Porównanie metod dezintegracji komórek, Egzaminy z Biologia

Pobierz Porównanie metod dezintegracji komórek i więcej Egzaminy w PDF z Biologia tylko na Docsity! 1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki Porównanie metod dezintegracji komórek Opracował : mgr Jan Lica; Zatwierdził (21.04.2016) : dr hab. Ewa Augustin, prof. dr hab. inż. Andrzej Składanowski. 1. Wstęp Dezintegracja - rozkład lub dekompozycja jednolitej nierozłącznej struktury; Dezintegracja komórek - proces powodujący utratę lub osłabienie integralności komórek; Wydajność - ilość czegoś wytworzonego/uzyskanego z czegoś; Wydajność metody dezintegracji komórek - stosunek masy produktu otrzymanego w wyniku dezintegracji, do jego masy teoretycznej; Utrata albo osłabienie spójności ściany komórkowej lub błony komórkowej, oddzielającej komórki od środowiska zewnętrznego, powoduje uwolnienie ich zawartości. Dezintegracja komórek służy pozyskaniu z komórek pożądanego materiału (Rysunek 1.). Pożądanym materiałem mogą być organella komórkowe (np. mitochondria czy jądro komórkowe, Rysunek 6. A), enzymy czy też inne związki chemiczne [1-3]. Wybór metody (techniki oraz procedury) dezintegracji komórek zależy od dalszego wykorzystania wyizolowanego z komórki materiału. Niekiedy krytyczną właściwością decydującą o przydatności wyizolowanego z komórki materiału jest zachowanie przez niego aktywności enzymatycznej (natywnej struktury). Wydajność i efektywność procesu dezintegracji zależy zaś od wykorzystanego urządzenia, doboru parametrów jego działania, akcesoriów (Rysunek 5.) a także kontroli środowiska reakcji. 2. Homogenizacja jako sposób dezintegracji komórek Homogenizacja - proces tworzenia mieszaniny z składników niemieszających się; Homogenizacja komórek - proces wytwarzania homogenatu (Rysunek. 1); Homogenat - ekstrakt komórkowy uzyskany po dezintegracji komórek; Homogenizator laboratoryjny - urządzenie mechaniczne służące do dezintegracji komórek; 2 Rysunek 1. Homogenizacja komórek Rysunek 1. Schemat przedstawiający najpopularniejsze metody dezintegracji. Na postawie grafiki Garland Publishing, 1996. 2.A. Homogenizacja przy użyciu homogenizatora laboratoryjnego 1) Homogenizator ultradźwiękowy - Sonikator – urządzenie wykorzystywane procesie dezintegracji cząstek bądź komórek zawartych w zawiesinie przy użyciu fal ultradźwiękowych (dużej mocy i małej częstotliwości 20 - 100 kHz). Utrata spójności komórki, następuje wskutek efektu kawitacji. Kawitacja jest zjawiskiem dynamicznego wzrostu i zaniku pęcherzy parowo-gazowych w cieczy, wywołane zmianami ciśnienia przy stałej temperaturze. O przebiegu zjawiska kawitacji decydują: dyfuzja/odgazowanie, parowanie/kondensacja, bezwładność cieczy, napięcie powierzchniowe, adhezja, lepkość cieczy. Siły mechaniczne tworzące się w miejscu zderzenia pęcherzyków kawitacyjnych oraz fala uderzeniowa generowana po ich implozji są głównymi czynnikami odpowiedzialnymi za uszkodzenie komórek. Efekt sonoporacji (nieodwracalne lub odwracalne uszkodzenie błony komórkowej) potęgowany jest przez substancje o charakterze rodników, tworzące się w wyniku termicznego rozkładu rozpuszczalnika i cząsteczek zawartych w zderzających się pęcherzykach. Właściwy przebieg tego procesu zależy od parametrów 5 D mm, V = 90 cm3, dH = 13 mm, f = 20 kH, A = 62 μm; I - Wpływ odległości głowicy emitera od dna komórki sonikacyjnej D i średnicy komórki sonikacyjnej DT na stężenie uwolnionych protein dla V = 90 cm3, dH = 13 mm, f = 20 kH, A = 62 μm, czas procesu = 180 sekund; Saccharomyces cerevisiae, [4]. 