Pobierz Perspektywy zastosowania terapeutycznego komórek macierzystych w chorobach centralnego układu nerwowego i więcej Publikacje w PDF z Neurobiologia tylko na Docsity!
Prof. dr hab. Krystyna Domańska-Janik, Zespół Neurobiologii Naprawczej Instytut Medycyny Doświadczalnej PAN w Warszawie
NAUKA 2/2004 • 17-
KRYSTYNA DOMAŃSKA-JANIK
Perspektywy zastosowania terapeutycznego
komórek macierzystych w chorobach
centralnego układu nerwowego
Nadzieje terapeutyczne związane z możliwościami otrzymywania in vitro prak-
tycznie nielimitowanych ilości ludzkich zarodkowych komórek macierzystych (eKM)
(Thomson 1998), które mogą różnicować się do wszystkich rodzajów komórek i tkanek
organizmu, w praktyce napotykają wciąż na poważne trudności. Wynikają one zarówno
z niepełnej wiedzy podstawowej na temat biologii samych KM, jak i braku wypraco-
wanych standardów transplantacji (tx) zwiększających szansę przeżycia i podjęcia
funkcji przeszczepianych komórek w organizmie biorcy. Spośród wielu patologii, w któ-
rych podjęto już próby terapii komórkowej (głównie eksperymentalnej) na czoło wysu-
wają się schorzenia neurologiczne. Spowodowane jest to z jednej strony brakiem innych
metod leczenia wielu z tych chorób, jak i stosunkowo większym zaawansowaniem badań
podstawowych dotyczących różnicowania się komórek progenitorowych w podstawowe
linie neuralne: neurony, astrocyty i oligodendrocyty.
W przedstawionej zbiorczej tabeli podano zestaw neurologicznych jednostek cho-
robowych, w których podjęto takie próby terapeutyczne (tabela 1).
Tabela 1. Zaawansowanie badań nad terapią regeneracyjną mózgu eKM Neutralne sKM Przeprowadzane badania Udary i urazy przedkliniczne przed- i kliniczne Choroby degeneracyjne: PD przedkliniczne przed- i kliniczne HD brak przed- i kliniczne AD brak przedkliniczne ALS brak przed- i kliniczne MS brak przed- i kliniczne Choroby metaboliczne przedkliniczne przed- i kliniczne
18 Krystyna Domańska-Janik
Uderzające jest to, że w większości przypadków wykorzystano w nich nie szeroko
rozpropagowane eKM, ale pochodzące z tkanek tzw. somatyczne komórki macierzyste
(sKM). Wynika to głównie z ich większego bezpieczeństwa biologicznego, które zostało
sprawdzone w czasie co najmniej 30-letniego okresu ich stosowania w hematologii, jak
i innych zespołach chorobowych. Paradoksalnie te same cechy eKM, które stanowią
o ich atrakcyjności jako źródła komórek terapeutycznych tzn. nielimitowana proliferacja
i różnokierunkowość różnicowania, niosą ze sobą również duże zagrożenie nowotwo-
rowe. Standardem identyfikacji pluripotencjalności eKM jest ich zdolność do wytwa-
rzania guzów nowotworowych (teratoma) po przeszczepie do immunosupresjonowa-
nych zwierząt. Ta podstawowa cecha jest wzmacniana szczególną podatnością tych
komórek na spontaniczne i sumujące się mutacje w czasie hodowli in vitro. Pierwsze
linie eKM, wyprowadzone przez autora (Thomson 1998) i do dziś używane w wielu
ośrodkach badawczych, okazały się ostatnio w wysokim procencie zmienione karioty-
powo i genetycznie (Andrews 2004), wskazując, że od lat obserwowane spontaniczne
transformacje spowodowane niestabilnością genetyczną eKM (Humphrys 2001) zacho-
dzą również w sposób niekontrolowany in vitro. Nie są przed nimi chronione także
nowo otrzymywane przez różne grupy badawcze, jak i w coraz szerszej ofercie komer-
cyjnej, nowe linie ludzkich eKM (zbiorczo w Orive i wsp. 2003).
