Pobierz Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi i więcej Publikacje w PDF z Biochimica Medica tylko na Docsity!
diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2010 • Volume 46 • Number 2 • 125-
Praca oryginalna • Original Article
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych
frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Validation of the method of determination of phospholipid
fraction fatty acids in blood serum
1 Jolanta Bugajska, 1 Joanna Berska, 2 Diana Hodorowicz-Zaniewska, 1 Krystyna Sztefko
(^1) Zakład Biochemii Klinicznej Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii i (^2) I Katedra Chirurgii Ogólnej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie
Streszczenie Cel: Określenie parametrów walidacyjnych metody oznaczania poszczególnych kwasów tłuszczowych (średniołańcuchowych, długołańcuchowych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów o konformacji trans) frakcji fosfolipidów surowicy krwi. Metoda: Estry metylowe kwasów tłuszczowych uzyskane przez zmydlanie w środowisku zasadowym fosfolipidów wyekstra- howanych z surowicy krwi oznaczono ilościowo na chromatografie gazowym z kapilarną kolumną HP-88 wyposażonym w detektor płomieniowo-jonizacyjny. Wyniki: Wyznaczono granicę pomiaru (limit of detection, LOD) i granicę oznaczalności (limit of quantification, LOQ) oraz współczynniki zmienności (CV) wewnątrz serii i między seriami dla każdego kwasu tłuszczowego oraz obliczono odzysk dla próbek surowicy obciążonych 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3-fosfocholiną. Wartości LOD zawierają się w granicach 0,8 – 16, mol/l, LOQ w granicach 2,5 – 49,2 mol/l. Współczynniki korelacji (r 2 ) pomiędzy stężeniem kwasu a polem powierzchni piku mieszczą się w zakresie pomiędzy 0,9993 – 0,9999. Współczynniki zmienności wewnątrz serii były poniżej 10% (z wyjątkiem kwasów C12, C18:1 trans, C20 + C18:3 (n-6) i C20:2) natomiast między seriami poniżej 20% (z wyjątkiem kwasów C12, C18: trans i C24). Średni odzysk był w zakresie 96,9 – 115,3%. Wniosek: Otrzymane parametry walidacyjne wykazały, że metoda nadaje się do ilościowego oznaczania indywidualnych kwa- sów tłuszczowych nasyconych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów o konformacji trans frakcji fosfolipidów w surowicy krwi.
Summary Aim: Specifying the validation parameters of the method of determination of the individual fatty acids (medium and long-chain, mono- and polyunsaturated, of cis and trans configuration) of phospholipid fraction of blood serum. Method: Methyl esters of fatty acids liberated by alkali hydrolysis from phospholipids extracted from blood serum have been determined on gas chromatograph with capillary column HP-88 and flame-ionization detector. Results: Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ), as well as variation coefficients (CV) within series and among series have been determined for each fatty acid. Also recovery was determined by loading serum samples with 1,2-di- palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. The values of LOD were within the range of 0.8-16.2 mol/l, those of LOQ between 2. and 49.2 μmol/l. The correlation coefficients (r^2 ) between the concentration of fatty acid and area under the peak were in the range of 0.9993-0.9999. For most fatty acids (with exception of C12, C18:1 trans, C20+C18:3 (n-6) and C20:2 acids) CV within series was below 10%, and CV among series below 20% (with exception of acids C12, C18:2 trans and C24). Mean recovery was between 96.9 and 115.3%. Conclusion: The validation parameters obtained have shown that the method is suitable for the quantitative determination of the individual saturated and unsaturated, mono and polyunsaturated, cis and trans fatty acids of phospholipid fraction of blood serum.
