Pobierz Udział jonów wapnia w regulacji oddziaływań aktyny z miozyną i więcej Publikacje w PDF z Biologia tylko na Docsity!
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 437
Joanna Moraczewska1, *
Małgorzata Śliwińska^1
Maria Jolanta Rędowicz^2
(^1) Uniwersytet Kazimierza Wielkiego w Byd- goszczy, Instytut Biologii Eksperymentalnej, Bydgoszcz (^2) Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcele- go Nenckiego PAN w Warszawie
*Uniwersytet Kazimierza Wielkiego w Bydgoszczy, Instytut Biologii Eksperymentalnej, ul. Chodkiewicza 30, 85-064 Bydgoszcz; e-mail:[email protected]
Artykuł otrzymano 22 października 2012 r. Artykuł zaakceptowano 24 października 2012 r.
Słowa kluczowe : aktyna, miozyna, jony wap- nia, aktywność ATPazowa, regulacja
Wykaz skrótów : CaD — kaldesmon; l-CaD — izoforma lekka kaldesmonu; h-CaD — izofor- ma ciężka kaldesmonu; CaM — kalmodulina; CaMK — kinaza zależna od Ca2+^ i kalmoduli- ny; CLP (ang. calmodulin like protein ) — białko podobne do kalmoduliny; IQ — motyw wiążą- cy lekkie łańcuchy miozyny lub kalmodulinę; ELC (ang. essential light chain ) — istotny lekki łańcuch miozyny; KRP (ang. kinase related pro- tein ) — białko pokrewne kinazie; MLCK (ang. myosin light chain kinase ) — kinaza lekkich łań- cuchów miozyny; cMLCK — izoforma sercowa MLCK; MLCP (ang. myosin light chain phospha- tase ) — fosfataza lekkich łańcuchów miozyny; PKA — kinaza zależna od cyklicznego AMP; RLC (ang. regulatory light chain ) — regulatoro- wy lekki łańcuch miozyny; cRLC — izoforma RLC w mięśniu sercowym; TM — tropomiozy- na; Tn — kompleks troponiny; TnC — tropo- nina C; TnI — troponina I; TnT — troponina T
Podziękowania : Praca powstała w ramach działania Sieci Naukowej: Mechanizmy Ru- chów Komórkowych Mobilitas.pl. Wsparcia finansowe MJR, z grantu nr N303 3593 35 Mi- nisterstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego oraz dotacji statutowej dla Instytutu Nenckiego z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego.
Udział jonów wapnia w regulacji oddziaływań aktyny z miozyną
STRESZCZENIE
S
kurcz komórek mięśniowych oraz różnorodne formy ruchliwości komórek niemięśnio- wych są uzależnione od cyklicznych oddziaływań pomiędzy filamentami aktynowymi i motorami molekularnymi z rodziny miozyn. Głównym wewnątrzkomórkowym przekaź- nikiem, który pośredniczy w aktywacji oddziaływań aktyny z miozyną są jony wapnia. W zależności od typu komórki oraz rodzaju miozyny, molekularne mechanizmy regulacji są różne i zachodzą na dwóch poziomach — na poziomie filamentu aktynowego oraz na pozio- mie miozyny. W komórkach mięśni poprzecznie prążkowanych regulacji podlega filament aktynowy, poprzez związany z nim kompleks troponiny. W mięśniach gładkich i w komór- kach niemięśniowych głównym białkiem regulującym aktywność filamentu cienkiego jest kaldesmon. Kontrola aktywności miozyny w tych komórkach odbywa się na drodze fosfo- rylacji lekkich łańcuchów oraz fosforylacji ciężkiego łańcucha miozyny. Bezpośrednie wią- zanie jonów wapnia z łańcuchami lekkimi (którymi mogą być cząsteczki kalmoduliny) jest obserwowane w przypadku miozyny mięśni mięczaków oraz niektórych miozyn niekon- wencjonalnych. Intensywne badania prowadzone w laboratoriach na całym świecie umożli- wiają coraz bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacji oddziaływań aktyny z miozyną. W niniejszym artykule zostały omówione współczesne poglądy na ten temat.
WPROWADZENIE
Aktyna i miozyna są białkami szeroko rozpowszechnionymi we wszystkich komórkach eukariotycznych, co świadczy o ich doskonałym przystosowaniu do pełnienia licznych funkcji. Oddziaływania pomiędzy aktyną i miozyną leżą u podstaw różnorodnych procesów ruchliwości, począwszy od skurczu mięśni szkieletowych i mięśnia sercowego, utrzymania napięcia mięśni gładkich, mi- gracji komórek niemięśniowych, poprzez cytokinezę i transport wewnątrzko- mórkowy, aż po ekspresję genów. Specyfika tych procesów jest determinowana przez różnorodność izoform miozyny oraz precyzję regulacji oddziaływań po- między tymi białkami. Oba czynniki umożliwiają właściwą odpowiedź komór- kową na sygnały zewnętrzne.
Aktyna występuje w komórkach w dwóch formach — monomerycznej i fila- mentowej. Przejście pomiędzy tymi formami jest procesem dynamicznym i ści- śle regulowanym przez liczne białka wiążące aktynę [1,2]. Filamenty aktynowe mają postać dwóch helikalnie zwiniętych łańcuchów, po których, jak po szy- nach, poruszają się białkowe motory molekularne z rodziny miozyn. Dotychczas poznano sekwencje blisko 2,5 tys. ciężkich łańcuchów miozyn, które na podsta- wie różnic w domenie motorycznej zaklasyfikowano do ponad 35 rodzin (klas). Najbardziej znane i najliczniej reprezentowane są miozyny tworzące dwubie- gunowe filamenty, zwane również miozynami konwencjonalnymi. Pozostałe miozyny zwane są miozynami niekonwencjonalnymi [3]. Wszystkie poznane dotychczas miozyny mają zbliżoną budowę domenową. Na końcu aminowym (końcu N) z reguły występuje najbardziej zachowana w ewolucji domena mo- toryczna, która jest zdolna do wiązania aktyny i ATP. Za domeną motorycz- ną znajduje się szyjka o strukturze helikalnej, do której dzięki oddziaływaniom niekonwalencyjnym przyłączają się łańcuchy lekkie. Dalej rozciąga się najbar- dziej zróżnicowana domena, zwana pałeczką lub ogonkiem, determinująca spe- cyficzne funkcje danej miozyny [4]. Domena motoryczna wraz z szyjką zwana jest również główką. Hydroliza ATP zachodząca w główce miozyny, powoduje zmiany konformacyjne napędzające cykliczne oddziaływania miozyny z aktyną. Gdyby dostępność ATP była jedynym czynnikiem warunkującym te oddziały- wania, wówczas wszystkie procesy zależne od miozyny byłyby konstytutywnie aktywne. Konieczność selektywnej aktywacji tylko niektórych procesów po- trzebnych w danym momencie życia komórki wymusiła rozwinięcie precyzyj- nych mechanizmów regulacji. Kaskada sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, któ- rą zapoczątkowuje wzrost stężenia jonów wapnia, jest głównym mechanizmem umożliwiającym kontrolę oddziaływań pomiędzy miozynami i aktyną.
438 www.postepybiochemii.pl
W komórkach pobudliwych jony wapnia stanowią główny wewnątrzkomórkowy przekaźnik sygnału. Odbiorcami tego sygnału są białka wiążące wapń, które z udziałem białek efek- torowych, uczestniczą w różnorodnych procesach zachodzą- cych w komórce. Aktywujące stężenia jonów Ca2+^ pojawiają się w komórce tylko przejściowo dzięki ich uwalnianiu z siateczki śródplazmatycznej oraz napływowi z zewnątrz. W stanie spo- czynku Ca2+^ są magazynowane w siateczce śródplazmatycznej oraz są transportowane na zewnątrz komórki, a ich stężenie w cytoplazmie jest stosunkowo małe (poniżej 0,1 mM). Pobu- dzenie komórki powoduje otwarcie kanałów wapniowych, dzięki czemu następuje wzrost stężenia Ca2+^ powyżej 1 mM. Regulacja stężenia jonów wapnia w komórkach różnego typu przebiega w nieco odmienny sposób. Ponieważ mechanizmy uwalniania Ca2+^ są dość zawiłe, nie będą omawiane w tym ar- tykule, a zainteresowane osoby odsyłamy do artykułów prze- glądowych poświęconych tym zagadnieniom, również w tym numerze „Postępów Biochemii”.
Zależna od stężenia Ca2+^ regulacja oddziaływań miozyny z filamentami aktynowymi, która funkcjonuje w mięśniach po- przecznie prążkowanych różni się w zasadniczy sposób od re- gulacji w mięśniach gładkich i w komórkach niemięśniowych. W mięśniach poprzecznie prążkowanych (czyli mięśniach szkieletowych i mięśniu sercowym) kontrola zachodzi głów- nie na poziomie filamentu aktynowego, poprzez kompleks troponiny, którego podjednostka — troponina C, wiąże jony wapnia. To zapoczątkowuje szereg zmian konformacyjnych prowadzących do odblokowania miejsc wiązania główek mio- zyny w cząsteczce aktyny i w konsekwencji do skurczu. W mięśniach gładkich i komórkach niemięśniowych gen troponi- ny nie ulega ekspresji, a funkcję regulatora filamentów aktyno- wych pełni kaldesmon (CaD). Chociaż CaD bezpośrednio nie wiąże jonów wapnia, to jest on wrażliwy na ich stężenie dzięki wiązaniu kalmoduliny (CaM). Kompleks CaM/Ca2+^ wiąże się do CaD w rejonie jego oddziaływań z aktyną, co prowadzi do odblokowania miejsc wiązania miozyny w cząsteczce aktyny. W mięśniach gładkich i komórkach niemięśniowych oddzia- ływania miozyny z aktyną są regulowane także na poziomie miozyny. W tym przypadku odbiorcą sygnału wapniowego jest również CaM, która po związaniu Ca2+^ aktywuje kinazę lekkich łańcuchów miozyny. Kolejnym etapem jest fosforyla- cja jednego z lekkich łańcuchów miozyny (regulującego), opla- tającego rejon szyjki, co prowadzi do aktywacji miozyny. W przypadku miozyny z mięśni mięczaków regulacja jej aktyw- ności następuje poprzez wiązanie się jonów wapnia z innym typem łańcucha lekkiego, zwanego istotnym.
