Pobierz Wprowadzanie Wiązań Disiarczkowych do Białek w Komórkach Bakterii: Rola Białek Dsb i więcej Publikacje w PDF z Microbiologia tylko na Docsity!
Index Copernicus ICV = 9,65 (2013) Impact Factor ISI = 0,271 (2013) Punktacja MNiSW = 15,00 (2012)
http://www.pm.microbiology.pl
Kwartalnik
Tom 53
Zeszyt 4•
PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡
CODEN:
PMKMAV 53 (4)
Advances in Microbiology
POL SK IE TOWA R Z YST WO MIK ROBIOLOGÓW
RADA REDAKCYJNA JACEK BARDOWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), DARIUSZ BARTOSIK (Uniwersytet Warszawski), JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), NADZIEJA DRELA (Uniwersytet Warszawski), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), JACEK MIĘDZOBRODZKI (Uniwersytet Jagielloński), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), RADOSŁAW STACHOWIAK (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański), ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowa Akademia Techniczna), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Narodowy Instytrut Zdrowia Publicznego, Państwowy Zakład Higieny), GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), BOHDAN STAROŚCIAK (zastępca), RADOSŁAW STACHOWIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) ADRESY REDAKCJI Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 04, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51 e-mail: [email protected] Sekretarz Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 12, fax (22) 554 14 04 e-mail: [email protected] PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie) Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorski Uniwersytet Medyczny, Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin, tel./fax: (91) 46 616 51, 52, lub fax: (91) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected] STALI RECENZENCI: JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu) CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄ MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1 Informacja o zdjęciu na okładce : Prototheca blaschkeae – stadia rozwojowe: sporangia i sporangiospory. SEM, pow. 2 000 x. Autor zdjęcia: dr n. med. Tomasz Jagielski; Zakład Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, ul. I. Miecznikowa 1; 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected]. P O L S K I E T O W A R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W Nakład 1150, Objętość 9,5 ark. wyd., Papier offset 80 g Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel. 22 115 38 10, 607 217 879 e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz
POST. MIKROBIOL., 2014, 53, 4, 305– http://www.pm.microbiology.pl
- Autor korespondencyjny: Instytut Biochemii Technicznej, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka, ul. B. Stefa- nowskiego 4/10, 90-924 Łódź; tel. (42) 631 34 32; e-mail: [email protected]
1. Wstęp Zasadniczą rolę we właściwej inicjacji transkrypcji genów pełni główny czynnik sigma polimerazy RNA. W przypadku Escherichia coli jest to σ^70 , natomiast u Bacillus subtilis – σ^43. Czynnik ten tworząc holoen- zym w kompleksie z rdzeniem polimerazy RNA odpo- wiada za prawidłową regulację transkrypcji większości genów. To zapewnia komórkom bakteryjnym prawi- dłowy wzrost w optymalnych warunkach [41, 68]. Adaptacja komórek bakteryjnych do nietypowych dla ich wzrostu warunków otoczenia oraz umiejęt- ność przetrwania w takim środowisku jest wynikiem odpowiedzi komórek na zaistniały stres. Na skutek wywołanego w komórce stresu, następują określone zmiany w jej metabolizmie. Ma to na celu zapewnie- nie przeżycia komórkom w środowisku o zmienionych parametrach, jak i ich ochronę przed szkodliwym jego wpływem. Wówczas w wyniku ekspresji ściśle określo- nych genów, regulowanych na poziomie transkrypcji
ROLA ALTERNATYWNYCH CZYNNIKÓW SIGMA S (σS)
I SIGMA B (σB) W ODPOWIEDZI KOMÓRKI BAKTERYJNEJ
NA STRES ORAZ ICH REGULACJA
Marzena Opęchowska^1 *, Stanisław Bielecki^1 (^1) Instytut Biochemii Technicznej, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika Łódzka Wpłynęło w czerwcu 2014 r.
- Wstęp. 2. Alternatywny czynnik sigma B (σB). 2.1. Regulacja σB^ u Bacillus subtilis. 2.2. Regulacja σB^ u Bacillus cereus. 2.3. Geny zależne od σB. 3. Alternatywny czynnik sigma S (σS/rpoS). 3.1. Regulacja transkrypcji rpoS. 3.1.1. Czynniki kontrolujące transkrypcję rpoS. 3.1.1.1. cAMP-CRP i EIIA(Glc). 3.1.1.2. Wpływ ppGpp na transkrypcję rpoS. 3.2. Regulacja translacji rpoS. 3.2.1. Funkcje regulatorowych RNA w translacji rpoS. 3.2.2. Wpływ UDP-glukozy na translację rpoS. 3.3. Regulacja proteolizy σS. 3.3.1. Degradacja σS^ przez kompleks proteazy ClpXP zależnej od ATP. 4. Podsumowanie The role of alternative sigma factor S (σS) and sigma factor B (σB) in bacterial cell stress response and their regulation Abstract: Bacteria successfully take possession of almost every recess of the earth. However bacteria can be liable to big changes of environmental conditions in every settled biotope. Some of them living in a high specializated medium do not show usually ability of tolerate others media than their most favourable. In case of changes of medium parameters some of bacteria start to migrate and look for others media securing them proper growth and development approximate optimum conditions. There are also bacteria which are able to survive in spite of changes happen in their direct environmental. Their survival competence is caused by the lack of susceptibility on specified medium changes or ability of adaptation to new conditions moreover by taking the profits from the medium. The tolerance and adaptation bacterial cells to different conditions which following in the nearest environmental result from cells response on stress factors. Precised signals coming from the medium cause in the cells a number of changes happen in genes expression regulated on transcription and translation level. The information coded in bacterial genome enable cells to produce many different proteins. However not all proteins are synthesized in the same time and the process of their synthesis is subject to strict control. Cells under stress synthesize proteins which secure them survival in untipical for their growing conditions. The main roles in this process play alternative sigma factors. Bacterial cells contain also general sigma factor (for example σ^70 in Escherichia coli, σ^43 in Bacillus subtilis) responsible for transcription most of the genes. However alternative sigma factors rarely regulate initiation of transcription. They are active only in case of cell stress conditions and also they take part in gene expression conected with the life cycle of the cell and stationary or exponential growth phase of bacteria. The most important function in stress conditions of E. coli plays an alternative sigma S (σS, σ^38 ) factor. Because of its regulatory function a lot of attention is dedicated to researches refer to σS^ in a recent time. Sigma B – which is one of the best known alternative sigma factors in Gram- positive bacteria – plays a similar role to sigma S. Factor σB^ functions as a general response regulator to stress in such bacteria as Bacillus, Staphylococcus and Listeria. These two alternative sigma factors: sigma S and sigma B often, if not always work in connection with others form of regulation. Bacteria show ability of detection many signals coming from the environment by means of sensors systems situated in cell envelope. Although σS^ and σB^ play the similar role in the cell they are controlled by completely different mechanisms.