Słowa kluczowe: kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, chromatografia gazowa
Key words: fatty acids, phospholipids, gas chromatography
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Wstęp Analiza składu kwasów tłuszczowych w materiale biologicz- nym (surowica, tkanki) wymaga zastosowania odpowiednich metod ekstrakcji i oczyszczania frakcji lipidowych. Najczę- ściej stosowaną metodą do ilościowej ekstrakcji składników lipidowych z surowicy krwi jest metoda Folcha i wsp. [7]. Aby zapobiec utlenianiu kwasów tłuszczowych w czasie ekstrak- cji stosuje się antyutleniacze takie jak butylohydroksytoluen lub 2,6-di-tert-butyl-p-cresol albo każdy etap przygotowania wstępnego próbek wykonuje się w atmosferze azotu [4,18]. Rozdział lipidów w ekstraktach z materiałów biologicznych można przeprowadzić za pomocą chromatografii cienkowar- stwowej (TLC) lub chromatografii cieczowej z użyciem kolu- mienek z aminopropylową fazą stałą [10,15]. Rozdział lipi- dów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) jest metodą czasochłonną i powoduje utlenienie wielonienasy- conych kwasów tłuszczowych (PUFA) z powodu długotrwa- łej ekspozycji na powietrze. Bardziej polecany jest rozdział na aminopropylowej fazie stałej, co pozwala na uzyskanie dokładniejszych wyników oraz na skrócenie czasu analizy. W celu oznaczenia stężeń poszczególnych kwasów tłusz- czowych we frakcjach lipidowych, materiał uzyskany z płytek chromatograficznych lub rozdzielone na kolumienkach prób- ki poddaje się zmydlaniu i estryfikacji. Ilościowo uzyskane w ten sposób estry metylowe kwasów tłuszczowych ozna- cza się za pomocą chromatografii gazowej (GC) najczęściej z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) [14,3] lub detektorem masowym (MS) [11,17]. W dotychczas publi- kowanych pracach przedstawiających metody oznaczania kwasów tłuszczowych pochodzących z poszczególnych klas lipidowych, brak jest danych o możliwości równoczesnego oznaczenia stężenia kwasów o konformacji cis oraz trans. Opisywane są metody pozwalające na ilościowe oznaczanie albo kwasów tłuszczowych o konformacji cis [1,11] albo kwa- sów o konformacji trans [12,2]. W większości prac wartości stężeń kwasów średniołańcuchowych, długołańcuchowych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów tłuszczowych o konformacji trans podawane są jako procent całkowitych kwasów tłuszczowych danej frakcji lipidowej, a nie jako bez- względne stężenia [16,5]. Skład procentowy w odróżnieniu od bezwzględnego stężenia nie odzwierciedla jednak praw- dziwych różnic zawartości kwasów tłuszczowych w różnych próbkach lub różnych materiałach biologicznych. W tym świetle określenie parametrów liniowości i powtarzalności metody ilościowego oznaczania stężenia kwasów tłuszczo- wych frakcji lipidowych surowicy krwi wydaje się celowe.