2) Homogenizator kulkowy – urządzenie stacjonarne (coraz częściej zautomatyzowane), służące dezintegracji komórek przy wykorzystaniu materiału rozbijającego w postaci kulek w homogenizowanej zawiesinie (wyjątek „procedury suche”). Budowa i właściwości kulek rozdrabniających, umożliwiają ich użycie w homogenizacji materiału biologicznego, takiego jak: twarde tkanki zwierzęce (np. tkanka kostna, zęby), twardy materiał roślinny (np. korzeń, nasiona), (Rysunek 5. D, E); miękkie tkanki zwierzęce (wątroba, serce, mózg, mięśni gładkie) oraz miękki materiał roślinny (Rysunek 5. F); mikroorganizmy, bakterie oraz ich przetrwalniki (Rysunek 5. G); biologiczny materiał środowiskowy (gleba, glina, osad, ścieki, odchody), (Rysunek 5. H, I). Rysunek 5. Akcesoria laboratoryjnego homogenizatora kulkowego Bead Ruptor 12 Rysunek 5. A - Zautomatyzowany homogenizator kulkowy, B - Tarcza rotatora umożliwiająca osadzenie 6 próbek, C - Jednorazowe probówki laboratoryjne, D - Kulki ceramiczne (6,5 mm), E - Kulki metalowe (2,4 mm), F - Kulki ceramiczne (1,8 mm), G - Kulki szklane (0,1 mm), H - Kulki Garnet (0,7 mm), H - Kulki Garnet (0,15 mm) [Omni International, USA]. A B C F I G E H 6 3) Homogenizator statorowo-rotorowy - urządzenie służące wytworzeniu homogenatu przez bezpośrednie uszkodzenie nożami głowicy rotora, błony lub ściany komórkowej; Ze względu na sposób obsługi urządzenia możemy wyróżnić : homogenizator ręczny (Rysunek 6. B) oraz stacjonarny homogenizator dużej mocy. Homogenizatory stacjonarne posiadają niezautomatyzowany lub zautomatyzowany (głównie homogenizatory wielostanowiskowe i wielozadaniowe) tryb pracy (Rysunek 6. C); W praktyce laboratoryjnej homogenizatory statorowo- rotorowe, (w zależności od budowy rotora i głowicy) wykorzystuje się do pracy z miękkimi lub twardymi tkankami zwierzęcymi. Homogenizacja tego typu materiału biologicznego, często wymaga dodania inhibitorów proteaz komórkowych oraz obniżenia temperatury mieszaniny reakcyjnej (0-4oC). Rysunek 6. Organella komórkowe, homogenizatory statorowo-rotatorowe; Rysunek 6. A - Schemat występujących w komórce organelli komórkowych; 1. Błona komórkowa, 2. Cyto- plazma, 3. Pęcherzyk fagocytarny, 4. Mitochondrium, 5. Retikulum wewnątrzplazmatyczne, 6. Rybosomy, 7. Lizosomy, 8. Wodniczki, 9. Aparat Golgiego. 10. Centriole, 11. Błona jądrowa, 12. Jądro, 13. Jąderko; B - Cyfrowy homogenizator ręczny z zespołem rozdrabniającym typu stator-rotor, Omni THq (Omni International, USA); C - Zautomatyzowany wielozadaniowy homogenizator, Omni LH-96 (Omni International, USA). 