Badania nad mechanizmami regulacji oddziaływań pomię- dzy miozyną i aktyną są przedmiotem intensywnych badań prowadzonych na całym świecie. Nowe fakty, które wyłoniły się w ostatnich latach pozwoliły lepiej zrozumieć te procesy. Celem tego artykułu przeglądowego jest podsumowanie aktu- alnych poglądów na temat udziału jonów wapnia w regulacji oddziaływania miozyny z aktyną.
Ca 2+^ W REGULACJI SKURCZU MIĘŚNI POPRZECZNIE PRĄŻKOWANYCH
Komórki mięśni poprzecznie prążkowanych, do których zaliczane są mięśnie szkieletowe oraz mięsień sercowy,
kurczą się dzięki oddziaływaniom pomiędzy filamenta- mi aktynowymi i miozynowymi regularnie upakowanymi w sarkomerach, czyli jednostkach kurczliwych komórek mięśniowych ograniczonych przez gęste struktury białko- we zwane liniami Z. Cienkie filamenty aktynowe jednym końcem są zakotwiczone w linii Z, a drugim są skierowane w stronę centrum sarkomeru. Grube filamenty miozynowe mają strukturę dwubiegunową. Oznacza to, że główki mio- zyny wystają po obu końcach grubego filamentu. Ponieważ filamenty miozynowe są ulokowane w centrum sarkomeru, główki znajdujące się na przeciwległych końcach oddziału- ją z filamentami aktynowymi powodując wnikanie filamen- tów miozynowych pomiędzy aktynowe, a to prowadzi do skracania sarkomeru i w konsekwencji do skurczu [5].
STRUKTURA FILAMENTÓW CIENKICH MIĘŚNI POPRZECZNIE PRĄŻKOWANYCH
Centralnym białkiem filamentów cienkich jest fibrylarna aktyna (F-aktyna), powstała w wyniku polimeryzacji glo- bularnych podjednostek aktyny monomerycznej (Ryc. 1). Filament aktynowy zbudowany jest z dwóch spiralnie zwi- niętych łańcuchów podjednostek układających się w pra- woskrętną helisę. Po obu stronach filamentu aktynowego układają się cząsteczki białka regulatorowego, tropomiozy- ny (TM). Długość jednej cząsteczki izoformy TM z mięśni prążkowanych odpowiada siedmiu monomerom aktyny. Możliwość tworzenia liniowych polimerów białka na całej długości filamentów aktynowych wynika z oddziaływań między końcami sąsiadujących cząsteczek TM [6].
Drugie białko regulatorowe filamentu cienkiego, kom- pleks troponiny, jest rozmieszczone na filamencie w regu- larnych odstępach odpowiadających długości pojedynczej cząsteczki TM. Kompleks składa się z trzech podjednostek: troponiny C (TnC) wiążącej Ca 2+, troponiny I (TnI) wykazu- jącej zdolność hamowania oddziaływań akto-miozynowych oraz troponiny T (TnT), która poprzez wiązanie z TM zako- twicza cały kompleks na filamencie cienkim (Ryc. 1) [7,8]. Ponieważ w mięśniach szkieletowych aktywacja oddziały- wań aktyny z miozyną jest wyzwalana przez przyłączanie Ca 2+^ do kompleksu Tn, wyjaśnienie mechanizmu regulacji wymaga bardziej szczegółowego omówienia budowy tego białka.
STRUKTURA TROPONINY
Największą podjednostką całego kompleksu Tn jest TnT. Białko to odgrywa główną rolę w łączeniu wszystkich pod-
Rycina 1. Schemat budowy filamentu cienkiego mięśni poprzecznie prążko- wanych. Każdy z dwóch łańcuchów złożonych z podjednostek aktynowych (1) wiąże cząsteczki tropomiozyny (2) oraz kompleks troponiny, zbudowany z tro- poniny C (3), troponiny I (5) oraz troponiny T złożonej z dwóch funkcjonalnych domen, TnT1 (4b) i TnT2 (4a). Na podstawie [25]; zmodyfikowano.
440 www.postepybiochemii.pl
łącznika oraz rejonu inhibitorowego, które są słabiej ustruk- turyzowane niż ich szkieletowe odpowiedniki [16]. Cechą charakterystyczną sercowej TnI jest obecność złożonego z 27-33 reszt aminokwasowych przedłużenia na końcu N, które podlega fosforylacji. Te strukturalne różnice spra- wiają, że sercowa izoforma Tn wykazuje niższą wrażliwość na jony wapnia, dodatkowo osłabianą przez fosforylację N-końcowego przedłużenia TnI przez kinazy zależne od cAMP [24].
MECHANIZM REGULACJI ODDZIAŁYWAŃ AKTOMIOZYNOWYCH PRZEZ TROPOMIOZYNĘ I KOMPLEKS TROPONINY
W cienkim filamencie jeden kompleks Tn jest związa- ny z jedną cząsteczką TM, dzięki której może kontrolować przynajmniej siedem podjednostek aktyny sąsiadujących wzdłuż filamentu [8,24,25]. W stanie relaksacji (małe stę- żenie jonów wapnia) Tn utrzymuje TM w pozycji, w któ- rej blokuje ona w aktynie większość miejsc oddziaływania z miozyną. Przy małych stężeniach jonów wapnia segment inhibitorowy i domena C-końcowa TnI są związane z akty- ną. Rejon inhibitorowy TnI działa jak haczyk, który utrzy- muje białka regulatorowe w pozycji hamującej oddziaływa- nia aktyny z miozyną. To działanie jest wspomagane przez C-końcową domenę TnI, która konkuruje z TM o miejsca wiązania w aktynie i dodatkowo utrzymuje TM w pozycji blokującej [14,15]. Opisane powyżej zmiany konformacyjne w N-końcowej domenie TnC prowadzą do zmiany orienta- cji przełącznika, a w konsekwencji do zerwania kontaktów pomiędzy aktyną i TnI, które są utrzymywane w małych stężeniach Ca 2+. Odsunięcie od aktyny rejonu inhibitorowe- go oraz domeny C-końcowej TnI daje tropomiozynie więk- szą swobodę ruchu, dzięki czemu może się ona przesuwać i odsłaniać miejsca wiązania główek miozyny.
Dodatkowy mechanizm regulacji z udziałem Ca2+^ wy- kryto w mięśniach wprawiających w ruch skrzydła u musz- ki owocowej. W tym typie mięśni ekspresji ulega gen kodu- jący izoformę TnT, zawierającą, zbudowane z ok. 136 reszt aminokwasowych, C-końcowe przedłużenie bogate w resz- ty kwasu glutaminowego, które może bezpośrednio wiązać jony wapnia [26]. TnT w całości rozciąga się wzdłuż TM, przez co zwiększa sztywność łańcuchów tropomiozyno- wych. Przypuszcza się, że wiązanie Ca2+^ do TnT może wy- dajnie przyczyniać się do zwiększenia rytmicznej aktywacji filamentów aktynowych [27].
Dzięki tropomiozynie zmiany konformacyjne w obrębie cienkiego filamentu mają charakter allosteryczny i koopera- tywny [28]. Oznacza to, że informacje o zmianach konfor- macyjnych zachodzących w rejonie filamentu bezpośrednio oddziałującym z troponiną, są przenoszone wzdłuż filamen- tu. W mięśniach szkieletowych wielkość jednostki regulato- rowej, pozostającej pod wpływem jednego kompleksu Tn obejmuje 1,5-3 cząsteczki tropomiozyny i związane z nimi podjednostki aktyny. Dzięki temu cały filament odpowiada na sygnał zewnętrzny w sposób zintegrowany [25,28].
Cząsteczka aktyny jest czynnie zaangażowana w ten pro- ces, a oddziaływania pewnych rejonów aktyny z TM oraz z TnI determinują wrażliwość filamentu na aktywujące stęże-
nia jonów wapnia oraz siłę aktywacji ATPazy miozynowej przez cienki filament [18,29-31]. Zatem, subtelne oddziały- wania pomiędzy wszystkimi białkami filamentu cienkiego są kluczowe dla precyzyjnej regulacji skurczu. Zaburzenia w tych oddziaływaniach, wynikające na przykład z defek- tów strukturalnych powstałych na skutek mutacji w genach kodujących białka cienkiego filamentu, bardzo często są przyczyną poważnych, nieuleczalnych chorób serca i ukła- du ruchu [32-34].
ROLA KALDESMONU W REGULACJI ODDZIAŁYWAŃ AKTYNY Z MIOZYNĄ
Kaldesmon jest białkiem regulatorowym związanym z fi- lamentami aktynowymi, którego gen ulega ekspresji w mię- śniach gładkich oraz komórkach niemięśniowych. Regulu- jąc oddziaływania aktyny i miozyny CaD kontroluje skurcz i napięcie mięśni gładkich, ruchliwość komórkową, czas i szybkość cytokinezy [35,36].