- Introduction. 2. Alternative sigma factor B (σB). 2.1. Regulation of σB^ in Bacillus subtilis. 2.2. Regulation of σB^ in Bacillus cereus. 2.3. σB^ – dependent genes. 3. Alternative sigma factor S (σS/rpoS). 3.1. Regulation of rpoS transcription. 3.1.1. Factors controlling rpoS transcription. 3.1.1.1. cAMP-CRP i EIIA(Glc). 3.1.1.2. The influence of ppGpp on rpoS transcription. 3.2. Regulation of rpoS translation. 3.2.1. The functions of regulatory RNAs in rpoS translation. 3.2.2. The influence of UDP-glucose on rpoS translation. 3.3. Regulation of σS^ proteolysis. 3.3.1. Degradation of σS^ by the ClpXP ATP-dependent protease complex. 4. Conclusion Słowa kluczowe: alternatywne czynniki sigma, ClpXP, odpowiedź komórki na stres, sigma B, sigma S Key words: alternative sigma factors, ClpXP, cell stress response, sigma B, sigma S
ROLA ALTERNATYWNYCH CZYNNIKÓW SIGMA S (σS) I SIGMA B (σB)... 307 nego typu bodźca komórkowego do czynnika sigma B zachodzi poprzez dwie powiązane, ale oddzielne drogi przekazu sygnału (Rys. 2) [19, 60]. Transfer bodźców pochodzących ze środowiska zachodzi za pośrednictwem białek regulatorowych, kodowanych przez operon sigB. W przypadku stresu energetycznego, w transmisję sygnału zaangażowane są białka kodowane przez operon zbudowany z dwóch genów rsbQ-rsbP, zlokalizowany w pewnej odległości od operonu sigB. W przypadku Listeria monocytogenes nie wykazano obecności operonu rsbQ-rsbP. Białka RsbV i RsbW stanowią dwa pierwsze regula- tory aktywności σB^ u Bacillus subtilis. W fazie wzrostu wykładniczego, czynnik anty-sigma RsbW związany jest bezpośrednio z czynnikiem σB, co zapobiega asocja- cji czynnika σB^ do rdzenia polimerazy RNA. Zarówno aktywność kinazy RsbW jak i działanie dwóch fosfataz typu PP2C – RsbP i RsbU regulują stan ufosforylowa- nia RsbV. Fosfataza RsbP uczestniczy w aktywacji σB w odpowiedzi na zaistniałe zaburzenia na energetycz- nym poziomie komórki (droga stresu energetycznego), podczas gdy RsbU odpowiada za przekazanie sygna- łów, wynikających ze stresu fizycznego i chemicznego (droga stresu środowiskowego). Ufosforylowany RsbV (na skutek aktywności kinazy serynowej RsbW) staje się nieaktywny, jako czynnik anty-anty-sigma. Jedynie nieufosforylowany RsbV może współzawodniczyć z σB o związanie się z RsbW. Uwolniony w ten sposób σB może wówczas związać się z polimerazą RNA i w dal- szej kolejności może nastąpić transkrypcja zależnych od σB^ genów ścisłej odpowiedzi na stres [20]. Defosfo- rylacja RsbV następuje w wyniku działania aktywnej fosfatazy RsbU lub RsbP, w zależności od rodzaju ode- branego sygnału, wywołującego w komórce stres [19]. Pod wpływem stresu środowiskowego, zachodzi aktywacja fosfatazy RsbU przez drugie białko RsbT. W czasie, gdy komórka nie podlega stresowi, białko RsbT związane jest (co zapobiega oddziaływaniu RsbT z RsbU) z negatywnym regulatorem – RsbS, w dużym (1,8 MDa) wielobiałkowym kompleksie, określanym jako stresosom (stressosome) [71]. Stresosom składa się z RsbS i RsbR, a także czterech paralogów białka RsbR (RsbRA): YkoB (RsbRB), YojH (RsbRC), YqhA (RsbRD) i YtvA [26, 60, 69, 71, 72]. RsbS składa się z pojedynczej domeny STAS ( s ul- phate t ransporter and a nti-anti- s igma factor). Wiążąc się z paralogami RsbR poprzez silnie konserwowane domeny STAS C-terminalne, tworzy z nimi określoną strukturę. W wyniku stresu środowiskowego zachodzi ufosforylowanie domen STAS przez kinazę RsbT, która następnie oddysocjowuje od kompleksu [60]. Następ- nie uwolniony RsbT wiąże i aktywuje fosfatazę RsbU, która wówczas ma możliwość oddziaływania na sub- strat RsbV-P, na skutek czego następuje defosforylacja czynnika anty-anty-sigma, RsbV, co prowadzi do akty- wacji czynnika sigma B. Białka RsbR pełnią niezbędną rolę we właściwym oddziaływaniu pomiędzy białkami RsbS i RsbT. Pod- czas stresu RsbR odgrywa rolę aktywatora kinazy RsbT względem RsbS, co prowadzi do oddzielenia się RsbT od kompleksu tworzonego z RsbS i związanie się z RsbU. Fosforylacja RsbS jest kluczowym procesem, Rys. 2. Schemat aktywacji czynnika σB^ w komórkach B. subtilis. Zmodyfikowany na podstawie M a r l e s - W r i g h t i wsp. [60] za zgodą wydawnictwa Elsevier i autorów
308 MARZENA OPĘCHOWSKA, STANISŁAW BIELECKI
który pozwala RsbT na związanie z RsbU. W tym pro- cesie RsbR również jest fosforylowane przez RsbT przez co traci swoją zdolność aktywacji RsbT [20]. Jak dotąd nie poznano mechanizmu, w wyniku którego następuje ufosforylowanie białek RsbR i RsbS przez RsbT. W następstwie aktywacji σB^ rośnie poziom RsbX. Wzrost aktywności σB, wynikający z zaistniałego stresu pochodzenia środowiskowego, zostaje przywrócony do poziomu wyjściowego przy udziale fosfatazy RsbX, która defosforyluje i reaktywuje zarówno RsbR jak i RsbS (będący inhibitorem aktywności kinazy RsbT). Nieufosforylowana forma białka RsbS wiąże się z kinazą RsbT, co przerywa aktywację regulonu odpowiedzi na stres. Nie jest wyjaśnione czy wzrost poziomu RsbX przyczynia się do redukcji aktywności σB. Jednak w przypadku eliminacji białka RsbX następuje wzrost aktywności σB^ do bardzo wysokich poziomów. W odpowiedzi na zaistniały stres energetyczny, następuje aktywacja RsbV przez fosfatazę RsbP, która aktywowana jest przez RsbQ. Dokładny mechanizm tej aktywacji nie jest znany, ale analizy strukturalne RsbQ wykazują, że białko jest α/β hydrolazą, wiążącą małe, niezidentyfikowane hydrofobowe cząsteczki, które mogą brać udział w aktywacji RsbP [18, 43, 49, 60]. 2.2. Regulacja σB^ u Bacillus cereus W przypadku bakterii Bacillus cereus wykazano, że regulacja czynnika σB^ znacząco różni się od pozna- nych dróg regulacji σB^ innych Gram-dodatnich bak- terii o niskiej zawartości par GC. Stwierdzono, że w przeciwieństwie do B. subtilis u bakterii B. cereus nie występują obydwie drogi aktywacji B^ zachodzące pod wpływem stresu środowiskowego czy energetycznego. D e B e e n i wsp. [25] wskazali bowiem, że droga powstałego sygnału wynikającego ze stresu pocho- dzenia środowiskowego i wewnątrzkomórkowego jest jednakowo skierowana do jednego białka – membra- nowej multisensorowej hybrydowej kinazy histydyno- wej BC1008 (RsbK, Regulator of sigma b; “K” – hybrid Kinase), odgrywającej istotną rolę w regulacji σB (Rys. 3). Stwierdzono to w oparciu o analizę sekwen- cyjną, świadczącą o obecności wielu domen w RsbK, m.in. CHASE3 (zewnątrzkomórkowy sensor, prawdo- podobnie oskrzydlony dwiema transmembranowymi helisami), GAF (wewnątrzkomórkowy sensor wiążący małe ligandy) i PAS/PAC (sensor redoks, światła, meta- bolitów) [24, 25, 36]. Wyniki badań dowodzą, iż RsbK fosforyluje regulator odpowiedzi RsbY (serynową fosfa- tazę typu PP2C – kontrolującą aktywność σB; homolog RsbU i RsbP komórek B. subtilis) prowadząc do defos- forylacji RsbV. Następnie nieufosforylowany RsbV wiąże się z antagonistą σB, RsbW, uwalniając ostatecz- nie σB^ [21, 84]. Wykazano, że gen rsbK zlokalizowany jest blisko sigB w genomie. Zarówno rsbK jak i rsbY zlokalizowane są w konserwowanym obszarze genu. Badania genomu sugerują, że RsbK i RsbY stanowią jeden funkcjonalny moduł RsbKY w kontroli aktyw- ności σB^ u B. cerus, a także u patogenów B. thuringien- sis i B. anthracis [24, 25]. Dalsze badania wykazały, że Rys. 3. Schemat aktywacji czynnika σB^ w komórkach B. cereus. Zmodyfikowany na podstawie C h e n i wsp. [21] za zgodą wydawnictwa Wiley i autorów
310 MARZENA OPĘCHOWSKA, STANISŁAW BIELECKI
