






Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Typologia: Publikacje
1 / 11
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt
Najmniejszym elementem Ŝywego organizmu, którego organizacja umoŜliwia dokonywanie się pełnej przemiany materii, jest komórka. Wprawdzie między komórkami róŜnych organizmów, a nawet róŜnych tkanek jednego organizmu, występują znaczne róŜnice, jednak wszystkie komórki wykazują podstawowe wspólne cechy budowy i zawierają typowe twory podkomórkowe, pełniące określone funkcje biochemiczne. Jak wynika z obrazu widzianego w mikroskopie optycznym, komórka, bez względu na pochodzenie, stanowi otoczony błoną twór wypełniony cytoplazmą, w której zawieszone są organelle. PoniŜej zamieszczono uproszczony! opis waŜniejszych struktur komórkowych charakterystycznych dla komórek roślinnych i zwierzęcych. Opis ten ma jedynie pomóc Studentom w usystematyzowaniu wiedzy zdobytej na wykładach z biologii komórki, biochemii oraz kultur tkankowych i komórkowych roślin i zwierząt.
1. Budowa komórki roślinnej i zwierzęcej.
a. Jądro komórkowe – jest organellą zawierającą informację genetyczną odpowiedzialną za regulację metabolizmu, wzrostu i róŜnicowania się komórki. Materiał genetyczny zawarty w podstawowym, haploidalnym zespole chromosomów określa się jako genom jądrowy. Jądro komórkowe połoŜone jest zwykle w centralnej części komórki i w zaleŜności od jej typu posiada kształt kulisty, owalny lub soczewkowaty. Jądro występuje w zasadzie jako pojedyncza organella, choć istnieją komórki, które w pewnym okresie swego Ŝycia są pozbawione jądra (np.: dojrzałe erytrocyty) lub takie które zawierają więcej niŜ jedno np.: dwujądrowe komórki wątroby czy wielojądrzaste włókna mięśni szkieletowych. Jądro komórkowe składa się z macierzy jądrowej zwanej nukleoplazmą, chromatyny jądrowej oraz jąderka. W interfazie jądro komórkowe osłonięte jest dwiema błonami tworzącymi specyficzną otoczkę. Zewnętrzna błona otoczki jądrowej połączona jest z błoną retikulum endoplazmatycznego (ER), a na jej powierzchni od strony cytoplazmy mogą znajdować się rybosomy. Błony – zewnętrzna i wewnętrzna – łączą się ze sobą w miejscu oktagonalnych kompleksów porowych, złoŜonych z ponad stu róŜnych białek. Pory jądrowe umoŜliwiają szybką wymianę mRNA, podjednostek rybosomów, czynników transkrypcyjnych czy jonów pomiędzy przedziałem jądrowym a światłem siateczki śródplazmatycznej lub cytozolem. Macierz jądrowa jest roztworem białek, cukrów, jonów i nukleotydów, w którym zawieszona jest chromatyna, jąderko oraz białkowy szkielet utrzymujący kształt jądra i usztywniający osłonkę jądrową. Chromatyna jądrowa zbudowana jest z helikalnie splecionej nici DNA związanej z białkami histonowymi i niehistonowymi. Podstawową jednostką strukturalną chromatyny jest nukleosom, złoŜony z ośmiu białek histonowych, wokół których owinięta jest cząsteczka DNA o
długości 166-200 par zasad. Pomiędzy nukleosomami znajdują się łącznikowe odcinki DNA o długości od 10 do 95 par zasad. Nić nukleosomowa splata się wokół siebie formując solenoid, czyli tzw. właściwe włókno chromatynowe, które następnie wytwarza pętle wyŜszego rzędu, tzw. domeny mogące ulegać dalszej kondensacji. Z uwagi na organizację strukturalną i funkcje wyróŜnia się dwa rodzaje chromatyny: luźną euchromatynę, złoŜoną z całkowicie rozwiniętych odcinków chromosomów i czynną transkrypcyjnie, oraz skondensowaną heterochromatynę, nie posiadającą odcinków kodujących. W cyklu komórkowym jądro podlega złoŜonym przemianom, które odbywają się w dwóch okresach: okresie podziału, kiedy chromatyna ulega kondensacji w chromosomy podziałowe, i w okresie interfazy, kiedy jądro się nie dzieli. Podział chromatyny i jej rozdzielenie do jąder potomnych następuje na drodze mitozy lub mejozy. Wewnątrz jądra komórkowego znajduje się jąderko będące nieobłonionym, gęstym, kulistym ciałem zawierającym RNA oraz białka. W jąderku zachodzi synteza prekursorowego rybosomowego RNA, a następnie formowanie podjednostek tworzących rybosomy. Wielkość jąderek zaleŜy od stopnia zaangaŜowania komórek w syntezę białek – stąd teŜ jądra komórek intensywnie syntetyzujących białka cechują się obecnością duŜych jąderek, których objętość moŜe dochodzić do 25% objętości jądra.