U kręgowców CaD jest kodowany przez pojedynczy gen, z którego na drodze alternatywnego składania eks- onów powstają dwie izoformy tego białka. Izoforma o dużej masie cząsteczkowej (h-CaD) występuje tylko w ko- mórkach mięśni gładkich, natomiast izoforma krótsza, o mniejszej masie cząsteczkowej (l-CaD) występuje zarówno w mięśniach gładkich, jak i w komórkach niemięśniowych. Obie izoformy CaD mają prawie identyczną strukturę re- jonów C- i N-końcowych, natomiast różnią się helikalnym rejonem zbudowanym z ok. 160 reszt aminokwasowych, położonym w centralnej części cząsteczki, który jest usu- wany z l-CaD na etapie potranskrypcyjnej obróbki mRNA [36-38]. Uważa się, że h-CaD jest składnikiem aparatu kurczliwego, podczas gdy l-CaD wiąże filamenty aktyno- we budujące cytoszkielet [39]. Badania nad ekspresją ge- nów izoform CaD w komórkach mięśni gładkich myszy transgenicznych wykazały, że kontrolowane zmniejszenie ekspresji genu h-CaD jest częściowo rekompensowane przez zwiększenie ekspresji genu l-CaD [40].
CaD może jednocześnie wiązać kilka białkowych ligan- dów — aktynę, TM, miozynę i CaM/Ca 2+^ (Ryc. 3). Skom- plikowany wzór oddziaływań między białkami jest możli- wy dzięki wielodomenowej strukturze CaD, w której wy- różnia się trzy funkcjonalne rejony: domenę N-końcową, domenę C-końcową oraz domenę łącznikową. Centralna domena łącznikowa rozdziela oba końce, które przybierają formę globularną. To sprawia, że cała cząsteczka kształtem przypomina ciężarek do ćwiczeń [41]. Obecność długiego elementu łącznikowego w h-CaD pozwala na jednoczesne wiązanie CaD z filamentem aktynowym oraz oddziaływa- nia z filamentem miozynowym.
Mechanizm oddziaływania CaD z aktyną jest złożony. W domenie C-końcowej zlokalizowano dwa rejony oddziały- wania z aktyną (Ryc. 3). Rejon położony bliżej środka czą- steczki wykazuje wysokie powinowactwo do aktyny. Drugi rejon, umieszczony na końcu C kaldesmonu, wiąże się z ak- tyną z niższym powinowactwem, ale zapewnia hamowanie ATPazy aktomiozynowej. Badania strukturalne ujawniły, że C-końcowa domena zawiera liczne zagięcia b, które na- dają jej dużą konformacyjną elastyczność [42]. Badania z za-
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 441
stosowaniem metody trójwymiarowych rekonstrukcji obra- zów uzyskanych w mikroskopie elektronowym wykazały, że C-końcowa domena CaD przyłącza się do zewnętrznej krawędzi filamentu i spina dwie podjednostki, wchodzące w skład sąsiednich protofilamentów [43].
W C-końcowej domenie CaD znajduje się również miej- sce wiązania tropomiozyny. Oddziaływania pomiędzy tymi białkami mają działanie synergistyczne. Z jednej strony, TM zwiększa powinowactwo CaD do aktyny i potęguje ha- mowanie ATPazy aktomiozynowej. Z drugiej strony, CaD wpływa na położenie TM na filamencie blokując przesu- nięcie TM na powierzchni filamentu aktynowego, przez co wzmacnia hamowanie oddziaływań aktyny z miozyną [44].
Dodatkowe miejsca oddziałujące z aktyną znajdują się w domenie N-końcowej CaD [45]. Wiązanie przeciwległych końców CaD z aktyną umożliwia boczne przyleganie tego białka do filamentu. Jednak nie jest do końca jasne, czy ten rejon jest na stałe związany z aktyną, gdyż końcu amino- wym znajduje się główne miejsce oddziaływania CaD z miozyną. Przyłączenie CaD do filamentu miozynowego po- woduje zrywanie połączenia pomiędzy końcem aminowym kaldesmonu a aktyną [37].
Aktywność hamująca CaD została zlokalizowana w C-końcowym rejonie, obejmującym około 30 reszt ami- nokwasowych [46]. Odsunięcie tego rejonu od aktyny jest indukowane przez bezpośrednie wiązanie CaM/ Ca 2+^ i prowadzi do aktywacji ATPazy aktomiozynowej [35,37,38,47]. W C-końcowej domenie CaD znajdują się dwa miejsca wiązania CaM/Ca 2+^ , określane jako miej- sca A i B (Ryc. 3), które wspólnie wiążą jedną cząsteczkę CaM/Ca 2+^ tworząc przeciwrównoległy kompleks. CaM/ Ca 2+^ współzawodniczy z aktyną o CaD powodując czę- ściowe oddysocjowanie CaD z filamentu. Ten proces odwraca hamujące działanie kaldesmonu [35,37]. Taki mechanizm znoszenia inhibitorowej aktywności CaD był kwestionowany. Zauważono bowiem, że CaM/Ca 2+^ wy- kazuje niezbyt silne powinowactwo do CaD, co sprawia, że białka silnie wiążące CaM/Ca 2+^ mogą skutecznie kon- kurować z CaD o kalmodulinę [48-50]. Jednak zwolenni- cy udziału CaM/Ca 2+^ w procesie regulacji argumentują, że poziom CaM może lokalnie wzrastać i być wystarcza- jący dla utworzenia kompleksu z CaD i odwrócenia ha- mowania oddziaływań aktyny z miozyną [51-52].
Dodatkowym mechanizmem kontroli ak- tywności ATPazy aktomiozynowej jest fosfo- rylacja reszt seryny znajdujących się w pobliżu rejonów wiążących aktynę w C-końcowej do- menie CaD (Ryc. 3). Fosforylacja, której ulega zarówno izoforma h-CaD, jak i jej niemięśniowy odpowiednik l-CaD, jest katalizowana przez liczne kinazy białkowe, poprzez które regulacja filamentu aktynowego jest powiązana z róż- norodnymi drogami sygnalizacji wewnątrzko- mórkowej [53]. Wspomniane wyżej trójwymia- rowe rekonstrukcje obrazów mikroskopowych pozwoliły na stwierdzenie, że fosforylacja CaD prowadzi do częściowej dysocjacji C-końcowej domeny CaD od aktyny. W formie ufosforylo- wanej zrywane jest połączenie z jedną z pod- jednostek aktyny, które jest utrzymywane poprzez miejsce o słabym powinowactwie, natomiast miejsce o wysokim powinowactwie do aktyny jest w stanie wiązać CaD do fi- lamentu niezależnie od fosforylacji [38,43]. Wiele doświad- czeń sugeruje bezpośrednią korelację pomiędzy aktywno- ścią ruchową komórek a poziomem ufosforylowania CaD, jednak istnieją dane wskazujące, że skurcz niektórych mię- śni gładkich zachodzi nawet po zahamowaniu aktywności kinaz fosforylujących CaD [54], co świadczy o istnieniu al- ternatywnych dróg aktywacji w różnych typach komórek.
Molekularny mechanizm regulacji przez CaD oddziały- wań pomiędzy aktyną i miozyną wciąż jest tematem dys- kusji. Prosty model sterycznego blokowania przez CaD i tropomiozynę miejsc oddziaływania aktyny z miozyną zo- stał odrzucony, gdyż jednoczesne wiązanie CaD i główek miozyny (S1-ADP-Pi) do kompleksu aktyny z tropomiozy- ną wzajemnie się nie wykluczają [55]. W świetle nowszych badań bardziej prawdopodobny wydaje się model alloste- ryczno-kooperatywny, według którego wiązanie CaM/Ca 2+ (i/lub fosforylacja CaD) wyzwala szereg zmian konforma- cyjnych prowadzących do przełączenia całego filamentu ze stanu OFF, w którym aktyna nie aktywuje ATPazy miozy- nowej, do stanu ON, w którym ATPaza osiąga poziom dużo wyższy niż poziom obserwowany dla aktyny pozbawionej białek regulatorowych. Stany OFF i ON charakteryzują się wysokim powinowactwem odpowiednio do samego CaD i do CaD związanego z CaM/Ca 2+^ [56], zatem CaD można uznać za przełącznik, który w zależności od poziomu jonów wapnia stabilizuje jeden ze stanów aktywacji filamentu.
JONY WAPNIA A ODDZIAŁYWANIE MIOZYNY Z AKTYNĄ
Od ponad siedmiu dekad wiadomo, że oddziaływanie miozyny z aktyną sprzężone z hydrolizą ATP generuje skurcz mięśni poprzecznie prążkowanych, a blisko cztery dekady temu pojawiły się doniesienia, że podobny mecha- nizm generacji ruchu wykorzystywany jest przez izofor- my niemięśniowe konwencjonalnej miozyny Wówczas też zaczęły się ukazywać doniesienia o istnieniu nietypowych miozyn, niezdolnych do tworzenia filamentów; zwanych obecnie miozynami niekonwencjonalnymi. Oddziaływanie miozyn niekonwencjonalnych z aktyną jest wykorzysty- wane podczas transportu wewnątrzkomórkowego cząstek,
Rycina 3. Schemat domenowej struktury kaldesmonu. Strzałki pionowe wskazują rejony oddzia- ływań kaldesmonu z białkami bezpośrednio biorącymi udział w skurczu (aktyna, miozyna) i biał- kami regulatorowymi (tropomiozyna, CaM). Centralny rejon zawierający powtórzenia przeciwnie naładowanych reszt aminokwasowych (Glu i Lys/Arg) występuje tylko w izoformie h-CaD. Na podstawie [37,38]; zmodyfikowano.