u Acetobacter methanolicus, Xanthomonas campestris, Pseudomonas putida i Rhizobium meliloti [29, 33]. Czynnik ten kieruje transkrypcją genów nie tylko w stacjonarnej fazie wzrostu, ale również odgrywa decydującą rolę w odpowiedzi komórki na stres [7, 43]. W wyniku stresu, następuje aktywacja transkryp- cji licznych genów, zależnych od σS. Dlatego też, σS określany jest jako nadrzędny regulator odpowiedzi na stres, wywoływanej przez wiele różnych sygnałów stresowych, ale także często przez obniżony poziom wzrostu komórek lub jego zahamowanie. Wywołana odpowiedź na stres ma na celu stworzenie możliwości przetrwania komórki w aktualnych warunkach stre- sowych, a także dodatkowo uchronić ją przed stresem jeszcze nie zaistniałym. Wzrost poziomu σS^ w komórce zachodzi w odpo- wiedzi na głód spowodowany brakiem źródeł węgla, azotu, fosforu, a także aminokwasów. Indukcja S^ może również nastąpić w wyniku zahamowania wzrostu komórek w stacjonarnej fazie wzrostu, jak i stresu wywołanego zbyt wysoką lub niską temperaturą, hiper- osmolarnością, niskim pH, obecnością etanolu, dużą gęstością komórek, a także stresu tlenowego. Produkty genów kontrolowanych przez σS^ mogą także powodo- wać zmiany morfologii komórki [43]. Badania także wskazują, że ponad 40% genów kon- trolowanych przez QS (ang. quorum sensing) jest także zależnych od RpoS. W o n g t r a k o o n g a t e i wsp. [88] wykazali, że białka biorące udział w odpowiedzi na szok ciepła, stres oksydacyjny, stres osmotyczny czy białka indukowane w stanie głodu komórki, są współre- gulowane zarówno przez RpoS jak i QS co wskazuje, że obydwa te czynniki są równie istotne w regulacji adap- tacji bakterii do zmian warunków wzrostu [76, 77, 88]. Ekspresja samego genu rpoS jest kontrolowana na poziomie transkrypcji, translacji oraz proteolizy samego białka [33, 54, 57, 61]. 3.1. Regulacja transkrypcji rpoS RpoS należy do operonu nlpD-rpoS znajdującego się w odległości 141 nukleotydów za operonem surE-pcm (Rys. 4). Mimo, że geny: surE, pcm, nlpD pełnią funk- cje podobne do rpoS, uczestnicząc w reakcjach bioche- micznych mających na celu umożliwienie komórkom przetrwanie w warunkach fazy stacjonarnej, to operon surE-pcm nie ma wpływu na ekspresję rpoS, jak rów- nież czynnik sigma S nie jest zaangażowany w ekspre- sję operonu surE-pcm [29]. Pomimo nieznanej funkcji surE wykazano, że uszkodzenie tego genu przejawia się obniżoną przeżywalnością komórek w stacjonarnej fazie oraz ich ograniczoną wytrzymałością na pod- wyższoną temperaturę i stres osmotyczny. Produkt genu pcm bierze udział w naprawie uszkodzonych komórek. Mutanty pcm wykazują zwiększoną wrażli- wość na stres tlenowy [29]. W transkrypcji rpoS uczestniczy kilka promoto- rów [43]. Policistronowy mRNA nlpD-rpoS składa się z dwóch, blisko położonych względem siebie promoto- rów: nlpDp1 i nlpDp2, powyżej genu nlpD, kodującego lipoproteinę o nieznanej funkcji. Kolejny promotor rpoSp zlokalizowany jest wewnątrz genu strukturalnego nlpD [43, 44, 55, 75]. Promotory nlpDp1 i nlpDp2 operonu nlpD-rpoS biorą udział w ekspresji rpoS, nie są jednak regulowane przez szybkość i fazę wzrostu komórek. Główny pro- motor rpoSp1 genu kodującego rpoS podlega induk- cji w momencie wejścia komórek w fazę stacjonarną, a także na skutek wywołanego stresu [43, 75]. 3.1.1. Czynniki kontrolujące transkrypcję rpoS 3.1.1.1. cAMP-CRP i EIIA(Glc) Mutacje genu cya, kodującego cyklazę adenylową oraz genu crp, kodującego białko receptorowe [CRP] cyklicznego AMP [cAMP] powodują, że poziom σS w komórce już w wykładniczej fazie wzrostu jest wysoki [43]. Tak więc cAMP-CRP jest negatywnym regulato- rem transkrypcji rpoS w wykładniczej fazie wzrostu komórek. Mechanizm działania cAMP-CRP w kon- troli transkrypcji rpoS zależy od fazy wzrostu. Wyniki badań wskazują, że podczas wejścia komórek w fazę stacjonarną, cAMP-CRP pozytywnie kontroluje trans- krypcję rpoS [43]. Cyklaza adenylowa jest pozytywnie kontrolowana przez crr, kodujący EIIA(Glc). Wynikiem mutacji crr jest podwyższony poziom σS^ w czasie trwania fazy wykładniczej, będący skutkiem zwiększonej transkryp- cji oraz translacji rpoS. Transkrypcję można ograni- czyć przez dodatek cAMP, co oznacza, że EIIA(Glc) wpływa na transkrypcję rpoS poprzez kierowanie aktywnością cyklazy adenylowej. Fenotypowo, mutanty crr wykazują w fazie logarytmicznej podobieństwo do mutantów cya [43]. 3.1.1.2. Wpływ ppGpp na transkrypcję rpoS Bezpośrednią przyczyną zmian stężenia RpoS są cząsteczki sygnałowe, generowane pod wpływem zmian środowiskowych, zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Do tych cząsteczek zalicza się m.in. czterofosforan Rys. 4. Transkrypcja rpoS. W regulacji transkrypcji genu kodu- jącego σS^ biorą udział trzy promotory: nlpDp1 (p1), nlpDp2 (p2) i rpoSp (p). Zmodyfikowany na podstawie E i s e n s t a r k i wsp. [29] za zgodą wydawnictwa Elsevier i autorów oraz S a n t o s i wsp. [75] za zgodą wydawnictwa Wiley i autorów
ROLA ALTERNATYWNYCH CZYNNIKÓW SIGMA S (σS) I SIGMA B (σB)... 311 guanozynowy (ppGpp) [37]. Jego poziom znacznie wzrasta w odpowiedzi na zmniejszenie stężenia ami- nokwasów, niezbędnych do syntezy białek, a także na skutek głodu węglowego, fosforanowego oraz azoto- wego [37, 82]. W tej sytuacji u bakterii następuje ogra- niczenie wielu aktywności metabolicznych, co określa się mianem odpowiedzi ścisłej. Ma ona charakter adap- tacyjny i stwarza komórce możliwość przetrwania w niesprzyjających warunkach [7]. Kumulowanie się w komórce nietypowych nukleotydów, m.in. ppGpp ma związek z odpowiedzią ścisłą. Odpowiedź ta jest bezpo- średnio indukowana przez przyłączenie się nienałado- wanych tRNA w miejscu A rybosomu, na skutek czego dochodzi do zahamowania tworzenia wiązania pep- tydowego, zatrzymania przemieszczających się rybo- somów po RNA i zapoczątkowania reakcji, w wyniku której na rybosomach zachodzi synteza ppGpp. Reakcję tę katalizuje białko RelA (produkt genu relA), wyka- zujące aktywność syntetazy ppGpp. W reakcji syntezy tego nukleotydu katalizowanej przez RelA, donorem grupy fosforanowej jest ATP, natomiast akceptorem GDP [23, 58, 62]. W przypadku innych głodowych warunków, w syn- tezie ppGpp pośredniczy również białko SpoT, produkt genu spoT [23, 62, 90]. Białko SpoT uczestniczy również w degradacji nukleotydu ppGpp do GDP, poprzez reak- cję pirofosforolizy. Odpowiedź ścisła ulega wygaśnięciu na skutek degradacji ppGpp. Jedynie mutanty relA spoT są zupełnie pozbawione ppGpp [53, 58, 63, 90]. Mutanty ppGpp wykazują wysoce zredukowany poziom σS. Niedobór glukozy i fosforanów (nie dotyczy to braku aminokwasów) nadal indukuje S, jednakże na niższym poziomie niż w przypadku natywnego szczepu [37, 43]. Przypuszcza się, że cząsteczki ppGpp mają wpływ raczej na elongację transkrypcji albo stabilność transkryptu rpoS niż na samą inicjację transkrypcji [43, 53]. 3.2. Regulacja translacji rpoS Translacja mRNA rpoS zachodzi na skutek zmian, których wynikiem jest hiperosmolarność, zakwaszenie środowiska, niska temperatura i in. Proces translacji zachodzi również w późnej fazie wykładniczej, gdy hodowla bakterii osiąga odpowiednio wysoką gęstość komórek [43]. 