b. Plastydy – typowe organelle komórek roślinnych, częściowo niezaleŜne od informacji genetycznej jądra komórkowego. Organelle te pojawiły się w komórce w wyniku endosymbiozy sinic, przy czym w toku ewolucji oprócz cech typowych dla endosymbionta, uzyskały równieŜ cechy swoiste dla plastydów. W dojrzałej roślinie wyróŜnia się plastydy fotosyntetyzujące - chloroplasty oraz plastydy niefotosyntetyzujące m.in. chromoplasty, leukoplasty i amyloplasty. Wszystkie typy plastydów zawierają dwie błony tworzące otoczkę, która ogranicza wnętrze plastydu, zwane stromą. W stromie kaŜdego plastydu zwykle znajdują się m.in. tylakoidy (spłaszczone cysterny zawierające np. u chloroplastów barwniki fotosyntetyczne), rybosomy, obszary nukleoidopodobne z plastydowym DNA oraz ziarna skrobii. Chloroplasty to dyskowate twory, w których wyróŜnia się dwa rodzaje tylakoidów – tylakoidy gran z chlorofilem oraz tylakoidy stromy. Oprócz fotosyntezy, chloroplasty odpowiadają za metabolizm skrobi, syntezę kwasów tłuszczowych, lipidów, asymilację amoniaku czy pewne etapy szlaku syntezy glicerololipidów. Chromoplasty zawierają znaczne ilości barwników karotenoidowych takich jak Ŝółty ksantofil czy pomarańczowy karoten. Plastydy te występują w komórkach roślin w postaci okrągłych ciałek lub nieregularnych płytek i kryształów. Są one aktywne metabolicznie, zdolne do podziału, biosyntezy kwasów tłuszczowych i karotenoidów, zwłaszcza β-karotenu. Chromoplasty nadają barwę kwiatom, owocom oraz korzeniom roślin. Leukoplasty, to niewielkie, bezbarwne plastydy, występujące w pobliŜu jądra wyspecjalizowanych funkcjonalnie komórek, np. włosków epidermy. Ich podstawową funkcją jest synteza monoterpenów czy teŜ kwasów tłuszczowych, niezbędnych do tworzenia wspomnianych włosków. Amyloplasty to sferyczne plastydy, zawierające w stromie jedno, bądź kilka duŜych ziaren skrobi. Główną funkcją amyloplastów jest synteza i akumulacja skrobi zapasowej.
c. Mitochondria – organelle zbudowane z dwóch systemów błon ograniczających jego wnętrze, określane jako macierz mitochondrialna ( matrix mitochondrialis ). Błona zewnętrzna mitochondrium nie leŜy bezpośrednio na błonie wewnętrznej, ale jest od niej oddzielona wąską przestrzenią międzybłonową. Błona wewnętrzna wytwarza róŜnej długości fałdy, grzebienie mitochondrialne, które wystając do macierzy mitochondrialnej mogą się układać podłuŜnie,
retikulum endoplazmatycznym. Aparat Golgiego, ponadto, bierze udział w syntezie składników ścian komórek roślinnych, w sortowaniu i pakowaniu produktów eksportowych, formowaniu błony komórkowej oraz procesie jej odzysku. Nowo syntetyzowana błona i białka wydzielnicze, podobnie jak lipidy błonowe, które są glikolozowane, opuszczając retikulum endoplazmatyczne wchodzą do aparatu Golgiego przez powierzchnię cis , przesuwają się przez stos Golgiego i opuszczają aparat przez kanaliki i pęcherzyki tworzące sieć trans. W tym czasie przechodzą szereg modyfikacji, których przerwanie lub zmiana moŜe mieć swoje implikacje kliniczne.