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 443
przez trzy geny: MYLK1 ulegający ekspresji w mięśniach gładkich oraz w komórkach niemięśniowych, MYLK2 z mięśni szkieletowych oraz MYLK3 wyrażany w mięśniu sercowym [59,60]. Co ciekawe, MYLK1 koduje również inne białko, telokinę, zwaną białkiem pokrewnym kinazie (KRP, ang. kinase related protein ), które również jest zaangażowane w regulację aktywności miozyny z mięśni gładkich. Jest to możliwe dzięki alternatywnemu wyborowi miejsca inicja- cji transkrypcji podczas składania eksonów MYLK1 [61]. Najwięcej wiadomo o strukturze i mechanizmach działa- nia produktu genu MYLK1 [58]. Domenowa budowa pro- duktów tego genu jest zilustrowana na rycinie 6b. MLCK występująca w komórkach niemięśniowych jest dłuższa od jej mięśniowego odpowiednika o zbudowany z 900 reszt aminokwasowych N-końcowy segment, w którym znajduje się miejsce wiązania aktyny i CaM. Oddziaływania z CaM osłabiają wiązanie tego rejonu do filamentu aktynowego. Główne oddziaływania z aktyną zachodzą przy udziale domeny, która w izoformie niemięśniowej jest położona w środku sekwencji białka, natomiast w krótkiej izoformie mięśniowej na końcu N. Domena katalityczna i domena wiążąca CaM mieszczą się obok siebie w centralnej części cząsteczki. Koniec C zajmuje telokina, która bierze udział w oddziaływaniu z miozyną. Rola dwóch domen — sekwen- cji bogatej w prolinę i domeny fibronektynowej nie została jeszcze określona [58]. Substraty wiązane przez domenę ka- talityczną to ATP i N-końcowy odcinek RLC, który zawiera poddawaną fosforylacji resztę Ser19. MLCK jest zdolna do oddziaływania zarówno z monomerami, jak i filamentami miozyny. Wiązanie poprzez domenę telokinową zachodzi w sąsiedztwie RLC, w rejonie połączenia pomiędzy główką a pałeczką [58]. Dzięki wielodomenowej strukturze MLCK jest związana z aparatem skurczu mięśni i włóknami na- prężeniowymi komórek niemięśniowych zarówno poprzez filament cienki, jak i filament gruby. Ten bliski kontakt za- pewnia natychmiastową dostępność enzymu regulatorowe- go w momencie aktywacji komórki przez jony wapnia.
Aktywacja MLCK zachodzi poprzez przyłączenie czą- steczki CaM związanej z jonami wapnia do miejsca wiąza- nia CaM położonego tuż za domeną katalityczną [58]. In vivo, łańcuchy regulujące miozyny są jedynym substratem dla MLCK. Jednak RLC nie ulegają fosforylacji wyłącznie przy udziale MLCK, są one również substratem dla kinazy CaMK zależnej od kalmoduliny i wapnia oraz kinaz białko- wych, których aktywność nie jest bezpośrednio regulowa- na poprzez zmiany stężenia Ca 2+. Wśród nich znajdują się m.in.: kinaza ROCK (zależna od białka Rho), kinaza PAK (zależna od białek Rac1/Cdc42) i kinaza PKA (zależna od cAMP) [62]. Należy nadmienić, że kinazy te obok reszty Ser19 fosforylują również resztę treoninową 18 (Thr18). Jed- noczesna fosforylacja obu reszt aminokwasowych jeszcze bardziej zwiększa aktywność ATPazową miozyny oraz ge- nerację siły, co prowadzi do hiperkurczliwości [63].
W warunkach małego stężenia jonów wapnia MLCK jest zahamowana przez fragment autoinhibitorowy bloku- jący miejsce aktywne. Przyłączenie CaM/Ca 2+^ do MLCK wywołuje zmianę konformacyjną w domenie katalitycznej, prowadzącą do odsunięcia domeny (fragmentu) autoinhibi- torowej, dzięki czemu staje się ono dostępne dla substratu (Ryc. 6A) [58]. Wiązanie to powoduje również osłabienie
oddziaływania domeny telokiny z miozyną, co wydaje się istotne dla dynamiki procesu fosforylacji. Obniżenie stęże- nia jonów wapnia powoduje odłączenie CaM, co prowadzi do inaktywacji kinazy.
Fosfataza lekkiego łańcucha miozyny (MLCP) Defosforylacja reszty serynowej w łańcuchu regulującym zachodzi z udziałem specyficznej fosfatazy, MLCP (ang. myosin light chain phosphatase ), należącej do fosfataz typu 1, występującej w różnych typach mięśni i w komórkach nie- mięśniowych [64,65]. Podobnie jak w przypadku MLCK, najwięcej wiadomo o fosfatazie występującej w mięśniach gładkich (Ryc. 6C). Białko to zbudowane jest z trzech pod- jednostek: z podjednostki katalitycznej, PP1Cd o m.cz. ok. 38 kDa, będącej izoformą d fosfataz typu 1, podjednostki wią- żącej miozynę (MYPT1, ang. myosin phosphatase target ) o m.
Rycina 6. Regulacja fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny. A. Schemat działania kinazy (MLCK) i fosfatazy (MLCP) lekkich łańcuchów miozyny opracowany z wykorzystaniem dostępnych struktur krystalicznych białek zaangażowanych w tym procesie, na podstawie pracy przeglądowej [73]; zmodyfikowano. B. Sche- mat domenowej budowy MLCK, na podstawie [59]. C. Schemat budowy MLCP, na podstawie [65]; zmodyfikowano. Wyjaśnienia skrótów w tekście.
444 www.postepybiochemii.pl
cz. ok. 130 kDa, oraz podjednostki o m. cz. ok. 20 kDa (M20), której funkcja nie została dotychczas poznana [66]. MYPT jest kodowana przez pojedynczy gen, z którego dzięki al- ternatywnemu składaniu eksonów powstaje kilka izoform białka specyficznych tkankowo. Poza MYPT1 istnieją rów- nież geny: MYPT2 , który ulega ekspresji w mięśniach szkie- letowych i mózgu [67] oraz MYPT3 , występujący głównie w mięśniu sercowym, mózgu, nerce, jądrach, wątrobie i w bia- łych adipocytach [68]. MLCP katalizuje defosforylację nie tylko RLC, lecz również innych białek związanych z orga- nizacją cytoszkieletu, np. ezryny/radyksyny/moezyny, tau czy adducyny, co wskazuje, że fosfataza ta bierze udział w szerszym spektrum procesów komórkowych niż wcześniej sądzono [64].
Na końcu aminowym MYPT1 występuje motyw RVXF biorący udział w wiązaniu podjednostki katalitycznej, po którym występuje osiem powtórzeń ankirynowych [65]. Uważa się, że powtórzenia te przyspieszają oddziaływanie fosfatazy z ufosforylowanym RLC oraz oddziałują z pod- jednostką katalityczną wzmacniając jej aktywność enzy- matyczną [66]. Rejon bogaty w ujemnie naładowane reszty kwasu asparaginowego i glutaminowego (D/E) prawdo- podobnie uczestniczy w aktywacji fosfatazy. Z kolei koniec karboksylowy jest odpowiedzialny za wiązanie miozyny. Uważa się obecnie, że wiązanie N-końcowego odcinka MYPT1 z ufosforylowanym RLC jest niezbędne dla procesu defosforylacji, natomiast wiązanie poprzez rejon C-końco- wy ma rolę regulatorową oraz decyduje o komórkowej dys- trybucji fosfatazy [64]. Postuluje się również, że C-końcowy rejon MYPT1 bierze udział w dimeryzacji tej podjednostki, co może prowadzić do utworzenia amfipatycznej α-helisy [64]. W rejonie C-końcowym występują reszty treonino- we 697 i 855, które są substratami dla m.in. kinazy ROCK. Fosforylacja tych reszt prowadzi do zahamowania aktyw- ności MLCP poprzez osłabienie oddziaływania z miozyną [65]. Inaktywacja fosfatazy prowadzi do aktywacji kinazy MLCK, zależnej kompleksu CaM/Ca2+, uwrażliwiając w ten sposób aktomiozynę na jony Ca2+^ (Ryc. 6A). Równowaga pomiędzy aktywnością MLCK i MLCP zapewnia prawidło- we funkcjonowanie całego organizmu, a zwłaszcza układu sercowo-naczyniowego.