3.2.1. Funkcje regulatorowych RNA w translacji rpoS Adaptacja do zmian zachodzących w środowisku wymaga zarówno integracji sygnałów pochodzących z zewnątrz jak i koordynacji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi. Dotychczas opisano około 50 niekodu- jących małych RNA (sRNA) obecnych w komór- kach E. coli. Poziomy ekspresji wielu z nich różnią się w zależności od zmieniających się warunków środo- wiska, co wskazuje, że pełnią określoną rolę w procesie adaptacji komórki. RpoS jest najwcześniej poznanym genem regulo- wanym posttranskrypcyjnie przez przynajmniej trzy sRNA: DsrA, RprA oraz OxyS [74]. DsrA i RprA biorą udział w translacji rpoS, nato- miast OxyS pełni funkcję inhibitora [43]. DsrA pełni niewielką rolę w translacji rpoS przy wzroście komórek w temperaturze 37°C lub 42°C. Staje się jednak głównym czynnikiem stymulującym w temp. 30°C, a szczególnie w temp. 20°C [43, 79]. Przyczyną indukcji translacji σS^ w niskiej temperatu- rze jest znaczny wzrost transkrypcji dsrA, jak również sześciokrotny wzrost stabilności DsrA [43, 73]. W procesie regulacji translacji RpoS, DsrA jest negatywnym regulatorem HNS [43, 74]. HNS jest biał- kiem histonopodobnym, biorącym udział w organizacji nukleoidu, jak również w regulacji genu [43]. Mutanty HNS wykazują znacznie podwyższony poziom σS już w wykładniczej fazie wzrostu, porównywalny do poziomu σS, osiąganego przez natywny szczep dopiero w fazie stacjonarnej albo na skutek innych warunków stresowych [8, 43, 91]. Poza tym, w komórkach mutan- tów hns zwiększona jest szybkość translacji rpoS, a pro- teoliza σS^ jest silnie zredukowana, a nawet może nie zachodzić. Wolny wzrost i typowa dla mutantów hns niestabilność genetyczna, są w pewnym stopniu zwią- zane z nieprawidłowym, wysokim poziomem σS, który może zostać obniżony na skutek mutacji rpoS [8, 43]. Dotychczas nie wyjaśniono, w jaki sposób: pośrednio czy bezpośrednio HNS powoduje spadek poziomu translacji rpoS [43]. Regulatorowe białko LeuO pełni rolę represora tran- skrypcji dsrA. Nadprodukcja LeuO redukuje translację rpoS, zwłaszcza w niskiej temperaturze. Efekt ten zależy całkowicie od obecności DsrA. Mutacja LeuO nie jest przyczyną wzrostu poziomu translacji rpoS podczas trwania późnej fazy wykładniczej, jak i w odpowiedzi na wysoką osmolarność czy niską temperaturę. Nie jest to zjawisko całkowicie zaskakujące, ponieważ w takich warunkach ekspresja leuO jest ograniczona lub nawet wyciszona przez HNS [43, 50]. Jednakże w określo- nych warunkach (niedobór aminokwasów czy wejście komórek w fazę stacjonarną), następuje indukcja LeuO z udziałem pośrednika ppGpp. Przypuszcza się, że LeuO redukuje poziom DsrA w stacjonarnej fazie wzrostu, co może być przyczyną zmian ekspresji innych genów zależnych od DsrA – nie ma to jednak wpływu na poziom σS, prawdopodobnie z powodu działania innych mechanizmów indukują- cych σS, rekompensujących w ten sposób zredukowany poziom DsrA [43]. DsrA wraz z RprA uczestniczy w pozytywnej regu- lacji translacji RpoS. Obecność tych dwóch, znacznie różniących się sRNA – regulatorów translacji RpoS
ROLA ALTERNATYWNYCH CZYNNIKÓW SIGMA S (σS) I SIGMA B (σB)... 313 jedną formę holoenzymu polimerazy RNA [29]. RpoS pełni istotną rolę w oporności na stres oksydacyjny nie tylko poprzez regulację genów katG (katalazy I) ale i katE (katalazy II). Aktywności tych enzymów są bardzo istotne w oporności na nadtlenek wodoru [47]. Wykazano, że dwa kolejne elementy regulonu oxyR: dps i gor zawierają zarówno komponent OxyR/sigma- i sigma-38. W przypadku ekspresji Dps, różne formy polimerazy mogą oddziaływać z promotorem dps wyłącznie w różnych etapach cyklu życiowego komórki. Zatem ekspresja zależna od sigmy S następuje jedy- nie w późnej fazie stacjonarnej lub w odpowiedzi na głód, a transkrypcja oxyR/sigma-70 zachodzi jedy- nie podczas logarytmicznego wzrostu i w warunkach stresu tlenowego. Gen gor koduje enzym oksydoreduktazę glutatio- nową, który katalizuje reakcję redukcji utlenionego glutationu poprzez utlenienie NADPH [13, 22, 87]. W większości komórek glutation pełni istotną rolę względem komponentów komórkowych, chroniąc je przed destrukcyjnym wpływem tlenu. Wiadomo już, że gor wymaga OxyR do maksymalnej ekspresji i wyka- zano, że promotor gor jest także regulowany (bezpo- średnio lub pośrednio) przez sigma-38. B e c k e r -
- H a p a k i E i s e n s t a r k [13] wykazali, że poziom Gor jest znacznie niższy u podwójnych mutantów oxyR rpoS, w porównaniu do mutantów oxyR. Ta obserwacja daje również odpowiedź na pytanie, dlaczego poziom glutationu wzrasta, gdy komórki osiągają stacjonarną fazę wzrostu, ale nie zwiększa się poziom enzymów syn- tetyzujących glutation. J a n g i a m i wsp. [46] wskazali również na nie- zbędną rolę RpoS w ekspresji genu regulatora stresu oksydacyjnego, OxyR u Burkholderia pseudomallei. Mutanty szczepów pozbawione RpoS nie wykazywały ekspresji oxyR zarówno w normalnych warunkach wzrostu, jak i w warunkach stresu oksydacyjnego. Dowiedziono, iż RpoS pełni rolę pozytywnego trans- krypcyjnego regulatora ekspresji oxyR i dps (dpsA), a OxyR jako negatywnego transkrypcyjnego regulatora operonu katG-dpsA (w przypadku normalnych warun- ków wzrostu), jak i pozytywnego transkrypcyjnego regulatora (w warunkach stresu oksydacyjnego). Dla- tego też zarówno RpoS jak i OxyR są niezbędne w eks- presji operonu katG-dpsA i genu dpsA. U mutantów oxyR lub rpoS lub mutantów obu wymienionych genów stwierdzono spadek indukcji KatG w odpowiedzi na stres oksydacyjny. Podobną zależność stwierdzono dla genu dpsA, przy czym w tym wypadku RpoS i OxyR funkcjonują jako dwa niezależne pozytywne transkryp- cyjne regulatory ekspresji dpsA. Tak więc w normalnych warunkach wzrostu RpoS pozytywnie reguluje oxyR i dpsA podczas gdy OxyR negatywnie reguluje operon katG-dpsA. W warunkach stresu oksydacyjnego wzra- sta ekspresja rpoS oraz oxyR, a represja OxyR wywo- łuje pozytywną regulację katG-dpsA. W konsekwencji ekspresja operonu katG-dpsA wzrasta niezależnie od ekspresji genu (dpsA), zachodzącej z promotora roz- poznawanego przez RpoS [46]. 3.2.2. Wpływ UDP-glukozy na translację rpoS B ő h r i n g e r i wsp. [14] zasugerowali, że w komór- kach E. coli UDP-glukoza może pełnić rolę wewnątrz- komórkowej cząsteczki sygnałowej, kontrolującej eks- presję rpoS i genów zależnych od rpoS. Manipulacja ilością wewnątrzkomórkowej UDP-glukozy (głównie przez zastosowanie różnych stężeń glukozy w podłożu hodowlanym), z pewnością wpływa na zmiany poziomu rpoS. Te obserwacje mogą ułatwić zrozumienie wpływu wysokich stężeń glukozy na drastyczny spadek aktyw- ności katalazy, co czyni komórki wrażliwymi na H 2 O 2 [29, 30, 33]. Również mutanty posiadające defekt głównego metabolizmu węgla, którego skutkiem jest brak UDP-glukozy, wykazują podwyższony poziom σS podczas trwania wykładniczej fazy wzrostu. Te defekty mogą dotyczyć izomerazy fosfoglukozowej (kodowanej przez pgi) u mutantów wykorzystujących do wzrostu fruktozę, a także fosfoglukomutazy (pgm) lub urydyli- lotransferazy glukozo-1-fosforanowej (galU) u mutan- tów wykorzystujących do wzrostu glukozę [14, 43]. Wprowadzenie określonej ilość glukozy mutantom pgi oraz galaktozy mutantom pgm, powoduje szybkie uzupełnienie niedoboru UDP-glukozy, co wyraża się poprzez gwałtowny spadek poziomu σS. Podwyższony poziom σS^ w komórkach mutantów galU obserwuje się w przypadku nieuszkodzonego genu hfq (kodującego białko Hfq, prawdopodobnie bezpośrednio zaangażo- wane w proces inicjacji translacji), co sugeruje, że UDP- -glukoza bezpośrednio lub pośrednio zakłóca funkcję Hfq w translacji rpoS. Ze względu na to, że molekularny mechanizm dzia- łania UDP-glukozy nie został jeszcze wyjaśniony, nie można odpowiedzieć na pytanie, czy poziom UDP-glu- kozy w komórce zmienia się w odpowiedzi na jakie- kolwiek sygnały stresu, które mają wpływ na translację rpoS [14, 66]. 3.3. Regulacja proteolizy σS Transkrypcja i translacja rpoS jest determinowana przez określone warunki stresu [43]. Degradacja czyn- nika sigma S zostaje wówczas zahamowana, następuje jego kumulacja, a aktywacji ulega liczna grupa genów zależnych od σS, których produkty chronią komórki przed skutkami stresu [51]. W przypadku komórek wzrastających w bezstreso- wych warunkach również zachodzi synteza rpoS, jed- nak poziom komórkowego σS^ pozostaje niski z powodu szybkiej jego degradacji [43, 54, 80].