f. lizosomy – to główne organelle trawienne komórki, otoczone pojedynczą błoną komórkową, które zawierają specyficzne hydrolazy degradujące białka, lipidy, węglowodany i kwasy nukleinowe. Jedną z charakterystycznych cech lizosomów jest niski odczyn ich wnętrza
(pH ∼ 5,0), utrzymywany przez zaleŜną od ATP pompę protonową, generującą duŜe stęŜenie protonów we wnętrzu lizosomu. StęŜenie protonów we wnętrzu lizosomów jest ok. 100 razy większe niŜ w otaczającej je cytoplazmie, co zapewnia niezbędne środowisko dla poprawnego funkcjonowania lizosomalnych hydrolaz. Co istotne, gdy dochodzi do mechanicznego uszkodzenia lizosomów, ich zawartość miesza się z cytozolem (pH 7,2 – 7,3), co powoduje iŜ aktywność lityczna hydrolaz natychmiast zanika, nie zagraŜając składnikom cytoplazmy. Wśród enzymów lizosomalnych znajdują się m.in.: rybonukleaza (trawi RNA), deoksyrybonukleaza (trawi DNA), glikozydaza (rozkłada węglowodany, glikozydy, polisacharydy), fosfataza kwaśna (estry fosforanowe), katepsyny (białka), lipazy (tłuszcze). Import materiałów do lizosomów, które tam ulegają trawieniu, odbywa się na drodze: endocytozy - formowaniu pęcherzyków endocytarnych wokół małych cząstek i płynów; autofagii – pochłonięciu i strawieniu całych dysfunkcjonalnych organelli; fagocytozy – pochłanianiu większych cząstek, jak bakterie.
g. wakuole – system wakuolarny, zróŜnicowany co do wielkości, występuje w komórkach roślinnych i zwierzęcych. W wyspecjalizowanej komórce roślinnej znajduje się najczęściej jedna duŜa wakuola; w komórce zwierzęcej - cały system drobnych wakuol o niewielkich rozmiarach. Wnętrze wakuoli, otoczone pojedynczą błoną, wypełnia woda wraz z substancjami nieorganicznymi, organicznymi (metabolity pośrednie i wtórne) oraz substancjami zapasowymi (białka, polisacharydy i tłuszcze). Skład soku komórkowego zaleŜy od pochodzenia komórek oraz stanu ich metabolizmu. WaŜną grupę związków soku wakuolarnego stanowią wspomniane metabolity wtórne, których praktyczne znaczenie wynika z ich właściwości leczniczych oraz z szerokiego wykorzystania przemysłowego. Do najwaŜniejszych grup związków naleŜą: glikozydy antocyjanowe, glikozydy flawonowe, alkaloidy (nikotyna, kokaina, strychnina) oraz garbniki (pochodne wielofenoli).
h. cytoplazma – uznawana jest za swego rodzaju dwuskładnikowy koloid białkowo- wodny, duŜych i małych cząsteczek, w którym zawieszone są organelle komórkowe i który zajmuje największą objętościowo część komórki. Cytoplazma podstawowa jest fazą wodną komórki z rozpuszczonymi w niej składnikami takimi jak: kwasy tłuszczowe, białka, aminokwasy, węglowodany, nukleotydy, związki mineralne. Cytoplazma w pobliŜu błony komórkowej jest bardziej sztywna, natomiast jej część wewnętrzna jest zwykle płynna. W macierzy cytoplazmatycznej wyróŜnia się 3 rodzaje białek włóknistych o zróŜnicowanej budowie, składzie chemicznym oraz funkcjach, które tworzą cytoszkielet komórki; są to: mikrotubule, filamenty i mikrofilamenty.
i. ściana komórkowa – oprócz plastydów, stanowi najbardziej charakterystyczny wyróŜnik komórek roślinnych. Jest to wysoce zorganizowany materiał kompozytowy, złoŜony z wielu typów makrocząsteczek. Ściana komórkowa jest syntetyzowana przez protoplast i odkładana w postaci zróŜnicowanych pod względem chemicznym warstw po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Ściana komórkowa wraz z błoną komórkową i cytoszkieletem, stanowi część strukturalnego i funkcjonalnego kontinuum przenikającego kaŜdą komórkę rośliny. Ściana komórkowa kontroluje kształt i powiększanie się komórek, wpływa na transport międzykomórkowy, jest szlakiem transportu i źródłem cząsteczek sygnałowych jak hormony peptydowe, tlenek azotu czy reaktywne formy tlenu, bierze udział w reakcjach roślin na warunki środowiska oraz pojawiające się inne organizmy. W skład ściany komórkowej wchodzą: matriks (substancje podłoŜa – pektyny, hemicelulozy, glikoproteiny), zrąb (substancje szkieletowe – celuloza, ksylany, chityna), substancje inkrustujące (ligniny, krzemionka, węglan wapnia), substancje adkrustujące (lipidy – kutyna, suberyna, woski; polisacharydy – śluzy, gumy). Wzajemne kontaktowanie się Ŝywych protoplastów sąsiadujących ze sobą komórek umoŜliwiają pory w ścianach komórkowych, przez które przenikają pasma cytoplazmy tzw. plazmodesmy.