Wpływ fosforylacji lekkiego łańcucha miozyny na konformację i aktywność miozyny
Monomery miozyny z mięśni gładkich oraz miozyn nie- mięśniowych, w których łańcuch lekki RLC nie jest ufosfo- rylowany przyjmują zwiniętą konformację (10S), natomiast fosforylacja powoduje wyprostowanie monomeru (przej- ściowa konformacja 6S), co umożliwia utworzenie filamen- tu miozynowego (Ryc. 5A). W konformacji 10S pałeczka miozyny, dzięki obecności giętkich rejonów (tzw. zawia- sów), owija się w charakterystyczny sposób wokół rejonu połączenia szyjki z pałeczką, uniemożliwiając w ten sposób oddziaływanie miozyny z aktyną. Zarówno w konforma- cji 10S, jak i w nieufosforylowanej miozynie w filamencie, w aparacie skurczu dochodzi do wzajemnego blokowania główek w ten sposób, że miejsce wiązania aktyny w jednej z główek oddziałuje z konwerterem drugiej z główek (Ryc. 5B) [69]. Konwerter jest rejonem główki przekazującym zmiany konformacyjne zachodzące w domenie motorycznej na helikalny odcinek łańcucha ciężkiego przechodzący na-
stępnie w szyjkę. Takie wzajemne ułożenie główek w czą- steczce miozyny blokuje aktywność enzymatyczną miozy- ny, co sprawia, że generowanie przez nią siły niezbędnej do cyklicznego oddziaływania z aktyną jest zahamowane [70]. Fosforylacja przynajmniej jednego łańcucha w cząsteczce miozyny powoduje rotację o około 70º rejonu konwertera w zablokowanej główce, co prowadzi do uwolnienia obu głó- wek i umożliwia im wiązanie aktyny oraz hydrolizę ATP (Ryc. 5B) [69,71]. Fosforylacja Ser19 zwiększa ujemny ładu- nek w płacie N-końcowym RLC, a to umożliwia przekazy- wanie zmian konformacyjnych do płata C-końcowego i na- daje odpowiednią orientację RLC w stosunku do łańcucha ciężkiego (Ryc. 5C). W nieufosforylowanym RLC tworzony jest mostek solny pomiędzy resztami Arg4 (i/lub innymi pozytywnie naładowanymi resztami w tym rejonie łańcu- cha), a Asp100 i/lub Glu99 w płacie C-końcowym. Dzięki temu rejon N-końcowy RLC znajduje się zarówno w pobli- żu płata C-końcowego, jak i łańcucha ciężkiego w rejonie szyjki; taka konformacja nosi nazwę zamkniętej. Po fosfo- rylacji mostek solny ulega zerwaniu, co powoduje zmianę konformacji rejonu N-końcowego (staje się bardziej giętki) oraz zmianę ułożenia obu tych domen łańcucha względem łańcucha ciężkiego. Zwłaszcza N-końcowy segment zawie- rający ufosforylowaną resztę Ser19 jest bardziej oddalony od łańcucha ciężkiego i płata C-końcowego; taka konforma- cja nosi nazwę otwartej [72]. Izoformy MLCK oraz MLCP występują również w mię- śniach porzecznie prążkowanych. Zatem, należałoby się spo- dziewać, że podobny mechanizm regulacji oddziaływania aktyny z miozyną poprzez fosforylację RLC jest wykorzysty- wany również w tych typach mięśni [73,74]. Badania bioche- miczne z lat 80. ubiegłego wieku wykazały jednakże, że mio- zyny z mięśni poprzecznie prążkowanych wykazują aktyw- ność enzymatyczną niezależnie od stanu ufosforylowania ich łańcuchów regulujących [75]. Skoro natura wyprodukowała podobną do występującej w mięśniach gładkich kaskadę en- zymów, jaka jest więc fizjologiczna rola tej modyfikacji?
Wiele danych wskazuje na to, że odwracalna fosforylacja skRLC ma funkcje modulujące działanie mięśni szkieleto- wych, gdyż uwrażliwia miozynę na jony wapnia przesuwa- jąc wrażliwość mięśnia w kierunku suboptymalnych stężeń Ca 2+. To powoduje przyspieszenie kinetyki procesu genero- wania siły podczas inicjacji skurczu oraz obniżenie szybko- ści relaksacji włókien przy wyższych stężeniach Ca2+^ [73].
Niewiele wiadomo o strukturze i funkcji kinazy lekkich łańcuchów miozyny, cMLCK (m. cz. ok. 100 kDa) występu- jącej w mięśniu sercowym, działającej w sposób odmien- ny niż izoformy szkieletowa i niemięśniowa [60]. Chociaż pierwsze doniesienia na temat funkcjonowania tej izoformy MLCK wskazywały, że działa ona w sposób zależny od Ca 2+ i kalmoduliny [76], to z uwagi na brak jednoznacznych do- wodów na obecność domeny wiążącej CaM, ten mechanizm aktywacji jest wciąż przedmiotem dyskusji [60,77]. Aktywa- cja cMLCK jest prawdopodobnie zależna od receptorów α- i β-adrenergicznych, gdyż stymulacja tych receptorów pod- wyższa poziom fosforylacji cRLC [74].
Defosforylacja cRLC zachodzi z udziałem fosfatazy cMLCP zawierającej podjednostkę MYPT2; zablokowanie genu ko-
446 www.postepybiochemii.pl
rąbka szczoteczkowego kosmków jelitowych (Myo1b) wyka- zały, że jest ona regulowana przez jony wapnia, poprzez CaM. W obecności 2–3 μM Ca2+^ dochodzi do oddysocjowania jednej z czterech cząsteczek CaM, co prowadzi do wzrostu aktywno- ści ATPazy aktynowej oraz obniżenia zdolności do przesuwa- nia filamentów aktynowych, co może być skutkiem odłączenia w tych warunkach cząsteczki miozyny od filamentu aktyno- wego [83,84]. Zjawisko to nie było obserwowano przy niższym stężeniu Ca2+^ lub nadmiarze egzogennej kalmoduliny. Jony wapnia zmniejszają również wrażliwość tej miozyny na naprę- żenia [85]. W przypadku innej izoformy, Myo1C, zawierającej cztery motywy IQ wykazano, że tylko trzy pierwsze z nich są zaangażowane w wiązanie CaM, a w regulacji aktywności tej miozyny poprzez jony wapnia uczestniczy CaM związana z pierwszym motywem IQ, położonym najbliżej domeny mo- torycznej [86,87]. Oddziaływanie izoform miozyny I z aktyną jest również regulowane poprzez fosforylację reszt seryny lub treoniny w łańcuchu ciężkim. Temu zagadnieniu poświęcona jest kolejna część niniejszego artykułu.
Miozyna III , niezbędna w procesie fototransdukcji, w swo- im łańcuchu ciężkim zawiera domenę o aktywności kinazy serynowo-treoninowej, poprzedzającą klasyczną domenę mo- toryczną, po której znajdują się dwa wiążące CaM motywy IQ. Międzycząsteczkowa autofosforylacja domeny kinazowej powoduje obniżenie aktywności ATPazowej miozyny i jej powinowactwa do aktyny, natomiast zahamowanie aktyw- ności kinazy nie wpływa na aktywność ATPazową, ale zabu- rza aktywność motoryczną białka [88]. Stwierdzono także, że miozyna III w sposób zależny od Ca2+^ i kalmoduliny hamuje aktywność metarodopsyny, białka zaangażowanego w proces fototransdukcji [89]. Uważa się, że miozyna III stanowi swoje- go rodzaju ruchomy rezerwuar kalmoduliny, gdyż CaM/Ca2+ po oddysocjowaniu od łańcucha ciężkiego może być wykorzy- stywana przez metarodopsynę i inne białka [90].
Miozyna V jest złożona z dwóch łańcuchów ciężkich, któ- re dimeryzują w C-końcowej części cząsteczki, i sześciu par łańcuchów lekkich, z czego cztery pary to cząsteczki kalmo- duliny, a dwie to łańcuchy istotne miozyn konwencjonalnych. Jest to typowa miozyna transportująca, progresywna, co ozna- cza, że pozostaje ona w kontakcie z filamentami aktynowymi podczas kilku cykli hydrolizy ATP w główce miozyny. Prze- noszone przez miozynę V organelle i pęcherzyki łączą się z domeną cargo, która znajduje się w C-końcowej części białka [91]. Pod nieobecność jonów wapnia cząsteczki kalmoduliny są związane z łańcuchem ciężkim, a miozyna przyjmuje kon- formację zwiniętą, w której domena motoryczna oddziałuje z domeną cargo. To powoduje, że miozyna nie jest zdolna do hydrolizy ATP i wiązania aktyny. W obecności 1 μM Ca2+^ do- chodzi do zmian konformacyjnych w cząsteczkach kalmodu- liny, następuje dysocjacja kalmoduliny związanej z drugim motywem IQ, co wywołuje zmiany konformacyjne w szyjce, które są przekazywane do domeny motorycznej [92]. Zmiany konformacyjne zachodzą również w cząsteczkach kalmodu- liny związanych z motywami IQ1, IQ3 i IQ5 [93]. Zmiany te są odpowiedzialne za wyprostowanie się cząsteczki miozyny, co prowadzi do wzrostu jej aktywności ATPazowej [91]. Do aktywacji zależnej od aktyny aktywności ATPazowej miozyny V wymagane są mikromolowe stężenia jonów wapnia. W ma- łych stężeniach Ca2+^ oddziaływanie miozyny z aktyną jest bar- dzo słabe, nawet w dużym nadmiarze aktyny [91]. Jednakże w
obecności jonów wapnia dochodzi również do oddysocjowa- nia miozyny od filamentu aktynowego i w konsekwencji do zahamowania jej ruchu [94]. Nie znamy jeszcze mechanizmu tej paradoksalnej obserwacji. Miozyna VI jest jedyną z dotychczas poznanych miozyn, która się porusza w kierunku końca ostrego (ang. pointed end ) filamentu aktynowego, co jest możliwe dzięki obecności w rejonie konwertera wstawki złożonej z 53 reszt aminokwa- sowych, która stanowi również niekonwencjonalne miejsce wiązania kalmoduliny [95]. W szyjce natomiast znajduje się klasyczny motyw IQ, również wiążący kalmodulinę. Uwa- ża się, że cząsteczka kalmoduliny znajdująca się we wstaw- ce pełni rolę strukturalną, istotną podczas generacji ruchu, podczas gdy kalmodulina w szyjce może być zaangażowa- na w regulację aktywności miozyny VI poprzez jony wap- nia [96]. Wykazano, że obecność tych jonów prowadzi do spowolnienia ruchu miozyny VI wzdłuż filamentów akty- nowych, nie wpływając w znaczący sposób na jej aktywność ATPazową i uwalnianie ADP [97,98]. Wprawdzie wiązanie kalmoduliny do całej cząsteczki miozyny VI nie jest zależne od Ca2+, zachodzi bowiem nawet przy 100 μM stężeniu tych jonów, wykazano jednak, że w obecności jonów wapnia kal- modulina wiąże się z dużo większym powinowactwem do rejonu wstawki, z jednoczesnym osłabieniem wiązania tej cząsteczki związanej z szyjką. Nie dochodzi jednak do jej oddysocjowania, jak to ma miejsce w przypadku miozyny I i V [95]. Uważa się, że zmiany konformacyjne zachodzące w cząsteczce kalmoduliny są „wyczuwane” przez dome- nę motoryczną, nie wyklucza się również, że te zmiany są przekazywane na filament aktynowy i allosterycznie modu- lują sztywność filamentu aktynowego [96].