314 MARZENA OPĘCHOWSKA, STANISŁAW BIELECKI
3.3.1. Degradacja σS^ przez kompleks proteazy ClpXP zależnej od ATP Za degradację σS^ odpowiedzialna jest proteaza ClpXP (Rys. 6) [43]. ClpX pełni rolę białka opiekuń- czego (chaperonu), a podjednostce proteolitycznej ClpP nadaje specyficzność substratową. W przeciwieństwie do innych substratów ClpXP, σS^ nie może zostać roz- poznany przez sam ClpXP [28, 43, 91]. Wymagana jest obecność specyficznego regulatora odpowiedzi RssB (określany również jako: SprE, MviA – Salmonella i ExpM – Erwinia) [3, 10, 16, 43, 51, 65, 70]. RssB należy do grupy białek dwuskładnikowych regulatorów odpowiedzi, których aktywność uwarun- kowana jest przez fosforylację konserwowanej reszty aspartylowej (D58 w RssB). Eksperymenty in vitro wykazały, że jedynie ufosforylowany RssB wiąże się z σS^ [11, 43, 51]. Fosforylacja, jak również wiązanie σS nie zachodziły w przypadku wariantów RssB, w któ- rych D58 został zamieniony przez inny aminokwas. Mutanty te wykazywały wysoki poziom stabilnego σS [12, 15, 43, 51]. Tak jak większość regulatorów odpo- wiedzi, RssB składa się przynajmniej z dwóch domen, N-terminalnej domeny receptorowej, odbierającej sygnał (receiver domain) i C-terminalnej domeny, przetwarzającej sygnał (output – signal transduction
- domain). Unikatowa rola RssB w proteolizie wyraża się poprzez obecność domeny (domen), przetwarzają- cej sygnał (output), niewykazującej podobieństwa do żadnego innego białka o znanej funkcji. RssB nie ulega dimeryzacji ani oligomeryzacji w wyniku fosforylacji i wiąże σS^ tworząc kompleks 1:1, w stosunku stechio- metrycznym [43, 51]. Decydujące znaczenie w pro- teolizie σS^ odgrywa aminokwas K173, niezbędny we współdziałaniu z RssB. Jednopunktowa mutacja K173E, eliminuje szybką proteolizę σS^ [11, 43]. Związany z RssB sigma S, jest transportowany do proteazy ClpXP, tak jak inne substraty tej proteazy, a następnie ulega rozwinięciu i zostaje całkowicie zde- gradowany przez mechanizm zależny od hydrolizy ATP. Zaobserwowano in vitro obecność potrójnych kom- pleksów RssB-σS-ClpX oraz poczwórnych kompleksów, zawierających również ClpP. W kolejnym etapie RssB zostaje uwolniony z kompleksu. RssB pełni katalityczną rolę w inicjacji degradacji σS^ [43]. B o u g d o u r i wsp. [16, 17] zidentyfikowali i scharakteryzowali w komórkach E. coli regulator stabilności σS^ – białko IraP (zidentyfikowane również u Salmonella, Shigella i Erwinia), które pośród innych białek (tj: IraD (odgrywającego funkcję inhibitora aktywności RssB – w sytuacji wystąpienia uszkodzeń DNA), IraM (inhibitora aktywności RssB – w czasie niedoboru Mg2+) oraz RssC komórek Salmonella – sta- nowiącego homolog IraM E. coli) pełni rolę inhibitora degradacji σS. Może się ona wyrażać poprzez zakłócanie aktywności zarówno proteazy ClpXP, jak i białka RssB Rys. 6. Schemat degradacji alternatywnego czynnika σS. Zmodyfikowany na podstawie B a t t e s t i i wsp. [9] za zgodą wydawnictwa Elsevier i autorów oraz B o u g d o u r i wsp. [17] za zgodą wydawnictwa Wiley i autorów
316 MARZENA OPĘCHOWSKA, STANISŁAW BIELECKI
- Chen L-C., Chen J-C., Shu J-C., Chen C-Y., Chen S-C., Chen S-H., Lin C-Y., Lu C-Y., Chen C-C.: Interplay of RsbM and RsbK controls the σB^ activity of Bacillus cereus. Environ. Microbiol. 14 , 2788–2799 (2012)
- Christman M.F., Morgan R.W., Jacobson F.S., Ames B.N.: Posi- tive control of a regulon for defenses against oxidative stress and some heat-shock proteins in Salmonella typhimurium. Cell, 41 , 753–762 (1985)
- Dalebroux Z.D., Svensson S.L., Gaynor E.C., Swanson M.S.: ppGpp conjures bacterial virulence. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 , 171–199 (2010)
- De Been M., Francke C., Siezen R.J., Abee T.: Novel σB^ regulation modules of Gram-positive bacteria involve the use of complex hybrid histidine kinases. Microbiol. 157 , 3–12 (2011)
- De Been M., Tempelaars M.H., van Schaik W., Moezelaar R., Siezen R.J., Abee T.: A novel hybrid kinase is essential for regula- ting the σB-mediated stress response of Bacillus cereus. Environ. Microbiol. 12 , 730–745 (2010)
- Delumeau O., Chen C.C., Murray J.W., Yudkin M.D., Lewis R.J.: High-molecular-weight complexes of RsbR and paralogues in the environmental signaling pathway of Bacillus subtilis. J. Bac- teriol. 188 , 7885–7892 (2006)
- Dowds B.C.A.: The oxidative stress response in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Lett. 124 , 255–263 (1994)
- DuBow M.S., Ryan T., Young R.A., Blumenthal T.: Host factor for coliphage Q/β RNA replication: Presence in prokaryotes and association with the 30S ribosomal subunit in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 153 , 39–43 (1977)
- Eisenstark A., Calcutt M.J., Becker-Hapak M., Ivanova A.: Role of Escherichia coli rpoS and associated genes in defense against oxidative damage. Free Radic. Biol. Med. 21 , 975–993 (1996)
- Eisenstark A., Miller C., Jones J., Levén S.: Escherichia coli genes involved in cell survival during dormancy: role of oxidative stress. Biochem. Biophys. Res. Commun. 188 , 1054–1059 (1992)
- Engelmann S., Lindner C., Hecker M.: Cloning, nucleotide sequence and regulation of katE encoding a sigma B-depen- dent catalase in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 177 , 5598– (1995)
- Eymann C., Hecker M.: Induction of sigma (B)-dependent gene- ral stress genes by amino acid starvation in a spo0H mutant of Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Lett. 199 , 221–227 (2001)
- Fang F.C., Chen C., Guiney D.G., Xu Y.: Identification of σS-regulated genes in Salmonella typhimurium: complementary regulatory interactions between σS^ and cyclic AMP receptor pro- tein. J. Bacteriol. 178 , 5112–5120 (1996)
- Ferreira A., Gray M., Wiedmann M., Boor K.J.: Comparative genomic analysis of the sigB operon in Listeria monocytogenes and in other Gram-positive bacteria. Curr. Microbiol. 48 , 39– (2004)
- Fouet A., Namy O., Lambert G.: Characterization of the operon encoding the alternative σB^ factor from Bacillus anthracis and its role in virulence. J. Bacteriol. 182 , 5036–5045 (2000)
- Galperin M.Y.: Bacterial signal transduction network in a geno- mic perspective. Environ. Microbiol. 6 , 552–567 (2004)
- Gentry D.R., Hernandez V.J., Nguyen L.H., Jensen D.B., Cashel M.: Synthesis of the stationary-phase sigma factor σS is positively regulated by ppGpp. J. Bacteriol. 175 , 7982– (1993)
- Gerth U., Krűger E., Derre I., Msadek T., Hecker M.: Stress induction of the Bacillus subtilis clpP gene encoding a homo- logue of the proteolytic component of the Clp protease and the involvement of ClpP and ClpX in stress tolerance. Mol. Micro- biol. 28 , 787–802 (1998)
- Gottesman S.: Proteases and their targets in Escherichia coli. Ann. Rev. Genet. 30 , 465–506 (1996)
- Gruber T.M., Gross C.A.: Multiple sigma subunits and the par- titioning of bacterial transcription space. Annu. Rev. Microbiol. 57 , 441–466 (2003)