Tabela 2. Zestawienie cech krytycznych zarodkowych (eKM) i somatycznych (sKM) neuralnych KM w odniesieniu do możliwości ich użycia w przeszczepach tkankowych
Problem eKM
Ukierunkowane neuralnie sKM Pochodzenia mózgowego
Pochodzenia szpikowego
Z krwi pępowinowej Inne
- Łatwość pozyski- wania materiału
teoretycznie nieograniczona ograniczona^ duża^ duża^ różna
- Namnażanie in vitro nielimitowane^
dobre, lecz nietypowe
bardzo wysokie
bardzo wysokie różne
- Tx autologiczne możliwe ograniczone możliwe możliwe różne
- Tumorogenność wysoka niska lub brak
- Niestabilność genetyczna wysoka niska do umiarkowanej (w trakcie długiej ekspansji in vivo)
- Ukierunkowanie neutralne i stabil- ność różnicowania
niestabilne (możliwa korekcja genetyczna)
stabilne
- Migracja in situ kontrowersyjne dane doświadczalne
- Proliferacja in situ kontrowersyjne dane doświadczalne
W tabeli 2 podano zestawienie cech, które, w prowadzonych obecnie badaniach klinicz-
nych, zadecydowały o przewadze sKM jako materiałe transplantacyjnym.
20 Krystyna Domańska-Janik
tyce. I tak do opisu tego fenomenu używa się tak nierównoważnych terminów, jak
wspomniana już transdiferencjacja, transpotencja, plastyczność, konwersja bądź meta-
morfoza. Natomiast niewątpliwym faktem jest, że kierunek różnicowania neuro-
ektodermalnego przy wyborze nowej linii rozwojowej jest tu w jakimś sensie prefero-
wany. Warto wspomnieć, że zmienność tak charakteru, jak i potencjału regeneracyjnego
dojrzałych tkanek była od lat obserwowana u różnych gatunków zwierząt. U ssaków
znane są przypadki ewolucyjnej zmiany wyboru podstawowej linii różnicowania koń-
cowego. Na przykład u niektórych gatunków z neuroektodermalnej struny nerwowej
(neural crest) wykształcane są tkanki głowy (chrząstki, mięśnie), nieodróżnialne od tych
powstających z klasycznej linii, wywodzącej się z mezodermalnego listka zarodkowego.
Inny przykład transdiferencjacji na poziomie sKM można znaleźć w okresie organoge-
nezy np. oka. Jest możliwe, że ścieżka prowadząca do transdiferencjacji przebiega przez
etap pośredni cofnięcia programu różnicowania komórkowego, czyli tzw. dediferencjac-
ję. W mózgu zaobserwowano to w doświadczeniu przeróżnicowania ukierunkowanych
prekursorów oligodendrocytów-O2A do multipotencjalnych neuralnych progenitorów
typu NKM (Kondo i Raff 2000).
Pytania o mechanizmy molekularne leżące u podstaw obserwowanej plastyczności
sKM nie mają wyłącznie charakteru akademickiego. Mechanistyczne wyjaśnienie tego
zjawiska mogłoby w przyszłości zaowocować optymalizacją sposobów pozyskiwania
potrzebnych terapeutycznie fenotypów komórkowych nawet (teoretycznie) z każdej
komórki organizmu.
Sugerowane strategie wykorzystania KM w terapii można rozpatrywać co naj-
mniej na 4 poziomach:
- Bezpośrednia repopulacja uszkodzonych tkanek przez hodowane in vitro ukierun- kowane komórki progenitorowe. Aby takie terapie stały się możliwe, konieczne jest określenie warunków specyficznego i stabilnego uzyskiwania pożądanych cech in vitro i in vivo. Należy również określić optymalne warunki środowiskowe do przeszczepu, prawdopodobnie różne w zależności od tkanek i jednostek choro- bowych, które zapewniłyby utrzymanie i integracje przeszczepionych komórek z tkankami biorcy.
- W terapii genowej – wszczepianie zmodyfikowanych genetycznie KM, które mogły- by się stać dobrze penetrującymi, tolerowanymi i stabilnymi nośnikami brakujących czynników sekrecyjnych (np. dopaminy, insuliny itp.) oraz troficznych, przydatnych w terapii określonych schorzeń.