2. Obserwacja komórek roślinnych i zwierzęcych przy uŜyciu mikroskopu świetlnego.
2.1. Budowa mikroskopu świetlnego – zasady mikroskopowania.
W kaŜdym mikroskopie świetlnym moŜna wyróŜnić układ mechaniczny oraz optyczny. Częściami mechanicznymi mikroskopu są: statyw, tubus z urządzeniem rewolwerowym do wkręcania obiektywów o róŜnym powiększeniu oraz stolik przedmiotowy. W statywie mikroskopu mieści się śruba makro- i mikrometryczna, które słuŜą do przesuwania tubusa bądź stolika przedmiotowego przy nastawianiu ostrości obrazu w mikroskopie. Układ optyczny mikroskopu składa się z układu powiększającego (obiektyw, okular) i układu oświetlającego (Ŝarówka bądź lusterko oraz kondensor). Obiektyw najistotniejsza część mikroskopu, jest zbiorem soczewek sklejonych ze sobą. Obiektyw tworzy obraz rzeczywisty, odwrócony i powiększony. Obiektywy o powiększeniu 100- krotnym i większym określane są jako obiektywy immersyjne. Oglądając preparaty z uŜyciem takich obiektywów przestrzeń między soczewką czołową obiektywu a szkiełkiem nakrywkowym naleŜy wypełnić cieczą immersyjną o duŜym współczynniku załamania światła (większym od 1). Zastosowanie immersji usuwa zjawisko załamywania się promieni świetlnych przy przechodzeniu ze środowiska optycznie gęstszego (szkło) do środowiska rzadszego (powietrze), co powoduje zaciemnienie pola widzenia. Okular mikroskopu, złoŜony jest z dwóch płasko-wypukłych soczewek, z których górna powiększa obraz utworzony przez obiektyw, dolna natomiast zwiększa pole widzenia. Okular tworzy obraz powiększony, urojony i prosty. Łącznie, układ okular – obiektyw daje obraz odwrócony, jaki powstał w wyniku działania obiektywu. W uproszczeniu, powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i obiektywu. O przydatności mikroskopu do badań w duŜej mierze decyduje jego rozdzielczość. Zdolność rozdzielcza mikroskopu to najmniejsza odległość między dwoma punktami preparatu, które dostrzegane są jeszcze oddzielnie. Odległość ta musi mieć wymiar równy co najmniej długości fali światła uŜytego do oświetlenia preparatu. W przypadku światła widzialnego granica ta wynosi 0,5 μm.
Ćwiczenie 2 Barwienie przyŜyciowe komórek nowotworowych
Celem takiego barwienia jest odróŜnienie komórek Ŝywych od martwych. Proces barwienia tkanek czy komórek ma charakter fizykochemiczny i polega na adsorpcji barwnika na ścianie komórkowej lub jego dyfuzji do wnętrza komórki. W barwieniu stosuje się najczęściej barwniki zasadowe (sole, w których jonem barwnym jest kation np.: błękit metylenowy, fiolet krystaliczny), wykorzystując ich powinowactwo do składników komórek (mających odczyn kwaśny). Cechą charakterystyczną barwników przyŜyciowych jest ich niska toksyczność w stosunku do barwionych komórek. Materiał Komórki ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60. Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, probówki Eppendorfa, pipety automatyczne, worteks. Odczynniki 0,04% wodny roztwór błękitu metylenowego. Wykonanie Pobrać do probówki Eppendorfa 0,5 ml zawiesiny komórek ludzkiej białaczki mieloblastycznej HL60. Dodać 20 μl roztworu błękitu metylenowego. Całość wymieszać na worteksie i po 10 minutach nanieść kroplę zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe. Przy powiększeniu 40x zaobserwować stosunek komórek Ŝywych do martwych. Wykonać rysunek. Wyjaśnić, dlaczego komórki martwe barwią się, natomiast komórki Ŝywe pozostają bezbarwne.