- Haldenwang W.G.: The sigma factors of Bacillus subtilis. Micro- biol. Rev. 59 , 1–30 (1995)
- Hecker M., Vőlker U.: Non-specific, general and multiple stress resistance of growth-restricted Bacillus subtilis cells by the expression of the σB^ regulon. Mol. Microbiol. 29 , 1129– (1998)
- Hengge-Aronis R.: Signal transduction and regulatory mecha- nisms involved in control of the σS^ (RpoS) subunit of RNA poly- merase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66 , 373–395 (2002)
- Ichikawa J.K., Li C., Fu J., Clarke S.: A gene at 59 minutes on the Escherichia coli chromosome encodes a lipoprotein with unusual amino acid repeat sequences. J. Bacteriol. 176 , 1630–1638 (1994)
- Ivanova A., Miller C., Glinsky G., Eisenstark A.: Role of the rpoS (katF) in oxyR-independent regulation of hydroperoxidase I in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12 , 571–578 (1994)
- Jangiam W., Loprasert S., Smith D.R., Tungpradabkul S.: Burk- holderia pseudomallei RpoS regulates OxyR and the katG-dpsA operon under conditions of oxidative stress. Microbiol. Immu- nol. 54 , 389–397 (2010)
- Jangiam W., Loprasert S., Tungpradabkul S.: Role of Burkholde- ria pseudomallei RpoS in regulation of catalase activities under hydrogen peroxide induction. Science Asia, 34 , 23–29 (2008)
- Kaan T., Jurgen B., Schweder T: Regulation of the expression of the cold shock proteins CspB and CspC in Bacillus subtilis. Molec. Gen. Genet. 262 , 351–354 (1999)
- Kaneko T., Tanaka N., Kumasaka T.: Crystal structures of RsbQ, a stress-response regulator in Bacillus subtilis. Protein Sci. 14 , 558–565 (2005)
- Klauck E., Bőhringer J., Hengge-Aronis R.: The LysR-like regu- lator LeuO in Escherichia coli is involved in the translational regulation of rpoS by affecting the expression of the small regu- latory DsrA-RNA. Mol. Microbiol. 25 , 559–569 (1997)
- Klauck E., Lingnau M., Hengge-Aronis R.: Role of the response regulator RssB in σS^ recognition and initiation of σS^ proteolysis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 40 , 1381–1390 (2001)
- Kruger E., Vőlker, U., Hecker, M.: Stress induction of clpC in Bacillus subtilis and its involvement in stress tolerance. J. Bac- teriol. 176 , 3360–3367 (1994)
- Lange R., Fischer D., Hengge-Aronis R.: Identification of trans- criptional start sites and the role of ppGpp in the expression of rpoS, the structural gene for the σS^ subunit of RNA-polymerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177 , 4676–4680 (1995)
- Lange R., Hengge-Aronis R.: The cellular concentration of the σS^ subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability. Genes Dev. 8 , 1600–1612 (1994)
- Lange R., Hengge-Aronis R.: The nlpD gene is located in an operon with rpoS on the Escherichia coli chromosome and enco- des a novel lipoprotein with a potential function in cell wall formation. Mol. Microbiol. 13 , 733–743 (1994)
- Loewen P.C.: Regulation of bacterial catalase synthesis (w) Molecular biology of free radical scavenging systems, red. J. Scandalios, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1992, s. 96–
- Loewen P.C., von Ossowski I., Switala J., Mulvey M.R.: KatF (σS) synthesis in Escherichia coli is subject to posttranscriptional regulation. J. Bacteriol. 175 , 2150–2153 (1993)
- Magnusson L.U., Farewell A., Nystrőm T.: ppGpp: a global regu- lator in Escherichia coli. Trends Microbiol. 13 , 236–242 (2005)
- Majdalani N., Chen S., Murrow J., John K.S., Gottesman S.: Regulation of RpoS by a novel small RNA: the characterization of RprA. Mol. Microbiol. 39 , 1382–1394 (2001)
ROLA ALTERNATYWNYCH CZYNNIKÓW SIGMA S (σS) I SIGMA B (σB)... 317
- Marles-Wright J., Lewis R.J.: Stress responses of bacteria. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 , 755–760 (2007)
- McCann M.P., Fraley C.D., Matin A.: The putative sigma factor KatF is regulated posttranscriptionally during carbon starvation. J. Bacteriol. 175 , 2143–2149 (1993)
- Mechold U., Potrykus K., Murphy H., Murakami K.S., Cashel M.: Differential regulator by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucl. Acids Res. 41 , 6175–6189 (2013)
- Mittenhuber G.: Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p)ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 , 585–600 (2001)
- Msadek T., Kunst F., Rapoport G.: MecB of Bacillus subtilis, a member of the ClpC ATPase family, is a pleiotropic regulator controlling competence gene expression and growth at high temperature. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 , 5788–5792 (1994)
- Muffler A., Fischer D., Altuvia S., Storz G., Hengge-Aronis R.: The response regulator RssB controls stability of the σS^ subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. EMBO J. 15 , 1333–1339 (1996)
- Muffler A., Traulsen D.D., Fischer D., Lange R., Hengge-Aro- nis R.: The RNA-binding protein HF-I plays a global regulatory role which is largely, but not exclusively, due to its role in expres- sion of the σS^ subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179 , 297–300 (1997)
- Nguyen L.H., Jensen D.B., Thompson N.E., Gentry D.R., Bur- gess R.R.: In vitro functional characterization of overprodu- ced Escherichia coli katF/rpoS gene product. Biochemistry, 32 , 11112–11117 (1993)
- Paget M.S.B., Helmann J.D.: The σ^70 family of sigma factors. Genome Biol. 4 , 203.1–203.6 (2003)
- Pane-Farre J., Lewis R.J., Stulke J.: The RsbRST stress module in bacteria: a signalling system that may interact with different output modules. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 9 , 65–76 (2005)
- Pratt L.A., Silhavy T.J.: The response regulator, SprE, controls the stability of RpoS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 , 2488– (1996)
- Reeves A., Haldenwang W.G.: Isolation and characterization of dominant mutations in the Bacillus subtilis stressosome com- ponents RsbR and RsbS. J. Bacteriol. 189 , 1531–1541 (2007)
- Reeves A., Martinez L., Haldenwang W.: Expression of, and in vivo stressosome formation by, single members of the RsbR pro- tein family in Bacillus subtilis. Microbiol. 156 , 990–998 (2010)
- Repoila F., Gottesman S.: Signal Transduction Cascade for Regu- lation of RpoS: Temperature Tegulation of DsrA. J. Bacteriol. 183 , 4012–4023 (2001)
- Repoila F., Majdalani N., Gottesman S.: Small non-coding RNAs, co-ordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoS paradigm. Mol. Microbiol. 48 , 855–861 (2003)
- Santos J.M., Freire P., Mesquita F.S., Mika F., Hengge R., Arraiano C.M.: Poly(A)-polymerase I links transcription with mRNA degradation via σS^ proteolysis. Mol. Microbiol. 60 , 177– 188 (2006)
- Schuster M., Hawkins A.C., Harwood C.S., Greenberg E.P.: The Pseudomonas aeruginosa RpoS regulon and its relationship to quorum sensing. Mol. Microbiol. 51 , 973–985 (2004)