- W miarę poznawania biologii endogennie występujących KM, uzyskanie możliwości sterowania ich rozwojem i ekspansja in situ, w celu zapewnienia naturalnej repopu- lacji uszkodzonych przez czynniki chorobowe komórek i tkanek.
- Istnieją też początki tzw. inżynierii tkankowej, testującej możliwości produkcji
Perspektywy zastosowania terapeutycznego komórek macierzystych 21
zróżnicowanych tkanek oraz całych organów lub ich funkcjonalnych części (organo- idów) in vitro do wykorzystania w tx. Odnotowano pierwsze spektakularne sukcesy, np. w hodowli skóry czy tkanki chrzęstnej np. nosa lub ucha.
Przykłady możliwości użycia KM w terapii chorób neurologicznych
- Choroba Parkinsona (PD) Istnieją zaawansowane badania na modelach zwierzęcych wykazujące funkcjonalną
skuteczność transplantacji prekursorów dopaminergicznych bezpośrednio do prążkowia
lub istoty czarnej. Jednakże podjęcie przez nie funkcji zależy od ciągle mało poznanego
zjawiska właściwego patterningu tych komórek, który występuje jedynie w rozwija-
jącym się śródmózgowiu. Tylko NKM izolowane z tych okolic i to w określonym czasie
rozwoju płodowego były zdolne do integracji z tkanką gospodarza i regulowanego
bodźcem wyrzutu dopaminy (Armstrong 2003).
Wyniki badań nad zastosowaniem eKM w modelach zwierzęcych PD są kontrower-
syjne. Mimo że w niektórych z nich odnotowano dużą poprawę funkcjonalną (Bjorklund
i wsp. 2002), to w innych pracach nie udało się powtórzyć tego wyniku. Wszyscy
autorzy podkreślają natomiast dużą niestabilność różnicowania się tych komórek,
również do fenotypów nie występujących w mózgu oraz wysokie prawdopodobieństwo
powstawania guzów nowotworowych (w zależności od gęstości komórek nawet do 100%
(Harkany i wsp. 2004 ).
Podejmowane są różne próby wyeliminowania tumurogenności eKM, np. przez
indukcję różnicowania końcowego in vitro lub pozbycie się komórek mitotycznych
przed tx (Kawasaki i wsp. 2002). W takim przypadku jednak dochodzi do zmiany
charakteru terapii, która zamiast wykorzystywać pozytywne cechy komórek macie-
rzystych (proliferację, migrację i „wrastanie” komórek w cytoarchitekturę tkanki) staje
się metodą suplementacji już „gotowymi”, wyhodowanymi w laboratorium zróż-
nicowanymi komórkami mającymi swoje własne ograniczenia. Do najbardziej udanych
podejść doświadczalnych uzyskiwania takich komórek należy zaliczyć kombinację
wstępnych manipulacji genetycznych (transdukcję czynnika transkrypcyjnego Nurr1)
i epigenetycznych (dodatek białek sygnalnych Shh i FGF8 do medium różnicującego).
W tych warunkach otrzymano prawie 80-procentowe różnicowanie neuronów do
fenotypu dopaminergicznego. W okresie 2-miesięcznej obserwacji po tx komórek do
prążkowia szczura nie odnotowano powstawania guzów z jednoczesnym dobrym
wynikiem powrotu funkcji przeszczepionych neuronów (Kim i wsp. 2002). Barberi
i wsp. (2003) przedstawił ostatnio bardzo efektywną metodę otrzymywania dopa-
minergicznie zróżnicowanych neuronów z eKM wyprowadzonych z zarodków mysich
powstałych w wyniku transferu jąder (model tzw. klonowania terapeutycznego). Po
przeszczepieniu do parkinsonoidalnych zwierząt odnotowano 70-procentową poprawę
w testach funkcjonalnych oraz dobre przeżycie neuronów dopaminergicznych in vivo.