4) Homogenizator ciśnieniowy (tzw. Prasa Frencha) - urządzenie służące dezintegracji poprzez poddanie zawiesiny komórek wysokiemu ciśnieniu (podczas jej przemieszczania się przez ciasną szczelinę) i gwałtownemu uwolnieniu do ciśnienia atmosferycznego. Metoda pozwala na dezintegrację z wysoką wydajnością zawiesin komórek o objętości ok. 10-30 ml ale staje się technicznie trudna dla mniejszych objętości i zbyt czasochłonna dla objętości większych. Używana jest najczęściej do dezintegracji komórek bakteryjnych i drożdżowych. A B C 7 2.B. Homogenizacja bez użycia homogenizatora laboratoryjnego 1) Trawienie enzymatyczne - degradacja przy wykorzystaniu enzymu składników ściany komórkowej i otrzymaniu sfero/protoplastów. W przypadku bakterii używa się lizozymu trawiącego bakteryjne peptydoglikany, u drożdży używana jest zymoliaza/glukanaza (enzym trawiący glukan będący głównym składnikiem ściany komórkowej drożdży). Otrzymane sfero/protoplasy można poddać szokowi osmotycznemu lub innej technice dezintegracyjnej/separacyjnej (Rysunek 7.) [6]. 2) Szok/stres osmotyczny - nagła zmiana stężenia substancji rozpuszczonej wokół komórki, powodująca gwałtowne zmiany osmotyczne. Osmoza to dyfuzja rozpuszczalnika przez błonę/membranę rozdzielająca roztwory o różnym stężeniu. Komórki są wrażliwe na szok osmotyczny gdy przetrzymywane są w roztworach hipotonicznych (o ciśnieniu osmotycznym mniejszym niż w cytoplazmie). Metodę stosuje się głównie do lizy czerwonych komórek krwi (erytrocytów), komórek pozbawionych ściany komórkowej (np. protoplastów bakterii), drożdży. Rysunek 7. Przykłady homogenizacji bez użycia homogenizatora laboratoryjnego Rysunek 7. A - Roztwór hipotoniczny (stężenie substancji rozpuszczonej poza komórką jest niższe od stężenia substancji w jej środowisku wewnętrznym). Dyfuzja rozpuszczalnika do komórki powoduje rozszczelnienie lub trwałą utratę spójności błony komórkowej; B - Roztwór izotoniczny (roztwór otaczający komórkę ma takie samo stężenie substancji rozpuszczonej jak w jej środowisku wewnętrznym). Dyfuzja rozpuszczalnika do komórki ma wartość stałą; C - Roztwór hipertoniczny (stężenie substancji rozpuszczonej na zewnątrz komórki jest większe, od stężenia substancji w jej środowisku wewnętrznym; Dyfuzja substancji rozpuszczonej z komórki do roztworu otaczającego powoduje jej obkurczenie; D - Zdjęcia z mikroskopu świetlnego komórek drożdży, oraz wyizolowanych jąder komórkowych; a - Komórki drożdży w fazie stacjonarnej, b - Komórki drożdży w fazie logarytmicznego wzrostu, c - Sferoplasty (twory podobne do protoplastów, ale zawierające resztki materiału budującego ścianę komórkową) drożdży uzyskane pod A B C D E 10 Nadsącz (supernatant) - roztwór znad osadu; surowy ekstrakt; Spektrofotometr - urządzenie służące ilościowemu pomiarowi transmisji lub odbiciu światła przez próbkę (Rysunek 8 A.); Absorbancja - ilościowa miara absorpcji (pochłaniania) światła, stosowana w spektrofotometrii do oznaczania stężenia substancji w roztworze; logarytm dziesiętny ilorazu natężenia monochromatycznej wiązki wchodzącej do ośrodka absorbującego i natężenia wiązki przepuszczonej przez ten ośrodek (Lamberta-Beera prawo); Absorpcja - pochłanianie; m.in. chemiczne pochłanianie gazu przez ciecz, fizyczne pochłanianie promieniowania; w chemii proces dyfuzyjny polegający na pochłanianiu jakiejś substancji (zwany absorbatem) przez całą objętość innej substancji, która tworzy odrębną fazę (zwany absorbentem). Absorbatem jest najczęściej gaz lub ciecz, a absorbentem ciecz lub ciało stałe. Absorpcję prowadzi się często w celu wydzielenia określonego składnika z mieszaniny gazów; Metoda Bradford - opracowany przez Marion M. Bradford w 1976 roku, sposób oznaczania stężenia białka. Wykorzystuje on zdolność tworzenia w roztworze kwasu ortofosforowego, wiązań jonowych i oddziaływań hydrofobowych, pomiędzy błękitem kumazyny, a zasadowymi i aromatycznymi resztami aminokwasowymi (głównie Agr, ale także His, Lys, Tyr, Typ, Phe). Związanie błękitu kumazyny z białkiem powoduje przesunięcie jego maksimum absorbancji z 465 nm do 595 nm (czemu towarzyszy również zmiana barwy roztworu z brunatnej na niebieską a, wzrost liczby niebieskich form barwnika jest proporcjonalny do zawartości białka w rozworze) [8,9]. Rysunek 8. Narzędzia służące do pomiaru absorbancji A B C 11 Rysunek 8. A - Jednorazowe polistyrenowe kuwety spektrofotometryczne; B - Spektrofotometr SP-830 plus, Metertech; C - Krzywa wzorcowa: zależność stężenie BSA - absorbancja roztworu; Protein Quantitation Kit, (ab102535) Bradford Assay; abcam (USA). 4. Wykonanie ćwiczenia A) Organizacja pracy; Grupa odbywająca ćwiczenie zostanie podzielona na zespoły. Każdy zespół wykona dezintegrację komórek wybranymi do ćwiczenia metodami. W każdym zespole będzie wyznaczona osoba odpowiedzialna za wykonanie dezintegracji komórek oraz osoba odpowiadająca za przygotowanie roztworów wzorcowych do wyznaczenia krzywej wzorcowej: zależność stężenie BSA - absorbancja roztworu. B) Przygotowanie próbek; 1) próbki do dezintegracji; opisać/oznaczyć 50 ml probówki symbolem wybranej metody, a następnie odważyć do każdej z nich po 2 gramy masy drożdży piekarniczych (w metodzie z moździerzem odważyć i przenieść do misy moździerza). Następnie z próbkami dla przypisanych metod należy postępować w następujący sposób : - kontrola: 50 ml probówkę napełnić PBS do objętości 20 ml i zakręcić. Zawartość probówki wytrząsać ręcznie przez dwie minuty, a następnie odstawić na 8 minut. Czynność tę powtórzyć trzykrotnie. Tak przygotowaną próbkę wirować z pozostałymi próbkami (w ciągu 10 minut, w temperaturze pokojowej, z prędkością 2500 obrotów na minutę). Klarowny nasącz zachować do oznaczenia stężenia białka. - do homogenizacji przy użyciu sonikatora: 50 ml probówkę napełnić (używając do tego celu 5 ml pipety) PBS do objętości 20 ml, zakręcić, a następnie wytrząsać ręcznie przez 30 minut. Przygotowaną próbkę przelać do komórki sonikacyjnej umieszczonej w układzie chłodzącym (komórka sonikacyjna, woda/lód, styropian). Układ, zgodnie z instrukcjami prowadzącego ćwiczenie, umieścić w sonikatorze i nastawić podane przez prowadzącego parametry generacji ultradźwięków. Po sonikacji homogenat przelać na powrót do probówki 50 ml i zakręcić. Tak przygotowaną próbkę wirować z pozostałymi (w ciągu 10 minut, w temperaturze pokojowej, z prędkością 2500 obrotów na minutę). Klarowny nasącz zachować do oznaczenia stężenia białka. - do homogenizacji przy użyciu stacjonarnego homogenizatora kulkowego: odważyć 16 g szklanych kulek o średnicy 2 mm i przenieść do przypisanej probówki 50 ml. Pipetą 5 ml uzupełnić PBS do objętości 20 ml. Próbówkę zakręcić i wytrząsać przez 30 minut przy użyciu Wortexu (ustawić obroty maksymalne). Po homogenizacji przenieść zawiesinę komórek (posługując się 5 12 ml pipetą) do nowej probówki 50 ml, zakręcić i oznaczyć; (Uwaga: próbówkę falkon 50 ml zawierającą szklane kulki, zakręcić i oddać prowadzącemu ćwiczenie). Przygotowaną próbkę wirować z pozostałymi próbkami (w ciągu 10 minut, w temperaturze pokojowej, z prędkością 2500 obrotów na minutę). Klarowny nasącz zachować do oznaczenia stężenia białka. - do homogenizacji przy użyciu detergentów (SDS i Triton X-100): do 2 próbówek falkon 50 ml, zawierających po 2 g droży piekarskich, dodać odpowiednio 200 µl 10% SDS albo 200 µl 10% Triton X-100 i uzupełnić PBS (za pomocą 5 ml pipety) do objętości 20 ml. Probówki zamknąć i wytrząsać ręcznie przez dwie minuty, a następnie odstawić na 8 minut. Czynność tę powtórzyć trzykrotnie. Tak przygotowaną próbkę wirować z pozostałymi próbkami (w ciągu 10 minut, w temperaturze pokojowej, z prędkością 2500 obrotów na minutę). Klarowny nasącz zachować do oznaczenia stężenia białka. - do homogenizacji przez rozcieranie: do drożdży w moździerzu dodać 2 ml PBS i rozcierać do uzyskania jednolitej kleistej masy (w przybliżeniu 25 minut). W czasie rozcierania dodawać stopniowo 2 g obojętnego tlenku glinu. Do otrzymanego homogenatu dodać 4 ml PBS i dobrze wymieszać. Przenieść zawiesinę do 50 ml probówki. Przepłukać dokładnie moździerz 5 ml PBS i przelać zawartość do zawiesiny w probówce. Próbówkę uzupełnić PBS do objętości 20 ml, zakręcić i wytrząsać ręcznie przez 1 minutę. Tak przygotowaną próbkę wirować z pozostałymi próbkami (w ciągu 10 minut, w temperaturze pokojowej, z prędkością 2500 obrotów na minutę). Klarowny nasącz zachować do oznaczenia stężenia białka. 2) próbki do wyznaczenia krzywej wzorcowej zależności: stężenie BSA - absorbancja roztworu Bradford; - rozwory stężeń wzorcowych BSA w PBS; W probówkach 1,5 ml Przy użyciu pipet automatycznych i jednorazowych końcówek wykonaj roztwór BSA o końcowej objętości 1 ml i stężeniu : 0 - blank; 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 25; 50; 100 [mg/ml] - w PBS. Stężenie roztworu wyjściowego BSA 100 mg /ml PBS. - roztwory odczynnika Bradford; przygotować w probówkach 1,5 ml roztwór odczynnika Bradford o końcowej objętości 1 ml. Liczba przygotowanych próbek powinna zgadzać się z : liczbą próbek stężeń BSA w PBS (0 - blank; 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 25; 50, 100 [mg/ml]) oraz liczbą próbek (homogenizowanych w eksperymencie wybranymi metodami). C) pomiar; - krzywa wzorcowa; do przygotowanych roztworów Bradford, pipetą automatyczną dodać (jeden roztwór Bradford - jedno stężenie) po 20 µl roztworu stężeń wzorcowych BSA w PBS (rozcieńczając tym samym stężenie BSA pięćdziesięciokrotnie). Probówki zamknąć i wytrząsać 30 sekund na Worteksie. Uruchomić spektrofotometr i ustawić pomiar absorbancji przy długości fali λ=595 nm. Roztwór o stężeniu 0 przelać do jednorazowej kuwety spektrofotometrycznej. Umieścić