- Schuster M., Lostroh C.P., Ogi LT., Greenberg E.P.: Identifica- tion, timing and signal specificity of Pseudomonas aeruginosa quorum-controlled genes: a transcriptome analysis. J. Bacteriol. 185 , 2066–2079 (2003)
- Scott J.M., Haldenwang W.G.: Obg, an essential GTP bind- ing protein of Bacillus subtilis, is necessary for stress activa- tion of transcription factor σB. J. Bacteriol. 181 , 4653– (1999)
- Sledjeski D.D., Gupta A., Gottesman S.: The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in E. coli. EMBO J. 15 , 3993–4000 (1996)
- Takayanagi Y., Tanaka K., Takahashi H.: Structure of the 5’ upstream region and the regulation of the rpoS gene of Esche- richia coli. Mol. Gen. Genet. 243 , 525–531 (1994)
- Tanaka K., Kusano S., Fujita N., Ishihama A., Takahashi H.: Promoter determinants for Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme containing 638 (the rpoS gene product). Nucleic Acids Res. 23 , 827–834 (1995)
- Traxler M.F., Summers S.M., Nguyen H.T., Zacharia V.M., High- tower G.A., Smith J.T., Conway T.: The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 68 , 1128–1148 (2008)
- Van Schaik W., Abee T.: The role of σB^ in the stress response of Gram-positive bacteria – targets for food preservation and safety. Curr. Opin. Biotechnol. 16 , 218–224 (2005)
- Van Schaik W., Tempelaars M.H., Zwietering M.H., de Vos W.M., Abee T.: Analysis of the role of RsbV, RsbW and RsbY in regu- lating σB^ activity in Bacillus cereus. J. Bacteriol. 187 , 5846– (2005)
- Varón D., Boyland S.A., Okamoto K., Price C.W.: Bacillus subtilis gtaB encodes UDP-Glucose pyrophosphorylase and is control- led by stationary-phase transcription factor σB. J. Bacteriol. 175 , 3964–3971 (1993)
- Voelker U., Voelker A., Maul B., Hecker M., Dufour A., Halden- wang W.G.: Separate mechanisms activate σB^ of Bacillus subtilis in response to environmental and metabolic stresses. J. Bacteriol. 177 , 3771–3780 (1995)
- Volkert M.R., Loewen P.C., Switala J., Crowley D., Conley M.: The Δ(argF-lacZ)205(U169) deletion greatly enhances resistance to hydrogen peroxide in stationary-phase Escherichia coli. J. Bac- teriol. 176 , 1297–1302 (1994)
- Wongtrakoongate P., Tumapa S., Tungpradabkul S.: Regulation of a quorum sensing system by stationary phase sigma factor RpoS and their co-regulation of target genes in Burkholderia pseudomallei. Microbiol. Immunol. 56 , 281–294 (2012)
- Wősten M.M.S.M.: Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiol. Rev. 22 , 127–150 (1998)
- Xiao H., Kalman M., Ikehara K., Zemel S., Glaser G., Cashel M.: Residual guanosine 3’,5’-bispyrophosphate synthetic activity of relA null mutants can be eliminated by spoT null mutations. J. Biol. Chem. 266 , 5980–5990 (1991)
- Yamashino T., Ueguchi C., Mizuno T.: Quantitative control of the stationary phase-specific sigma factor, σS, in Escherichia coli: involvement of the nucleoid protein H-NS. EMBO J. 14 , 594–602 (1995)
PROCES BIOGENEZY CYTOCHROMÓW C W KOMÓRKACH BAKTERYJNYCH – ROLA BIAŁEK DSB 319
plazmatycznych jest monomeryczne, 21 kDa, białko DsbA. Posiada ono aktywny motyw CXXC (CPHC w EcDsbA) umiejscowiony w zwoju tioredoksynowym [53]. In vivo pomiędzy cysteinami motywu występuje wiązanie kowalencyjne. W wyniku reakcji powstaje stabilne wiązanie disiarczkowe w substracie, natomiast dwie reszty cystein białka DsbA znajdują się w formie zredukowanej [39]. Żeby DsbA mogło przeprowadzić kolejny cykl reakcji musi zostać ponownie utlenione. Za ten proces odpowiedzialne jest 20 kDa białko DsbB. DsbB składa się z czterech transbłonowych helis (TM1-4) z dwiema pętlami skierowanymi do pery- plazmy (P1 i P2), każda z pętli posiada parę istotnych dla funkcji białka cystein. W P1 cysteiny tworzą motyw CXXC natomiast w P2 – CX 25 C, który jest bezpośrednio zaangażowany w przekazywanie wiązania disiarczko- wego do białka DsbA. DsbB, w odróżnieniu od innych białek należących do rodziny Dsb, nie posiada domeny o strukturze trzeciorzędowej typowej dla tioredoksyny. Z DsbB elektrony przekazywane są na ostateczne recep- tory przez kompleksy białkowe wchodzące w skład łań- cucha oddechowego. W białkach, które w sekwencji aminokwasowej posiadają więcej niż jedną parę cystein istnieje możli- wość błędnego wprowadzenia wiązań disiarczkowych przez DsbA, szczególnie w przypadku kiedy mostki tworzone są pomiędzy resztami tiolowymi cystein niesąsiadujących ze sobą. Błędnie wprowadzone wią- zania disiarczkowe powodują niewłaściwe zwinięcie białka, które może zostać zdegradowane przez proteazy peryplazmatyczne lub ulec procesowi izomeryzacji. Za rearanżacje wiązań disiarczkowych jest odpowiedzialne białko DsbC [58]. DsbC jest homodimerem, złożonym ze zwoju tioredoksynowego położonego na C-końcu białka połączonym α-helisą z N-końcowa domeną dimeryzacyjną. Dwie połączone podjednostki przy- pominają kształt litery V. Wnętrze tej struktury jest utworzone przez aminokwasy hydrofobowe i stanowi miejsce wiązania substratów [55]. W sekwencji amino- kwasowej białka znajdują się cztery cysteiny. Jedna para tworzy wiązanie disiarczkowe, które ma istotne zna- czenia dla stabilności struktury białka [51], natomiast pozostałe dwie cysteiny tworzą katalityczny motyw CXXC (CGYC w komórkach E. coli) i występują w nim w stanie zredukowanym. Forma dimeryczna zabez- piecza białko przed utlenieniem aktywnego motywu przez DsbB [5]. Homologiem białka DsbC występującym również w peryplazmie komórek bakterii Gram-ujemnych jest 26 kDa oksydoreduktaza DsbG. Tak jak DsbC jest homodimerem przyjmującym kształt litery V posiada- jącym również zwój tioredoksynowy z motywem kata- litycznym, którego cysteiny są głównie w formie zredu- kowanej oraz domenę dimeryzacyjną. D e p u y d t M. i wsp. wykazali, że główną funkcją białka DsbG jest ochrona protein zawierających pojedyncze cysteiny, niezaangażowane w tworzenie wiązań disiarczkowych, przed utlenieniem ich grupy tiolowej do kwasów sulfe- nowych (-SOH), w wyniku działania np. reaktywnych form tlenu [14]. Kwasy sulfenowe są wysoce reaktywne i szybko ulegają utlenieniu to kwasów sulifinowych (-SO 2 H) lub sulfonowych (-SO 3 H) [60]. Reakcje te są uważane za nieodwracalne. DsbC, DsbG oraz wspo- mniane niżej DsbE/CcmG występują, pomimo utle- niającego środowiska przestrzeni peryplazamtycznej, w formie zredukowanej. Mechanizmy odpowiedzialne za utrzymanie ich w stanie zredukowanym opisano w dalszej części pracy przeglądowej. W utleniających warunkach panujących w cytopla- zmie niektóre białka muszą być utrzymywane w sta- nie zredukowanym. Przykładem tego typu procesów jest biogeneza cytochromów typu c, proces w którym zachodzi ligacja hemu do zredukowanego motywu Cys-X-X-Cys-His apocytochromu [44, 71]. Za utrzy- manie apocytochromu c w formie zredukowanej odpo- wiedzialne jest białko Dsb nazwane początkowo DsbE a obecnie CcmG (cytochrome c maturation system). Pre- zentowana praca przeglądowa opisuje rolę białek Dsb w procesie dojrzewania cytochromu c.