Perspektywy zastosowania terapeutycznego komórek macierzystych 23
W badaniach Chena i wsp. (2001) wykazano, że w tkance ischemicznej mózgu po
przeszczepie wykrywa się zwiększone ilości BDNF i NGF w porównaniu z grupą
zwierząt nie poddanych transplantacji. Wykazano również dużą zdolność KM do pro-
dukcji takich czynników in vitro. Czynniki troficzne i wzrostowe mogłyby stymulować
rezerwy regeneracyjne uszkodzonego mózgu, włącznie z pobudzeniem endogennych
KM znajdujących się w tkance gospodarza.
W czasie badań nad wpływem transplantacji KM na przebieg regeneracji mózgu
i rdzenia u gryzoni, zaobserwowano jeszcze jedno bardzo interesujące zjawisko. Wydaje
się mianowicie, że komórki pochodzenia szpikowego lub z krwi pępowinowej po poda-
niu do krwioobiegu migrują selektywnie do miejsca uszkodzenia różnych narządów,
w tym również do mózgu, przechodząc nawet przez nieuszkodzoną barierę krew/mózg.
Prowadzone są dalsze badania nad zidentyfikowaniem chemokin czynnych w tym pro-
cesie (Wang i wsp. 2002).
- Urazy rdzenia kręgowego. Przedkliniczne badania doświadczalne wykazały, że podane miejscowo komórki
NKM mogą wytwarzać pożądane środowisko do odrostu aksonów po poprzecznym
przecięciu rdzenia, jak również zapobiegać formowaniu się blizny.
- Choroby metaboliczne W klinice pierwsze próby leczenia lizosomalnych chorób spichrzeniowych przesz-
czepami allogenicznymi komórek szpikowych podejmowano już przed 20 laty. Przepro-
wadzono zabiegi na setkach pacjentów z zespołami Huntera, Maroteaux-Lamy, adreno-
leukodystrofii, metachromatycznej leukodystrofii, fukozydozy, choroby Gauchera. Jako,
że choroby te są nieuleczalne i w krótszym lub dłuższym czasie prowadzą do śmierci,
ocena działania terapii jest trudna, a często kontrowersyjna. Jednak w kilku przypad-
kach potwierdzono częściową rekonstrukcję enzymatyczną i średnie przedłużenie czasu
przeżycia chorych. W każdym razie przeszczepy szpikowe nie zmieniały ostatecznie
niepomyślnego rokowania (Kaufman i wsp. 1999). W celu wyjaśnienia miejscowego me-
chanizmu działania zmodyfikowanych genetycznie KM w modelu choroby Niemann-
Picka przeprowadzono eksperymenty na myszach transgenicznych pozbawionych
aktywności kwaśnej sfingomielinazy, której brak jest odpowiedzialny za wystąpienie tej
choroby u ludzi. Po domóżdżkowym podaniu mezenchymalnych sKM z nadprodukcją
brakującego enzymu wykazano lepszą przeżywalność komórek Purkinjego i zmniej-
szenie mózgowych złogów sfingomieliny (Jin i wsp. 2002). Badania te można uznać za
pierwszą pomyślną próbę rzeczywistej suplementacji komórkowej w spichrzeniowych
chorobach neurodegeneracyjnych.
Środowisko naukowe z zasady źle przyjmuje wszelkie ograniczenia nakładane swo-
bodom badawczym i możliwościom eksperymentalnym. Jednakże na podstawie obecnej
24 Krystyna Domańska-Janik
wiedzy należy przyjąć, że kliniczne zastosowanie ludzkich zarodkowych KM będzie
odłożone co najmniej do czasu zniknięcia bezpośrednich zagrożeń związanych z tą te-
rapią. Nawet najbardziej udane eksperymenty nad przeszczepianiem eKM nie trwały
dłużej niż 2-3 miesiące i nie obejmowały ludzkich eKM. Poza tym obniżenie ryzyka wys-
tąpienia nowotworu w prowadzonych badaniach sprowadzało się głównie do postępo-
wania prewencyjnego (stosowania środków antymitotycznych lub przeszczepiania nie-
proliferujących, końcowo zróżnicowanych komórek), ale nie do poznania i opanowania
istoty tego zjawiska, będącego, jak się wydaje, immanentną cechą komórek zarod-
kowych. Biorąc pod uwagę, że ich podłożem są ciągle nieznane mechanizmy leżące
u podstaw procesu nowotworzenia, sądzę, że rozwiązanie obu tych problemów będzie
jednakowo trudne i wzajemnie powiązane. Jako że te najistotniejsze, nie rozwiązane do
tej pory zagadnienia dotyczą wiedzy podstawowej, a nie praktycznej strony klinicznego
przeszczepu ludzkich eKM, jako modele badawcze do ich rozwiązania mogą posłużyć
o wiele lepiej poznane komórki zarodkowe gryzoni lub naczelnych. Natomiast rozwój
metod przeszczepów terapeutycznych, tak jak do tej pory (tabela 1), powinien koncen-
trować się na badaniach somatycznych sKM i na dalszych udoskonaleniach tych, już
w tej chwili odnotowujących pierwsze sukcesy kliniczne, metod leczniczych.