Miozyna VII zawiera w łańcuchu ciężkim pięć motywów IQ, co sugeruje, że potencjalnie może on wiązać nawet pięć cząsteczek kalmoduliny [4]. Wykazano natomiast, że do czą- steczki miozyny VI przyłącza się średnio 3,2 cząsteczki kal- moduliny [99]. Powinowactwo miozyny VII do kalmoduliny maleje w obecności jonów wapnia, co wskazuje na rolę tego oddziaływania w regulacji aktywności miozyny [99]. Bada- nia ostatnich lat wskazują, że miozyny VII występują w ko- mórkach jako monomer, który może przyjmować konforma- cję otwartą i zwiniętą, w której koniec karboksylowy ogonka oddziałuje z domeną motoryczną. Wyniki badań wskazują na to, że ogonek bierze udział w regulacji aktywności ATPa- zowej. Aktywność fragmentu pozbawionego ogonka maleje, gdy ogonek jest dodawany w obecności małego stężenia Ca2+ (pCa7), natomiast nie ulega zmianie gdy ogonek jest doda- wany w wysokich (pCa4) stężeniach Ca2+^ [91]. Sądzi się, że w małych stężeniach jonów wapnia również in vivo dochodzi do oddziaływania główki z ogonkiem, co prowadzi do inak- tywacji miozyny.
Miozyna IX to unikalna miozyna niekonwencjonalna, zawierająca w ogonku domeny wiążące jony cynku oraz aktywną domenę RhoGAP, która uczestniczy w wymianie GTP na GDP w małych GTPazach z rodziny Rho, wpływa- jąc na dynamikę cytoszkieletu aktynowego [90]. W główce, w rejonie miejsca oddziaływania z aktyną, zidentyfikowano długą wstawkę (ok. 150 reszt aminokwasowych), wspoma- gającą wiązanie z aktyną i zapewniającą tej monomerycznej miozynie ruch procesywny. W szyjce występują cztery mo-
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 447
tywy IQ, a dodatkowe miejsce wiązania CaM wykryto w re- jonie wspomnianej wyżej wstawki. Badania wykazały, że w obecności jonów wapnia CaM związana w główce miozyny pełni funkcje regulujące aktywność enzymatyczną miozy- ny, natomiast cząsteczki CaM związane w szyjce wydają się ważne w generowaniu ruchu [100].
Miozyna X , izoforma występująca głównie na zakoń- czeniach wypustek komórkowych (filopodiach), zawiera w łańcuchu ciężkim trzy motywy IQ [101]. Wykazano, że wią- zanie CaM nie jest czynnikiem determinującym generowa- nie ruchu przez tę miozynę. Odkryto także, że z motywem IQ3 miozyny X człowieka oddziałuje białko CLP (ang. cal- modulin-like protein ), które jest produkowane w komórkach nabłonkowych, a obniżenie jego syntezy obserwuje się w niektórych nowotworach [102]. Oddziaływanie to jest za- leżne od stężenia Ca2+^ i prawdopodobnie jest bardziej spe- cyficzne niż w przypadku CaM. CaM i CLP z podobnym powinowactwem oddziałują z motywami IQ1 i IQ2 [103]. Wykazano również, że wiązanie CLP determinuje obecność miozyny X na końcach filopodiów [104].
FOSFORYLACJA CIĘŻKIEGO ŁAŃCUCHA MIOZYNY
Aktywność niektórych miozyn, zwłaszcza niekonwen- cjonalnych, jest również regulowana poprzez fosforylację reszt serynowych lub treoninowych w ciężkim łańcuchu miozyny. Fosforylację obserwuje się głównie w dwóch rejo- nach łańcucha ciężkiego, w domenie motorycznej, w pobli- żu miejsca oddziaływania z aktyną oraz w pałeczce/ogon- ku, z reguły na końcu karboksylowym łańcucha. Niektóre konwencjonalne miozyny niemięśniowe (NMII) „wykorzy- stują” do regulacji swojej aktywności fosforylację lekkich łańcuchów regulujących oraz fosforylację w C-końcowym odcinku łańcucha ciężkiego [105].
Fosforylacja w domenie motorycznej
Dotychczas wykryto fosforylację w domenie motorycz- nej izoform miozyny I oraz w miozynie VI. W przypadku miozyn I jest to podstawowy mechanizm aktywacji ATPazy aktomiozynowej przesuwania filamentów aktynowych, na- tomiast nie wykazano, aby fosforylacja reszty Thr406 miała znaczący wpływ na oddziaływanie miozyny VI kręgowców z aktyną [98,105].
Fosforylacja miozyn I zachodzi głównie przy udziale ki- naz z rodziny PAK, aktywowanych przez Cdc42 i Rac1. W przypadku miozyny IC z Acanthamoeba castellanii fosforylo- wana jest reszta Ser311, znajdująca się w miejscu wiązania aktyny. Nota bene, w odpowiadającym tej serynie resztom łańcucha ciężkiego miozyn z mięśni poprzecznie prążkowa- nych, np. reszcie 411 miozyny z mięśni szkieletowych kury znajduje się kwas asparaginowy, co wskazuje, że natura na stałe dodała kwaśny ładunek, czyniąc te miozyny konstytu- tywnie aktywne [105]. Nie wykazano, aby fosforylacja reszt znajdujących się w domenie motorycznej miozyn I kręgow- ców miała bezpośredni związek z jonami wapnia, natomiast amebowe izoformy kinazy PAK są hamowane poprzez wiązanie kalmoduliny i Ca2+, co niewątpliwie wpływa na aktywność miozyny I z A. castellanii i amebowej formy ślu- zowca Dictyostelium discoideum [106].
Fosforylacja w pałeczce/ogonku miozyny Większość niemięśniowych miozyn konwencjonalnych po- siada dwa mechanizmy regulacji ich aktywności, są to fosfory- lacja łańcuchów lekkich aktywująca oddziaływanie miozyn z aktyną oraz fosforylacja reszt serynowych lub treoninowych w C-końcowym odcinku pałeczki, prowadząca do inaktywacji miozyn [105]. W najlepiej poznanym przypadku miozyny II ze śluzowca, D. discoideum , fosforylacja trzech reszt treoninowych poprzez specyficzną kinazę ciężkich łańcuchów miozyny po- woduje zagięcie pałeczki w rejonie zawiasu, co uniemożliwia tworzenie bipolarnych filamentów [107]. Brak jednak dowo- dów na zaangażowanie w tym procesie jonów wapnia [108].
W dwóch izoformach miozyn niemięśniowych występują- cych u ssaków (NMIIA i NMIIB) również dochodzi do fosfo- rylacji reszty Ser 1917 m.in. przez kinazę PKC lub kinazę kaze- inową II znajdującą się w C-końcowym odcinku tych miozyn [105]. Natomiast w obecności jonów wapnia do tego rejonu cząsteczki przyłączają się cząsteczki białka Mts1, należącego do białek wiążących Ca2+^ z rodziny S100. Synteza Mts1 (wg klasyfikacji białek S100 to S100A4) jest znacznie zwiększona w komórkach nowotworowych, białko to bowiem odgrywa ważną rolę w procesie powstawania przerzutów. Przyłącze- nie MtS1 uniemożliwia fosforylację pałeczki, powoduje jednak podobne skutki; destabilizuje w obecności jonów wapnia fi- lamenty i hamuje aktywność ATPazową aktomiozyny [109]. Mechanizm ten jest szczególnie istotny dla regulacji stabilności filamentów złożonych z NMIIA, która występuje głównie w strefie podbłonowej [110].
NMIIA jest również fosforylowana przez TRPM7, kanał jonowy biorący udział w homeostazie jonów magnezu, któ- rego integralną częścią jest kinaza białkowa alfa. Obniżenie poziomu tego białka prowadzi również do podwyższenia wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+. Wykazano, że ki- naza fosforyluje w sposób zależny od jonów wapnia reszty Thr1800, Ser1803 i 1808, co obniża zdolność tej miozyny do tworzenia filamentów [111].
Wykryto również fosforylację reszt serynowych i treonino- wych w ogonkach miozyn niekonwencjonalnych, miozyny III, V, VI i VII, ale z wyjątkiem miozyny V ich fosforylacja nie ma powiązania z jonami wapnia i oddziaływaniem tych miozyn z aktyną. Uzyskane dotychczas dane wskazują, że fosforylacja miozyn niekonwencjonalnych reguluje przyłączanie do nich ładunku (cargo) [91,112]. Natomiast podczas otrzymywania miozyny VA z mózgu okazało się, że wraz z nią oczyszcza się kinaza II zależna od jonów wapnia i CaM, która będąc związa- na z ogonkiem miozyny fosforyluje resztę Ser1650 w łańcuchu ciężkim miozyny, znajdującą się w środkowej części ogonka. Co ciekawe, okazało się iż związanie miozyny aktywuję tę ki- nazę, a niezbędna do aktywacji cząsteczka CaM jest uwalniana w obecności Ca2+^ z rejonu szyjki miozyny V [113,114]. Fosfo- rylacja reszty Ser1650 warunkuje uwalnianie przez miozynę ładunku oraz jest niezbędna do translokacji tego motoru mole- kularnego do jądra komórkowego [114,115].