2. Różnorodność procesu biogenezy cytochromów c w komórkach bakteryjnych Transport elektronów w komórce związany z pro- cesem oddychania komórkowego lub fotosyntezy jest zależny od cytochromów c, które w odróżnieniu od innych typów cytochromów posiadają kowalencyjnie przyłączony do łańcucha polipeptydowego hem (jon żelaza związany z protoporfiryną IX). Hem wiąże się kowalencyjnie przez węgiel grupy winylowej do reszt tiolowych łańcuchów bocznych cystein motywu kata- litycznego CXXCH apocytochromu c dwoma wiąza- niami tioeterowymi. Występują jednak wyjątki od tego schematu jak w przypadku Trypanosoma, gdzie do przyłączenia kofatora wymagane jest tylko jedno wiązanie tioeterowe przez motyw AXXCH lub FXXCH [4]. Również u niektórych gatunków bakterii zaobser- wowano wiązanie się hemu do motywów CXXXCH, CXXXXCH, CX 15 CH, CXXCK [33, 72]. Cytochromy c występują w formie rozpuszczalnej w peryplazmie lub są zakotwiczone w błonie wewnętrznej komórki bakteryjnej, w tylakoidach chloroplastów oraz prze- strzeni międzybłonowej w mitochondriach. Do tej pory poznano pięć różnych systemów biogenezy cyto- chromu c. System I funkcjonuje w komórkach wielu gatunków bakterii Gram-ujemnych i mitochondriach roślinnych, system II występuje w komórkach bak- terii Gram-dodatnich, niektórych Gram-ujemnych i chloroplastach, system III umożliwia dojrzewanie
320 PAULA ROSZCZENKO, MAGDALENA GRZESZCZUK, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA
cytochromu c w mitochondriach nieroślinnych, sys- tem IV jest specyficzny dla powstawania funkcjonal- nego cytochromu b 6 biorącego udział w procesie foto- syntezy [45]. Najsłabiej scharakteryzowany system V wykryto w mitochondriach świdrowców [4]. System I znany jako system Ccm (cytochrome c maturation) jest najbardziej złożonym szlakiem przy- łączania hemu do motywu CXXH w apocytochro- mach. Odpowiada on za dojrzewanie cytochromu c w komórkach bakterii Gram-ujemnych (α-, γ- i części β-proteobacteria), Archea oraz mitochondriach paso- żytów i roślin. Uczestniczy w nim najczęściej 9–10 bia- łek błonowych – CcmA, CcmB, CcmC, CcmD, CcmE, CcmF, CcmG, CcmH, CcmI oraz CcdA lub DsbD. Do tej pory system ten najlepiej scharakteryzowany został w komórkach E. coli. W warunkach tlenowych nie obserwuje się syntezy cytochromów c w komórkach E. coli. W komórkach bakterii hodowanych w atmos- ferze beztlenowej, niefermentacyjnej z dodatkiem osta- tecznych akceptorów takich jak azotany, azotyny czy N-tlenek trimetyloaminy następuje indukcja syntezy pięciu różnych cytochromów typu c [38]. Poza komór- kami E. coli został on także przebadany w komórkach między innymi Bradyrhizobium japonicum, Pseudomo- nas aeruginosa, Rhodobacter capsulatus. Geny kodujące białka systemu II, określanego skrótem Ccs (cytochrome c synthesis), można odna- leźć w genomach bakterii Gram-dodatnich, sinic, niektórych β-proteobacteria, a także w genomach δ- i ε-proteobacteria oraz w chloroplastach roślin. Badania nad jego mechanizmem działania rozpoczęły się w poło- wie lat dziewięćdziesiątych XX wieku, kiedy został on zidentyfikowany w wyniku analiz genetycznych Chlamy- domonas [80] oraz bakterii Bacillus sp. [46, 69] i Borde- tella sp. [43]. Szlak biogenezy cytochromu c z udziałem systemu II jest bardziej rozpowszechniony w przyro- dzie i prostszy od systemu I. Uczestniczą w nim cztery (czasami tylko trzy) związane z błonami białka: CcdA (cytochrome c deficiency) lub DsbD, ResA (respiration) warunkujące redukcję apocytochromu i ResB (CcsB) oraz ResC (CcsA) składniki syntetazy cytochromu c. Systemy I i II występujące w komórkach organiz- mów prokariotycznych mają organizację modułową. W obu systemach funkcjonują dwa elementy: zespół białek warunkujący transport apocytochromu c i reduk- cję jego cystein w peryplazmie i grupa białek odpo- wiedzialnych za transport hemu i jego połączenie ze zredukowanym apocytochromem c [68]. 2.1. Transport i redukcja apocytochromu Potranslacyjny transport apocytochromów c do przestrzeni peryplazmatycznej jest zależny od białek Sec [35, 76, 79]. Wiele badań wskazuje na tworzenie wiązania disiarczkowego pomiędzy cysteinami motywu CXXCH bezpośrednio po transporcie z cytoplazmy, co najprawdopodobniej ma na celu ochronę białka przed przedwczesną degradacją [28]. Proces ten jest katali- zowany przez białka DsbA i DsbB [44]. Jednakże żeby powstała funkcjonalna cząsteczka holocytochromu c grupy tiolowe cystein motywu katalitycznego apo- cytochromu c muszą zostać ponownie zredukowane. Za proces redukcji bocznych cystein motywu CXXCH odpowiedzialne są zarówno w systemie I jak i II białka CcmG, początkowo nazywane DsbE. Nomenklatura dotycząca tych białek jest nieusystematyzowana, w róż- nych mikroorganizmach homologii DsbE nazywane są: CcmG (E. coli), ResA (Bacillus subtilis), HelX (Rhodo- bacter capsulatus), CcsX (Bordetella pertussis, Wolinella succinogenes), CycY (B. japonicum), HP0377 (Helico- bacter pylori). Białka CcmG odpowiedzialne za redukcję apocyto- chromu c, proces umożliwiający dołączenie hemu, są peryplazmatycznymi proteinami zakotwiczonymi w bło- nie cytoplazmatycznej komórek bakteryjnych. W bada- niach przeprowadzonych przez H o d s o n a i wsp. udokumentowano że usunięcie sekwencji sygnalnej warunkującej zakotwiczenie ResA B. subtilis w błonie cytoplazmatycznej obniża aktywność szlaku biogenezy cytochromu c [37], podobnie jak w przypadku jego homologa w systemie I, białka CcmG E. coli [3]. Badania strukturalne. Do tej pory udało się roz- wiązać strukturę trzeciorzędową w przypadku pięciu białek CcmG: CcmG B. japonicum [21] CcmG E. coli [59], ResA B. subtilis [13], CcmG P. aeruginosa [18] oraz Hp0377 H. pylori [81]. Rozwiązane struktury trzeciorzędowe białek CcmG wykazały, że posiadają one klasyczny zwój tioredok- synowy, składający się z czterech β-kartek otoczonych przez trzy α-helisy z dodatkową β-spinką do włosów zlokalizowaną na N-końcu białka. W centralnym regio- nie struktury znajduje się dodatkowa helisa oraz pętla, które mają istotne znaczenie w specyficznym wiąza- niu apocytochromów c. Usunięcie centralnego insertu z EcCmG skutkowało utratą funkcji białka [21]. Drugą istotną cechą białek CcmG jest kwasowy charakter regionu otaczającego centrum aktywne. O kwasowym charakterze decydują trzy aminokwasy – dwa kwasy glutaminowe (Glu98 i Glu158 w BjCcmG) i kwas asparaginowy (Asp97 w Bj CcmG), które są konser- wowane w większości, ale nie wszystkich CcmG. Reszty kwasowe znajdują się w odległości 5–8 Å od centrum aktywnego. Wprowadzenie mutacji punktowych (zamiana tych aminokwasów na alaniny) skutkowało obniżeniem poziomu holocytochromu c w stosunku do szczepów z dziką wersją CcmG. Białko TlpA B. japo- nicum też biorące udział w biogenezie cytochromu c nie posiada kwasowego regionu otaczającego centrum aktywne i w strukturze jego centralny insert nie two- rzy charakterystycznego zagłębienia. Te cechy struktu-
