadziły do wysunięcia wniosku, że na biosyn- tezę mureiny składa się wiele kluczowych etapów. Dokładne określenie/rozgrani- czenie, który z nich jest najważniejszy jest bardzo trudne, ale można dokonać pod- stawowego podziału w zależności od miejsca w komórce, w którym zachodzi ten proces [22, 23]:
- Cytoplazma – w tej części gromadzone są prekursory peptydoglikanu, zbu- dowane z reszty N-acetylo-d-glukozaminy i kwasu N-acetylo-d-murami- nowego, do którego grupy karboksylowej przyłączone są krótkie fragmenty peptydowe (Schemat 1) [24];
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 525
undecaprenol). Powstałe prekursory transportowane są na nośnik lipidowy, który występuje w błonie komórkowej, a następnie przenoszone są przez nią z równoczesnym odłączeniem lipidowego przenośnika-fosforanu unde- kaprenylu (Rys. 5). Proces ten przebiega na pograniczu trzech warstw – cytoplazmy, zewnętrznej warstwy komórki, a przede wszystkim w błonie cytoplazmatycznej.
Rysunek 5. Przeniesienie prekursorów peptydoglikanu przez błonę cytoplazmatyczną [25] Figure 5. The transfer of the peptidoglycan precursor across the cytoplasmic membrane [25]
Ostatni etap polega na polimeryzacji przetransportowanych fragmentów mure- iny. Zachodzi on na zewnętrznej warstwie błony komórkowej, w tym momencie ważną rolę odgrywają dwa typy enzymów: glikozylotransferazy – odpowiedzialne za tworzenie się łańcuchowych form glikanów oraz transpeptydazy – prowadzące do powstania usieciowanej, sztywnej struktury mureiny (Rys. 6) [26, 27].
526 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
Rysunek 6. Etap działania transpeptydaz i glikozylotransferaz [25] Figure 6. Place of action of transpeptidase and glycosyltransferase [25]
Biosynteza mureiny jest procesem bardzo złożonym, każdy jej etap pełni ściśle określone funkcje i jest konieczny do prawidłowego rozrostu ściany komórkowej bakterii. Za najważniejszy prekursor w tworzeniu peptydoglikanu uważana jest UDP-N-acetylo-d-glukozamina (UDP-GlcNAc). Formowana jest z 6-fosforanu-d- -fruktozy (Schemat 2). Bierze również udział w powstawaniu innych makromole- kuł opartych na strukturze N-acetylo- d-glukozaminy, takich jak kwasy tejchojowe (w przypadku bakterii Gram-dodatnich) oraz lipopolisacharydy i antygeny entero- bakteryjne (bakterie Gram-ujemne) [22, 27–30].
528 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
Przekształcenie 6-fosforanu- d-fruktozy w 6-fosforan- d -glukozaminy (Sche- mat 2) w pierwszym etapie katalizowane jest przez bienzymowy kompleks l-glutaminazę i aminotransferazę 6-fosforanu-d -fruktozy, która kodowana jest przez gen glmS [31]. N-Terminalny koniec domeny glutaminazy odpowiedzialny jest za hydrolizę l-glutaminy, w wyniku której uwalniana jest cząsteczka amoniaku, podczas gdy C-terminalny koniec domeny izomerazy przekształca amoniak i fos- foran-6-d-fruktozy w fosforan-6-d-glukozaminy. Następnie ma miejsce przeniesie- nie grupy fosforanowej z atomu węgla 6 na grupę anomeryczną, w wyniku czego powstaje fosforan-1-d-glukozaminy. Reakcja ta katalizowana jest przez gen glmM w przypadku E.coli, natomiast w S. aureus rolę tą przypisuje się femD lub femR [32, 33]. Ważnym etapem biosyntezy jest reakcja acetylowania grupy aminowej fragmentu cukrowego. Istotną rolę w tym procesie odgrywa pochodna koenzymu A. W wyniku przeniesienia grupy acetylowej z acetylo-CoA na 1-fosforan- d -gluko- zaminy, przy udziale transacetylazy, powstaje N-acetylo-d-glukozamino-1-fosforan. Związek ten w reakcji z UTP ulega dalszym przekształceniom do UDP-N-acetylo-
- d-glukozaminy (UDP-GlcNAc). Etap ten katalizowany jest przez pirofosfatazę [22]. UDP-GlcNAc stanowi istotny, jeśli nie najważniejszy produkt całej biosyntezy. Ponieważ stanowi nie tylko podstawę do syntezy usieciowanej formy peptydogli- kanu, poprzez przekształcenie go w pochodną kwasu UDP-N-acetylo-d -muramino- wego (UDP-MurNAc), lecz również innych elementów ściany komórkowej bakterii (lipopolisacharydów, kwasów tejchojowych itp.). Ważnym elementem mureiny oprócz pochodnej d-glukozaminy jest pochodna kwasu N-acetylo-d-muraminowego (UDP-MurNAc). Synteza tego fragmentu prze- biega w dwóch etapach, z których pierwszy katalizowany jest przez transferazę MurA, a kolejny przez reduktazę MurB. Transferaza enoilopirogroniowa (MurA) tworzy wiązanie eterowe pomiędzy α-fosfoenolopirogronianem, pochodzącego z PEP, a trzecim atomem węgla (C-3) pochodnej UDP-GlcNAc (Schemat 3).