Ćwiczenie 3 Barwienie preparatów utrwalonych komórek nowotworowych
Konieczność stosowania materiału utrwalonego w cytologii jest podyktowana duŜą toksycznością specyficznych barwników i odczynników oraz niebezpieczeństwem zniekształceń, powstałych w trakcie niekontrolowanego zamierania komórek. Utrwalenie materiału ma na celu bardzo szybkie zabicie komórek z zachowaniem struktur komórkowych w stanie jak najmniej zmienionym w porównaniu z komórką Ŝywą. Dobry utrwalacz składa się ze środka utrwalającego i nośnika zapewniającego stałe pH w trakcie utrwalania oraz odpowiedni skład jonowy aby nie dopuścić do wytrącania i ekstrakcji materiału. Do prostych utrwalaczy zaliczane są: alkohol etylowy, aceton, kwas octowy czy aldehyd glutarowy. Utrwalacze złoŜone to np. płyn Carnoy’a cechujący się szybką penetracją komórki, korzystnym wpływem na ich morfologię oraz barwliwość chromosomów. Materiał Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełkach nakrywkowych. Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, komory do barwienia, szalki Petriego, pęseta, pipety automatyczne. Odczynniki Utrwalacz Carnoy’a: alkohol metylowy i lodowaty kwas octowy zmieszane w stosunku objętościowym 3: 1% kwas octowy
Woda destylowana Barwnik Giemsa (rozcieńczony wodą destylowaną 1:20) 50%, 70%, 80%, 90% alkohol etylowy Wykonanie Komórki ludzkiego raka jelita grubego HT29 rosnące na szkiełku nakrywkowym, utrwalić w płynie Carnoy’a – połoŜyć preparat na szalce Petriego, zalać utrwalaczem i pozostawić na 15 minut. Następnie, w celu uwodnienia, trzymając pęsetą szkiełko nakrywkowe, przeprowadzić preparat w ciągu 30 sekund przez szereg alkoholowy: 80%, 70%, 50% alkohol etylowy, wodę destylowaną do 1% kwasu octowego. Preparat barwić w wodnym roztworze barwnika Giemsa przez 5 minut, płukać wodą destylowaną przez 1-2 minuty, zanurzyć w 90% alkoholu etylowym. Po wysuszeniu, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować w mikroskopie świetlnym. Wykonać rysunek i opisać uzyskane wyniki, wskazując miejsce występowania w komórce DNA.
Ćwiczenie 4 Obserwacja kształtów komórek
Materiał Liść aloesu, owoc gruszki Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety automatyczne Wykonanie
Ćwiczenie 5 Obserwacje wybranych organelli komórkowych
Materiał Cebula, liść aloesu, liść trzykrotki, marchew, pomidor Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, skalpel, pęseta, pipety automatyczne Wykonanie
Przygotować skórkę z wklęsłej strony łuski cebuli jak w ćwiczeniu 5. Preparat umieścić w kropli hipertonicznego, 10% roztworu NaCl. Obserwować, narysować i wyjaśnić zjawisko plazmolizy.
Ćwiczenie 8 Obserwacje kryształów szczawianu wapnia
Materiały Okrywowa sucha łuska cebuli, łodyga rabarbaru Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne Wykonanie
Ćwiczenie 9 Barwniki komórkowe
Barwniki roślinne są glukozydami występującymi w wakuolach. Barwniki flawonowe są Ŝółte i nadają barwę płatkom rośliny. Barwniki antocyjanowe, w zaleŜności od pH nadają róŜne zabarwienie wakuolom od czerwonego, poprzez fioletowe do niebieskiego Materiały Liście czerwonej kapusty Sprzęt Mikroskop świetlny, szkiełka podstawowe, nakrywkowe, skalpel, pipety automatyczne Odczynniki 80% kwas octowy 10% amoniak Woda destylowana Wykonanie Przy uŜyciu skalpela wyciąć trzy kilkumilimetrowe skrawki skórki liścia czerwonej kapusty czerwonej i umieścić je na szkiełkach podstawowych. Następnie do jednego dodać kroplę 80% kwasu octowego, do drugiego kroplę 10% amoniaku, do trzeciego kroplę wody destylowanej. Przeprowadzić obserwację jak zawarte w kapuście antocyjany, w zaleŜności od odczynu środowiska, przybierają róŜne zabarwienie. Wykonać rysunek i zanotować obserwacje.
Sprawozdanie:
Literatura