Materiały i metody Odczynniki Trifluorek boru w metanolu (14 % BF 3 ), heksan, chloroform i metanol (Sigma-Aldrich, Niemcy), NaCl (Merck, Niemcy), izopropanol (J.T.Baker, Holandia), eter dietylowy (Chempur, Polska), kwas octowy (Fluka, Niemcy), bezwodny siarczan sodu (Chempur, Polska), wodorotlenek potasu (POCH, Pol- ska). Wszystkie zastosowane odczynniki było o czystości
wymaganej w chromatografii. Wzorce kwasów tłuszczowych w roztworze metanol:chloroform (5:1) (Sigma-Aldrich, Niem- cy): kwas laurynowy C12, kwas mirystynowy C14, kwas palmitynowy C16, kwas palmitooleinowy C16:1 n-7, kwas stearynowy C18, kwas elaidynowy C18:1 n-9 trans, kwas oleinowy C18:1 n-9 cis, kwas linolowy C18:2 n-6 trans, kwas linolowy C18:2 n-6 cis, kwas arachidowy C20, kwas alfa-lino- lenowy C18:3 n-3, kwas 11,14 eikozadienowy 20:2 n-6 cis, kwas arachidonowy C20:4 n-6, kwas timnodonowy C20: n-3, kwas behenowy C22, kwas cerwonowy C22:6 n-3, kwas lignocerynowy C24, kwas cerotynowy C26. Jako standard wewnętrzny zastosowano 1,2-dipentadekanoilo-sn-glicero- 3-fosfocholinę o stężeniu 8,5 mmol/l (Sigma-Aldrich, Niem- cy), a dla oceny odzysku użyto 1,2-dipalmitylo-sn-glicero-3- fosfocholinę (Sigma-Aldrich, Niemcy). Materiały Kolumienki ekstrakcyjne z aminopropylową fazą stałą – Sep- Pak NH 2 , 500mg (Waters, USA) Ekstrakcja lipidów z surowicy Do ekstrakcji lipidów z surowicy zastosowano metodę Folcha i wsp. [7]. 10 ml mieszaniny chloroform-metanol (2:1, v/v) i 40 μl standardu wewnętrznego dodawano do 1 ml surowi- cy, mieszano 15 min. Następnie dodawano 5 ml 10% NaCl, ponownie mieszano i wirowano. Fazę organiczną zbierano, osuszano bezwodnym Na 2 SO 4 i odparowywano w atmosfe- rze azotu w temperaturze 37 0 C. Rozdział frakcji lipidowych na kolumienkach Sep-Pak NH (^2) Suchą pozostałość rozpuszczano w 200 μl chloroformu i nakładano na kolumienkę z aminopropylową fazą stałą Sep-Pak NH 2. Kolumienki aktywowano poprzez trzykrotne przemycie 2 ml heksanu. Estry cholesterolu, monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy eluowano z kolumienki 4 ml miesza- niny chloroform-izopropanol (2:1, v/v), następnie wymywano kwasy tłuszczowe 6 ml 2% kwasu octowego w eterze. Ostat- nim etapem było eluowanie fosfolipidów 4 ml metanolu. Zmydlanie fosfolipidów Próbki zawierające frakcję fosfolipidów odparowywano w atmosferze azotu w temp 37 0 C. Do suchej pozostałości do- dawano 1 ml 2M KOH w metanolu i przeprowadzano zmy- dlanie w szczelnie zamkniętych probówkach przez 20 minut w atmosferze azotu w temperaturze 70 0 C. Otrzymywanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych Do każdej próbki zawierającej kwasy tłuszczowe pochodzą- ce z frakcji fosfolipidów dodawano 1 ml 14 % BF 3 w metano- lu. Metylację prowadzano w temperaturze 100^0 C w szczelnie zamkniętych probówkach w atmosferze azotu przez 60 min, a następnie próbki doprowadzano do temperatury pokojowej. Końcowe przygotowanie próbek do rozdziału na chromato- grafie gazowym Do wszystkich probówek zawierających estry metylowe kwa- sów tłuszczowych dodawano 2 ml heksanu i 2 ml 10% NaCl i wytrząsano przez 15 minut. Zbierano warstwę organiczną i procedurę powtarzano. Zebrane warstwy organiczne od- parowywano do sucha w atmosferze azotu w temperaturze 37°C, a następnie rozpuszczano w 100 μl heksanu.