PODSUMOWANIE
Oddziaływania aktyny z miozyną, procesy zasilane ener- gią hydrolizy ATP, determinują wiele podstawowych funkcji
Postępy Biochemii 58 (4) 2012 449
- Greaser ML, Gergely J ( 1971 ) Reconstitution of troponin activity from three protein components_._ J Biol Chem 246: 4226-
- Zot AS, Potter JD ( 1987 ) Structural aspects of troponin-tropomyosin regulation of skeletal muscle contraction_._ Annu Rev Biophys Bio- phys Chem 16: 535-
- Ohtsuki I ( 1979 ) Molecular arrangement of troponin-T in the thin fila- ment_._ J Biochem 86: 491-
- Vinogradova MV, Stone DB, Malanina GG, Karatzaferi C, Cooke R, Mendelson RA, Fletterick RJ ( 2005 ) Ca2+-regulated structural chan- ges in troponin_._ Proc Natl Acad Sci USA 102: 5038-
- Vassylyev DG, Takeda S, Wakatsuki S, Maeda K, Maeda Y ( 1998 ) The crystal structure of troponin C in complex with N-terminal fragment of troponin I. The mechanism of how the inhibitory action of tropo- nin I is released by Ca2+-binding to troponin C_._ Adv Exp Med Biol 453: 157-
- Levine BA, Moir AJ, Perry SV ( 1988 ) The interaction of troponin-I with the N-terminal region of actin_._ Eur J Biochem 172: 389-
- Gergely J, Grabarek Z, Tao T ( 1993 ) The molecular switch in troponin C_._ Adv Exp Med Biol 332: 117-
- Galinska-Rakoczy A, Engel P, Xu C, Jung H, Craig R, Tobacman LS, Lehman W ( 2008 ) Structural basis for the regulation of muscle con- traction by troponin and tropomyosin_._ J Mol Biol 379: 929-
- Knowles AC, Irving M, Sun YB ( 2012 ) Conformation of the troponin core complex in the thin filaments of skeletal muscle during relaxa- tion and active contraction_._ J Mol Biol 421: 125-
- Takeda S, Yamashita A, Maeda K, Maeda Y ( 2003 ) Structure of the core domain of human cardiac troponin in the Ca2+-saturated form_._ Nature 424: 35-
- Pirani A, Vinogradova MV, Curmi PM, King WA, Fletterick RJ, Craig R, Tobacman LS, Xu C, Hatch V, Lehman W ( 2006 ) An atomic model of the thin filament in the relaxed and Ca2+-activated states_._ J Mol Biol 357: 707-
- Luo Y, Leszyk J, Li B, Li Z, Gergely J, Tao T ( 2002 ) Troponin-I interacts with the Met47 region of skeletal muscle actin. Implications for the mechanism of thin filament regulation by calcium_._ J Mol Biol 316: 429-
- Kobayashi T, Kobayashi M, Gryczynski Z, Lakowicz JR, Collins JH ( 2000 ) Inhibitory region of troponin I: Ca2+-dependent structural and environmental changes in the troponin-tropomyosin complex and in reconstituted thin filaments_._ Biochemistry (Mosc) 39: 86-
- Li Z, Gergely J, Tao T ( 2001 ) Proximity relationships between residue 117 of rabbit skeletal troponin-I and residues in troponin-C and ac- tin_._ Biophys J 81: 321-
- Sun YB, Brandmeier B, Irving M ( 2006 ) Structural changes in troponin in response to Ca2+^ and myosin binding to thin filaments during acti- vation of skeletal muscle_._ Proc Natl Acad Sci USA 103: 17771-
- Van Eerd JP, Takahashi K ( 1975 ) The amino acid sequence of bovine cardiac tamponin-C. Comparison with rabbit skeletal troponin-C_._ Biochem Biophys Res Commun 64: 122-
- Slupsky CM, Sykes BD ( 1995 ) NMR solution structure of calcium-sa- turated skeletal muscle troponin C_._ Biochemistry (Mosc) 34: 15953- 15964
- Tobacman LS ( 1996 ) Thin filament-mediated regulation of cardiac contraction_._ Annu Rev Physiol 58: 447-
- Gordon AM, Homsher E, Regnier M ( 2000 ) Regulation of contraction in striated muscle_._ Physiol Rev 80: 853-
- Domingo A, Gonzalez-Jurado J, Maroto M, Diaz C, Vinos J, Carrasco C, Cervera M, Marco R ( 1998 ) Troponin-T is a calcium-binding pro- tein in insect muscle: in vivo phosphorylation, muscle-specific iso- forms and developmental profile in Drosophila melanogaster. J Muscle Res Cell Motil 19: 393-
- Cammarato A, Craig R, Lehman W ( 2010 ) Electron microscopy and three-dimensional reconstruction of native thin filaments reveal species-specific differences in regulatory strand densities_._ Biochem Biophys Res Commun 391: 193-
- Lehrer SS, Geeves MA ( 1998 ) The muscle thin filament as a classical cooperative/allosteric regulatory system_._ J Mol Biol 277: 1081-
- Moraczewska J, Gruszczynska-Biegala J, Rędowicz MJ, Khaitlina SY, Strzelecka-Gołaszewska H ( 2004 ) The DNase-I binding loop of actin may play a role in the regulation of actin-myosin interaction by tro- pomyosin/troponin_._ J Biol Chem 279: 31197-
- Śliwińska M, Skórzewski R, Moraczewska J ( 2008 ) Role of actin C-ter- minus in regulation of striated muscle thin filament_._ Biophys J 94: 1341-
- Skórzewski R, Śliwińska M, Borys D, Sobieszek A, Moraczewska J ( 2009 ) Effect of actin C-terminal modification on tropomyosin iso- forms binding and thin filament regulation_._ Biochim Biophys Acta 1794: 237-
- Ochala J ( 2008 ) Thin filament proteins mutations associated with ske- letal myopathies: defective regulation of muscle contraction_._ J Mol Med (Berl) 86: 1197-
- Robaszkiewicz K, Moraczewska J (2011) Wrodzone miopatie - choro- by mięśni szkieletowych związane z zaburzeniami struktury I funk- cji filamentu aktynowego. Postepy Hig Med Dosw (Online) 65: 347- 356
- Marston SB ( 2011 ) How do mutations in contractile proteins cause the primary familial cardiomyopathies? J Cardiovasc Transl Res 4: 245- 255
- Dąbrowska R, Kulikova N, Gagola M ( 2004 ) Nonmuscle caldesmon: its distribution and involvement in various cellular processes. Proto- plasma 224: 1-
- Lin JJ, Li Y, Eppinga RD, Wang Q, Jin JP ( 2009 ) Roles of caldesmon in cell motility and actin cytoskeleton remodeling_._ Int Rev Cell Mol Biol 274: 1-
- Wang CL ( 2001 ) Caldesmon and smooth-muscle regulation_._ Cell Bio- chem Biophys 35: 275-
- Wang CL ( 2008 ) Caldesmon and the regulation of cytoskeletal func- tions_._ Adv Exp Med Biol 644: 250-
- Yamakita Y, Yamashiro S, Matsumura F ( 1990 ) Microinjection of non- muscle and smooth muscle caldesmon into fibroblasts and muscle cells_._ J Cell Biol 111: 2487-
- Guo H, Wang CL ( 2005 ) Specific disruption of smooth muscle calde- smon expression in mice_._ Biochem Biophys Res Commun 330: 1132- 1137
- Mabuchi K, Wang CL ( 1991 ) Electron microscopic studies of chicken gizzard caldesmon and its complex with calmodulin_._ J Muscle Res Cell Motil 12: 145-
- Gao Y, Patchell VB, Huber PA, Copeland O, El-Mezgueldi M, Fattoum A, Calas B, Thorsted PB, Marston SB, Levine BA ( 1999 ) The interface between caldesmon domain 4b and subdomain 1 of actin studied by nuclear magnetic resonance spectroscopy_._ Biochemistry (Mosc) 38: 15459-
- Foster DB, Huang R, Hatch V, Craig R, Graceffa P, Lehman W, Wang CL ( 2004 ) Modes of caldesmon binding to actin: sites of caldesmon contact and modulation of interactions by phosphorylation_._ J Biol Chem 279: 53387-
- Graceffa P, Mazurkie A ( 2005 ) Effect of caldesmon on the position and myosin-induced movement of smooth muscle tropomyosin bound to actin_._ J Biol Chem 280: 4135-
- Mabuchi K, Lin JJ, Wang CL ( 1993 ) Electron microscopic images sug- gest both ends of caldesmon interact with actin filaments_._ J Muscle Res Cell Motil 14: 54-
- Mezgueldi M, Derancourt J, Calas B, Kassab R, Fattoum A ( 1994 ) Pre- cise identification of the regulatory F-actin- and calmodulin-binding sequences in the 10-kDa carboxyl-terminal domain of caldesmon_._ J Biol Chem 269: 12824-
- Wang CL, Coluccio LM ( 2010 ) New insights into the regulation of the actin cytoskeleton by tropomyosin_._ Int Rev Cell Mol Biol 281: 91-
- Dąbrowska R, Goch A, Gałązkiewicz B, Osińska H ( 1985 ) The influ- ence of caldesmon on ATPase activity of the skeletal muscle acto- myosin and bundling of actin filaments_._ Biochim Biophys Acta 842: 70-