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 529
O- P O
O
O O-
PEP UDP-GlcNAc
P (^) i
NADPH, H+
NADP +
Fosfolaktoilo-UDP-GlcNAc
EP-UDP-GlcNAc
UDP-MurNAc
HN
O N
O
O
OH OH
O
OH
HO
HO NH O P O
O P O
O
Ac OH OH
HN
O N
O
O
OH OH
O
OH
O
HO NH O P O
O P O
O
OH OH
O
P
CH (^3) O-
O
O
HN
O N
O
O
OH OH
O
OH
O
HO NH O P O
O P O
O
OH OH
Ac
HN
O N
O
O
OH OH
O
OH
O
HO NH O P O
O P O
O
OH OH
Ac
Schemat 3. Otrzymywanie kwasu N-acetylo- d-muraminowego (UDP-MurNAc) [22] Scheme 3. Preparation of N-acetyl- d-muramic acid (UDP-MurNAc) [22]
PEPTYDOGLIKAN – BUDOWA, ROLA BIOLOGICZNA ORAZ SYNTEZA 531
Istotnym momentem formowania peptydoglikanu jest przyłączenie poszcze- gólnych reszt aminokwasowych. Proces ten zachodzi przy udziale specyficznych enzymów oraz ATP. Przebiega on w kilku etapach. Wolna grupa karboksylowa pochodząca z cząsteczki UDP-MurNAc pełni rolę akceptora wiązania peptydowego. Do niej przyłączana jest pierwsza reszta aminokwasowa, którą dla większości bak- terii jest l-alanina. Odbywa się to przy udziale ligazy MurC. W kolejnym etapie dołączany jest kwas d-glutaminowy (Schemat 5a), będący produktem genu murI, odpowiedzialnego za syntezę d-glutaminianu z α-ketoglutaranu (Schemat 5b). a)
b)
D-alanina + α-ketoglutaran D-glutamian + pirogronian
Schemat 5. Mechanizm przyłączenia kolejnych reszt aminokwasowych do kwasu N-acetylo- d-murami no- wego [22] Scheme 5. The substitution of amino acid residues to N-acetyl-d-muramic acid [22]
W pozycji trzeciej najczęściej przyłączaną resztą jest l-lizyna. U części bakte- rii w jej miejsce podstawiana jest reszta kwasu mezo-diaminopimelinowego (A 2 pm lub Dap), a w sporadycznych przypadkach miejsce to zastąpione jest przez resztę l-homoseryny, resztę 3-hydroksy-A 2 pm, kwasu diaminobutylowy (ang. diamino- butyric acid) czy l-ornitynę.[22] Warto zwrócić uwagę, że pierwsze reszty amino- kwasów przyłączane są oddzielnie, jako samodzielne jednostki, natomiast ostatnie dwie reszty w postaci fragmentu dipeptydowego ( d-Ala-d -Ala) (Schemat 5a i 6). Fragment ten powstaje w wyniku działania dwóch enzymów racemazy (DdlB), która przekształca resztę l-alaniny w jej d-pochodną oraz ligazy d-alanina:d -alanina (DdlB) syntezującej fragment dipeptydowy. Podczas biosyntezy tego fragmentu ma miejsce zastąpienie C-terminalnej reszty d-alaniny inną resztą aminokwasową, np. d-waliną, glicyną, d-hydroksymaślanem, a w przypadku S. aureus najczęściej jest to reszta d-mleczanu. Stanowi to swoisty system odporności bakterii przeciwko sto- sowanym terapiom antybiotykowym. Istnieją również bakterie, w których N-ter- minalna reszta d-alaniny została zastąpiona przez resztę d -waliny, d-seryny lub d-aminomaślan lub glicynę.
532 J. SAMASZKO-FIERTEK, B. DMOCHOWSKA, J. MADAJ
a)
b)
Schemat 6. Mechanizm powstawania fragmentu dipeptydowego (d-alanylo-d-alaniny) [22] Scheme 6. Formation dipeptide fragment (d-Ala-d-Ala) [22]
Bardzo ważny jest fakt, że wcześniej opisane etapy biosyntezy zachodzą w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Mają one na celu namnażanie tak ważnych dla prawidłowego rozrostu mureiny prekursorów, które to następnie przetranspor- towane zostają z wewnętrznej części komórki bakteryjnej na zewnętrzną warstwę ściany komórkowej. Na ten proces składa się kilka etapów. W pierwszym momencie do powstałego MurNAc-pentapeptydu przyłączony zostaje fosforan undekaprenylu (zwany również baktroprenolem). Występuje on w błonie cytoplazmatycznej i pełni rolę przenośnika lipidowego jednostek budulcowych (peptydoglikanu, lipopoli- sacharudów czy kwasów tejchojowych Rys. 7). W wyniku działania specyficznej translokazy (MraY) powstaje kompleks, noszący nazwę lipidu I (C55-PP-MurNAc- -pentapeptyd). Związek ten reaguje z UDP-GlcNAc. Reakcja ta katalizowana jest przez glikozylotransferazy (MurG), w wyniku czego tworzy się wiązanie β(1→4) O-glikozydowe. Reakcja zachodzi pomiędzy grupą hydroksylową przy 4 atomie węgla pochodnej MurNAc a 1 atomem węgla z pochodnej GlcNAc, co prowadzi do powstania lipidu II (pochodnej disacharydowopentapeptydowej). Na tym etapie ma miejsce tworzenie się krótkiej liniowej formy peptydoglikanu. Do łańcucha bocz- nego reszty l -lizyny przyłączane są kolejne reszty aminokwasowe. W przypadku S. aureus są to reszty glicyny w wyniku czego powstaje mostek pentapeptydowy.