Walidacja metody oznaczania kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w surowicy krwi
Dyskusja Walidacja metody wymaga wyznaczenia zakresu liniowości, granicy wykrywalności, granicy oznaczalności oraz określe- nia powtarzalności, dokładności i swoistości metody [8,9,6]. Wartości LOD i LOQ są istotne dla oceny bardzo niskich stężeń kwasów tłuszczowych, a w większości publikacji nie
są one podawane albo podawane są tylko dla kwasów wy- stępujących w surowicy w wysokich stężeniach [11]. Często ocenia się metodę w oparciu tylko o obliczenie współczynni- ków zmienności wewnątrz i zewnątrz serii oraz wielkości od- zysku [1,13]. Jedynie Sanchez-Avila i wsp. podają wartości LOD i LOQ dla wszystkich kwasów tłuszczowych, zarówno
Rycina. 1 Chromatogram kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów w mieszaninie kalibracyjnej
Tabela I Krzywe kalibracyjne, LOD i LOQ, współczynniki zmienności wewnątrz serii i między seriami dla poszczególnych kwasów tłuszczowych
Kwas tłuszczowy (^) [μLODmol/l] [μLOQmol/l] CV wewnątrz serii[%] CV między seriami[%]
C12 2,2 6,5 3,2 33, C14 2,7 8,2 9,2 12, C16 16,2 49,2 0,3 5, C16:1 2,6 7,9 1,8 8, C18:0 7,2 21,9 1,3 6, C18:1 trans 2,5 7,7 13,8 19, C18:1 cis 7,5 22,7 1,2 5, C18:2 trans 2,2 6,5 11,9 23, C18:2 cis 7,7 23,4 0,4 7, C20 + C18:3 (n-6) 2,2 6,8 19,0 19, C18:3 (n–3) 0,9 2,8 5,6 19, C20:2 1,1 3,2 4,2 11, C22 2,9 8,9 4,1 9, C20:4 12,5 37,9 0,4 6, C20:5 5,1 15,4 3,2 10, C24 1,3 4,0 5,4 23, C26 0,8 2,5 nie oznaczano C22:6 12,5 37,7 3,4 8,
J. Bugajska i inni
mono jak i wielonienasyconych oraz konformacji trans , lecz nie rozróżniają kwasów tłuszczowych pochodzących z po- szczególnych frakcji lipidowych surowicy. Metoda opisana przez nich służy do oznaczania kwasów tłuszczowych ze- stryfikowanych i wolnych [17]. Uzyskane przez nas współczynniki zmienności (CV, %) wewnątrz serii dla poszczególnych kwasów tłuszczowych mieszczą się w granicach zmienności podawanych przez Horwitz [19] i uzyskanych przez Bondia-Bons i wsp [1]. Ci ostatni autorzy nie oznaczali jednak kwasu C12, oraz kwa- sów C18:1 trans i C18:2 trans. Podawane przez nich warto- ści CV wewnątrz serii były podobne do uzyskanych w sto- sowanej przez nas metodzie, z wyjątkiem kwasów C14 oraz C20 + C18:3 (n-6), dla których CV były znacznie wyższe. Stężenia kwasów o konformacji trans są we frakcji fosfolipi- dów niskie, dlatego też uzyskane wartości CV wewnątrz serii oraz między seriami są wysokie i wynoszą dla kwasu C18:1, n-7 trans + C18:1, n-9 trans odpowiednio 13,8% i 19,2% oraz dla C18:2 trans (9t,12t C18:2, n-6) 11,9%, 23,5%. King i wsp. [12] oznaczali w surowicy krwi tylko kwasy trans i uzyskali następujące wartości CV dla dwóch próbek o różnych stęże- niach: dla kwasu C18:1, n-7 trans 4% i 9%, dla kwasu C18:1, n-9 trans 3% i 21 % oraz dla kwasu C18:2 trans (9t,12t C18:2, n-6) 13% i 28% [12]. Dla stosowanej przez nas metody oznaczania kwasów tłuszczowych uzyskano wysokie odzy- ski, które świadczą o dobrej dokładności. Porównanie zawartości poszczególnych kwasów tłuszczo- wych we frakcji fosfolipidów oznaczonych metodą GC-FID oraz metodą GC/MS wykazało różnicę od 2,61 do 28,12%. Oznaczenia metodą GC/MS wykonane w innym laborato- rium potwierdzają swoistość metody. Dopuszczalny całko- wity błąd pomiaru dla rzadkich oznaczeń o wieloetapowej procedurze przygotowania próbek wynosi nawet do 30-35%. Masood i wsp. porównując oznaczenia kwasów tłuszczo- wych wykonane na dwóch różnych zestawach chromatogra- ficznych w tym samym laboratorium otrzymali różnice sięga-
jące 15,6% [13]. Przedstawiona metoda umożliwia oznaczanie kwasów tłusz- czowych C12, C14, C16, 16:1, C18, C18:1 trans, C18:1 cis, C18:2 cis, C18:3 n-3, 20:2, C20:4, C20:5, C22, 22:6, C24, C26 we frakcji fosfolipidów surowicy z akceptowalną precy- zją i dokładnością. Natomiast dla kwasu C18:2 trans uzy- skane stężenia w surowicy są na granicy wykrywalności me- tody. Uzyskane w obecnej pracy wartości LOD i LOQ mogą stanowić punkt odniesienia dla innych metod oznaczania indywidualnych kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów surowicy krwi.