- Isotani E, Zhi G, Lau KS, Huang J, Mizuno Y, Persechini A, Gegucha- dze R, Kamm KE, Stull JT ( 2004 ) Real-time evaluation of myosin
450 www.postepybiochemii.pl
light chain kinase activation in smooth muscle tissues from a trans- genic calmodulin-biosensor mouse_._ Proc Natl Acad Sci USA 101: 6279-
- Geguchadze R, Zhi G, Lau KS, Isotani E, Persechini A, Kamm KE, Stull JT ( 2004 ) Quantitative measurements of Ca2+/calmodulin binding and activation of myosin light chain kinase in cells_._ FEBS Lett 557: 121-
- Li Y, Lin JL, Reiter RS, Daniels K, Soll DR, Lin JJ( 2004 ) Caldesmon mu- tant defective in Ca2+-calmodulin binding interferes with assembly of stress fibers and affects cell morphology, growth and motility_._ J Cell Sci 117: 3593-
- Hulvershorn J, Gallant C, Wang CA, Dessy C, Morgan KG ( 2001 ) Cal- modulin levels are dynamically regulated in living vascular smooth muscle cells_._ Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H1422-
- Kim HR, Appel S, Vetterkind S, Gangopadhyay SS, Morgan KG ( 2008 ) Smooth muscle signalling pathways in health and disease_._ J Cell Mol Med 12: 2165-
- Hedges JC, Oxhorn BC, Carty M, Adam LP, Yamboliev IA, Gerthoffer WT ( 2000 ) Phosphorylation of caldesmon by ERK MAP kinases in smooth muscle_._ Am J Physiol Cell Physiol 278: C718-C
- Marston SB, Redwood CS ( 1992 ) Inhibition of actin-tropomyosin acti- vation of myosin MgATPase activity by the smooth muscle regulato- ry protein caldesmon_._ J Biol Chem 267: 16796-
- Ansari S, Alahyan M, Marston SB, El-Mezgueldi M ( 2008 ) Role of cal- desmon in the Ca2+^ regulation of smooth muscle thin filaments: evi- dence for a cooperative switching mechanism_._ J Biol Chem 283: 47-
- Sellers JR (1999) Myosin. Protein Profile. Oxford University Press, Oxford
- Hong F, Haldeman BD, Jackson D, Carter M, Baker JE, Cremo CR ( 2011 ) Biochemistry of smooth muscle myosin light chain kinase_._ Arch Biochem Biophys 510: 135-
- Herring BP, El-Mounayri O, Gallagher PJ, Yin F, Zhou J ( 2006 ) Regu- lation of myosin light chain kinase and telokin expression in smooth muscle tissues_._ Am J Physiol Cell Physiol 291: C817-C
- Chan JY, Takeda M, Briggs LE, Graham ML, Lu JT, Horikoshi N, We- inberg EO, Aoki H, Sato N, Chien KR, Kasahara H ( 2008 ) Identifica- tion of cardiac-specific myosin light chain kinase_._ Circ Res 102: 571- 580
- Lazar V, Garcia JG ( 1999 ) A single human myosin light chain kinase gene (MLCK; MYLK). Genomics 57: 256-
- Puetz S, Lubomirov LT, Pfitzer G ( 2009 ) Regulation of smooth muscle contraction by small GTPases_._ Physiology (Bethesda) 24: 342-
- Wilson DP, Sutherland C, Borman MA, Deng JT, MacDonald JA, Walsh MP ( 2005 ) Integrin-linked kinase is responsible for Ca2+-in- dependent myosin diphosphorylation and contraction of vascular smooth muscle_._ Biochem J 392: 641-
- Matsumura F, Hartshorne DJ ( 2008 ) Myosin phosphatase target subu- nit: Many roles in cell function_._ Biochem Biophys Res Commun 369: 149-
- Cole WC, Welsh DG ( 2011 ) Role of myosin light chain kinase and myosin light chain phosphatase in the resistance arterial myogenic response to intravascular pressure_._ Arch Biochem Biophys 510: 160- 173
- Ito M, Nakano T, Erdodi F, Hartshorne DJ ( 2004 ) Myosin phosphatase: structure, regulation and function_._ Mol Cell Biochem 259: 197-
- Okamoto R, Kato T, Mizoguchi A, Takahashi N, Nakakuki T, Mizutani H, Isaka N, Imanaka-Yoshida K, Kaibuchi K, Lu Z, Mabuchi K, Tao T, Hartshorne DJ, Nakano T, Ito M ( 2006 ) Characterization and func- tion of MYPT2, a target subunit of myosin phosphatase in heart_._ Cell Signal 18: 1408-
- Skinner JA, Saltiel AR ( 2001 ) Cloning and identification of MYPT3: a prenylatable myosin targetting subunit of protein phosphatase 1_._ Biochem J 356: 257-
- Wendt T, Taylor D, Messier T, Trybus KM, Taylor KA ( 1999 ) Visu- alization of head-head interactions in the inhibited state of smooth muscle myosin_._ J Cell Biol 147: 1385-
- Rayment I, Smith C, Yount RG ( 1996 ) The active site of myosin_._ Annu Rev Physiol 58: 671-
- Walcott S, Fagnant PM, Trybus KM, Warshaw DM ( 2009 ) Smooth muscle heavy meromyosin phosphorylated on one of its two heads supports force and motion_._ J Biol Chem 284: 18244-
- Kast D, Espinoza-Fonseca LM, Yi C, Thomas DD ( 2010 ) Phosphoryla- tion-induced structural changes in smooth muscle myosin regulato- ry light chain_._ Proc Natl Acad Sci USA 107: 8207-
- Stull JT, Kamm KE, Vandenboom R ( 2011 ) Myosin light chain kinase and the role of myosin light chain phosphorylation in skeletal musc- le_._ Arch Biochem Biophys 510: 120-
- Scruggs SB, Solaro RJ ( 2011 ) The significance of regulatory light chain phosphorylation in cardiac physiology_._ Arch Biochem Biophys 510: 129-
- Szczesna D ( 2003 ) Regulatory light chains of striated muscle myosin. Structure, function and malfunction_._ Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord 3: 187-
- Walsh MP, Vallet B, Autric F, Demaille JG ( 1979 ) Purification and cha- racterization of bovine cardiac calmodulin-dependent myosin light chain kinase_._ J Biol Chem 254: 12136-
- Ding P, Huang J, Battiprolu PK, Hill JA, Kamm KE, Stull JT( 2010 ) Car- diac myosin light chain kinase is necessary for myosin regulatory light chain phosphorylation and cardiac performance in vivo_._ J Biol Chem 285: 40819-
- Mizutani H, Okamoto R, Moriki N, Konishi K, Taniguchi M, Fujita S, Dohi K, Onishi K, Suzuki N, Satoh S, Makino N, Itoh T, Hartshorne DJ, Ito M ( 2010 ) Overexpression of myosin phosphatase reduces Ca2+ sensitivity of contraction and impairs cardiac function_._ Circ J 74: 120- 128
- Bagshaw CR, Reed GH ( 1977 ) The significance of the slow dissociation of divalent metal ions from myosin ‘regulatory’ light chains_._ FEBS Lett 81: 386-
- Xie X, Harrison DH, Schlichting I, Sweet RM, Kalabokis VN, Szent- -Gyorgyi AG, Cohen C ( 1994 ) Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2.8 A resolution_._ Nature 368: 306-
- Houdusse A, Cohen C ( 1996 ) Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2 A resolution: implications for regulation_._ Struc- ture 4: 21-
- Himmel DM, Mui S, O’neall-Hennessey E, Szent-Gyorgyi AG, Cohen C ( 2009 ) The on-off switch in regulated myosins: different triggers but related mechanisms_._ J Mol Biol 394: 496-
- Wolenski JS, Hayden SM, Forscher P, Mooseker MS ( 1993 ) Calcium- -calmodulin and regulation of brush border myosin-I MgATPase and mechanochemistry_._ J Cell Biol 122: 613-
- Whittaker M, Milligan RA ( 1997 ) Conformational changes due to calcium-induced calmodulin dissociation in brush border myosin I- -decorated F-actin revealed by cryoelectron microscopy and image analysis_._ J Mol Biol 269: 548-
- Lewis JH, Greenberg MJ, Laakso JM, Shuman H, Ostap EM ( 2012 ) Calcium regulation of myosin-I tension sensing_._ Biophys J 102: 2799- 2807
- Lieto-Trivedi A, Coluccio LM ( 2008 ) Calcium, nucleotide, and actin affect the interaction of mammalian Myo1c with its light chain cal- modulin_._ Biochemistry (Mosc) 47: 10218-
- Manceva S, Lin T, Pham H, Lewis JH, Goldman YE, Ostap EM ( 2007 ) Calcium regulation of calmodulin binding to and dissociation from the myo1c regulatory domain_._ Biochemistry (Mosc) 46: 11718-
- Quintero OA, Moore JE, Unrath WC, Manor U, Salles FT, Grati M, Kachar B, Yengo CM ( 2010 ) Intermolecular autophosphorylation re- gulates myosin IIIa activity and localization in parallel actin bundles_._ J Biol Chem 285: 35770-
- Liu CH, Satoh AK, Postma M, Huang J, Ready DF, Hardie RC ( 2008 ) Ca2+-dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodu- lin and NINAC myosin III_._ Neuron 59: 778-
- Bahler M ( 2000 ) Are class III and class IX myosins motorized signal- ling molecules? Biochim Biophys Acta 1496: 52-