Piśmiennictwo
[1] Andrews P.W. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 371-379. [2] Armstrong R.J., Tyers P., Jain M., Richards A., Dunnett S.B., Rosser A.E., Barker R.A., Transplantation of expanded neural precursor cells from the developing ventral mesen- cephalon in a rat model of Parkinson’s disease. Exp. Brain Res. 2003; 151: 204-17. [3] Baiocchi M., Di Rico C., Di Pietro R., Baldassarre A., Migliaccio A.R. 5-Azacytidine reacti- vates the erythroid differentiation potential of the myeloid-restricted murine cell line 32D RO. Exp. Cell Res., 2003; 258: 258-67. [4] Barberi T., Klivenyi P., Calingasan N.Y. i wsp. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cellsand application into parkinsonian mice. Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1200-1207. [5] Bjorklund L.M. i wsp.: (2002), Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat model. PNAS USA, 99(4), 2344. [6] Bużańska L., Machaj E.K., Zabłocka B., Pojda Z., Domańska-Janik K. Human cord blood- derived cells attain neuronal and glial features in vitro. J. Cell Sci. 2002; 115 (10): 2131-
[7] Bużańska L., Domańska-Janik K., Establishment and general properties of the unique Human Umbilical Cord Blood-derived Neural Stem Cell (HUCB-NSC) line. Annual Report, PAN, 2004 – w druku. [8] Chen J., Li Y., Wang L., Lu M., Zhang X., Chopp M. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. J. Neurol. Sci. 2001;189: 49-57.
26 Krystyna Domańska-Janik
[26] Terada N., Hamazaki T., Oka M., Hoki M., Mastalerz D.M., Nakano Y., Meter E.M., Morel L., Petersen B.S., Scott E.W. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion. Nature 2002; 416: 542-545. [27] Thomson J.A., Itskovitz-Eldor, Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshal V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-1147. [28] Wagers A.J., Sherwood R.I., Christensen J.L., Weissman I.L. Little evidence for develop- mental of adult hematopoietic stem cells. Science 2002; 107: 4807. [29] Wang L, Li Y., Chen X.J. Gautam S.C., Zhang Z. Lu M., Chopp M. MCP-1, MIP-1, IL-8 and ischemic cerebral tissue enhance human bone marrow stromal cell migration in interface culture. Hemathology 2002; 7: 113-117. [30] Willing A.E., Lixian J., Milliken M., Poulos S, Zigova T., Song S., Hart C., Sanchez-Ramos J, Sanberg Pr. Intravenous versus Intrastriatal Cord Blood Administration in a Rodent Model of Stroke. J. Neurosci. Res. 2003; 73: 296-307. [31] Windrem M.S., Nunes M.C., Rashbaum W.K., Schwartz T.H., Goodman R.A., Mckhann G. 2nd, Roy N.S., Goldman S.A. Fetal and adult human oligodendrocyte progenitor cell iso- lates myelinate the congenitally dysmyelinated brain. Nat. Med. 2004; 10: 93-97. [32] Woodbury D., Reynolds K., Black L.B. Adult bone marrow stromal cells express germline, ectodermal, endodermal and mesodermal genes prior to neurogenesis. J. Neurosci. Res. 2002; 69: 908-917.