Wnioski Otrzymane parametry walidacyjne wykazały, że metoda na- daje się do ilościowego oznaczania indywidualnych kwasów tłuszczowych nasyconych, mono- i wielonienasyconych oraz kwasów o konformacji trans frakcji fosfolipidów w surowicy krwi.
Piśmiennictwo
- Bondia-Pons I, Morera-Pons S,Castellote AI I wsp. Determina- tion of phospholipid fatty acids in biological samples by solid- phase extraction and fast gas chromatography. J Chromatogr A 2006; 1116: 204-8.
- Bradbury KE, Skeaff CM, Green TJ I wsp.The serum fatty ac- ids myristic acid and linoleic acid are better predictors of serum cholesterol concentrations when measured as molecular per- centages rather than as absolute concentrations. Am J Clin Nutr 2010; 91: 398-405.
- Brondz I; Development of fatty acid analysis by high-perfor- mance liquid chromatography, gas chromatography, and related techniques. Anal Chim Acta 2002; 465: 1–
- Burdge GC, Wright P, Jones AE i wsp. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br J Nutr 2000; 84: 781-7.
- Chajès V, Hultén K, Van Kappel AL i wsp. Fatty-acid composition in serum phospholipids and risk of breast cancer: an incident case-control study in Sweden. Int J Cancer 1999; 83: 585-90.
- EURACHEM Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Meth- od, First Internet Version, 1998. 7.Folch J, Lees M, Sloane Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957; 226: 497-509.
- International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Hu- man Use: Text on Validation of Analytical Procedures, ICH-Q2A, Geneva 1994. 9.International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Hu- man Use: Validation of Analytical Procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva 1996. 10.Kaluzny MA, Duncan LA, Merritt MV. i wsp.Rapid separation of lipid classes in high yield and purity using bonded phase col- umns; J Lipid Res 1985; 26: 135-40.
- Kangani CO, Kelley DE, Delany JP.; New method for GC/FID and GC-C-IRMS analysis of plasma free fatty acid concentra- tion and isotopic enrichment. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2008; 873: 95-101.
- King IB,Kristal AR, Schaffer S i wsp. Serum trans-fatty acids are associated with risk of prostate cancer in beta-Carotene and Retinol Efficacy Trial. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005; 14: 988-92.
Tabela II Średnie wartości różnicy ± SD [%] między wynikami oznaczenia kwasów tłuszczowych frakcji fosfolipidów metodą GC/MS i metodą GC-FID
kwas Różnica ± SD [%] C15 (IS) 3,16 ± 2, C16:1 15,57 ± 10, C16 14,49 ± 1, C18:2 cis 2,61 ± 1, C18:1 cis 5,34 ± 3, C18:0 10,93 ± 2, C20:4 6,64 ± 1, C20:5 24,52 ± 8, C20:2 3,62 ± 3, C22:6 14,80 ± 2, C22 28,12 ± 5, C24 22,57 ± 5,
