Docsity
Docsity

Przygotuj się do egzaminów
Przygotuj się do egzaminów

Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity


Otrzymaj punkty, aby pobrać
Otrzymaj punkty, aby pobrać

Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium


Informacje i wskazówki
Informacje i wskazówki

Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny, Ćwiczenia z Chemia

Białka ulegają procesowi koagulacji i procesowi odwrotnemu - peptyzacji. Koagulacja jest to przejście zolu w żel, a peptyzacja jest to przejście żelu w zol. Na ...

Typologia: Ćwiczenia

2022/2023

Załadowany 23.02.2023

lilly_of_the_valley
lilly_of_the_valley 🇵🇱

4.8

(16)

219 dokumenty

Podgląd częściowego tekstu

Pobierz Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny i więcej Ćwiczenia w PDF z Chemia tylko na Docsity! 1 Uniwersytet Gdański Wydział Chemii Chemia żywności Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny Chemia żywności Ćwiczenie nr 3 Gdańsk, 2016 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 2 1. CZĘŚĆ TEORETYCZNA Białka są naturalnymi produktami zbudowanymi z reszt α-L-aminokwasowych, połączonych w łańcuchy polipeptydowe wiązaniami trans-peptydowymi (jedynie przed każdą resztą proliny występuje konfiguracja cis). Budowa i właściwości białek, w tym białek obecnych w mleku, opisane są w pozycji 2 i 3 spisu literatury. Najistotniejsze informacje niezbędne do wyjaśnienia przeprowadzonych procesów/reakcji podano poniżej. 1. 1. Struktura i właściwości fizykochemiczne białek Struktura pierwszo-, drugo-, trzecio- i czwartorzędowa Różnorodność białek wynika ze składu i sposobu uszeregowania reszt różnych aminokwasów w cząsteczce (struktury pierwszorzędowej). Chemiczne właściwości i wymiary reszt aminokwasów powiązanych w określonej sekwencji decydują o konformacji białek (kształcie łańcuchów polipeptydowych - strukturze drugorzędowej), o ich przestrzennym ułożeniu w cząsteczce (strukturze trzeciorzędowej), a także o wzajemnym oddziaływaniu podjednostek przy tworzeniu struktur czwartorzędowych. Białka o określonej konformacji mają charakterystyczne właściwości biologiczne oraz cechy funkcjonalne w żywności. Denaturacja Pod wpływem wielu czynników fizycznych i chemicznych następuje nieodwracalne zniszczenie struktury białka zwane procesem denaturacji. Denaturacja białka dotyczy zmian w II, III- i IV- rzędowej strukturze białka natywnego, które prowadzą do utraty aktywności biologicznej lub innej indywidualnej cechy charakterystycznej przy zachowaniu jego struktury pierwszorzędowej. Podczas denaturacji niszczone są wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukujących zerwaniu ulegają wiązania disulfidowe. Denaturacja może być procesem odwracalnym (tzw. renaturacja) lub nieodwracalnym. Podczas denaturacji zachodzą zmiany rozpuszczalności i przesunięcie punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha peptydowego może prowadzić do wzrostu lepkości, a także zmian absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się również często procesy agregacji i wytrącania, co jest związane ze zmianami stopnia hydratacji i rozpuszczalności białek. Najważniejszymi metodami fizycznymi denaturacji są: ogrzewanie, silne mieszanie, wytrząsanie, naświetlanie promieniowaniem nadfioletowym, rentgenowskim i jonizującym lub działanie ultradźwiękami. Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpływem związków, które są zdolne do rozerwania wiązań wodorowych, na przykład pod wpływem roztworu mocznika o stężeniu 6-8 mol/l lub chlorku guanidyny o stężeniu 4 mol/l, na skutek działania kwasów lub zasad (wartość 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 5 Białka mleka należą do białek pełnowartościowych o wysokiej wartości biologicznej, zawierają bowiem wszystkie aminokwasy egzogenne niezbędne do budowy białka ustrojowego oraz wzrostu człowieka. Pod tym względem ustępują jedynie białku jaja kurzego, będącego „dietetycznym wzorcem”. Doskonale uzupełnia produkty roślinne, jak pieczywo, kasze, mąki, warzywa, które zawierają białko niepełnowartościowe. Wartość energetyczna (kaloryczna) mleka - w zależności od zawartości tłuszczu – wynosi około 500 -700 kcal/kg i pokrywa ok. 25% przeciętnego dziennego zapotrzebowania człowieka na energię. Jest więc to produkt stosunkowo niskokaloryczny, przy dużej zawartości białka. Białka mleka dzieli się ze względu na ich budowę, rolę biologiczną i właściwości funkcjonalne na kazeiny, białka serwatki oraz otoczki kuleczek tłuszczowych (Tabela 2). Tabela 2 Zawartość białek w mleku krowim (http://www.food-info.net/pl/qa/qa-fp1.htm). Białko g/kg białka Udział w całkowitej zawartości białka Kazeina α-s1-kazeina 10.0 30.6 α-s2-kazeina 2.6 8.0 β-kazeina 10.1 30.8 κ-kazeina 3.3 10.1 Całkowita zawartość kazeiny 26.0 79.5 Białka serwatki α-laktoalbumina 1.2 3.7 β-laktoglobulina 3.2 9.8 Albumina surowicy krwi 0.4 1.2 Immunoglobuliny 0.7 2.1 Pozostałe 0.8 2.4 Całkowita zawartość białek serwatki 6.3 19.3 Kuleczki tłuszczowe 0.4 1.2 Całkowita zawartość białka 32.7 100 Kazeiny są heterogeniczną grupą fosfoprotein, złożoną z 20 składników; są to najważniejsze białka mleka krowiego, jego zawartość wynosi 2,4-2,6%. W mleku krowim 40% kazeiny stanowi frakcja α, 30% frakcja β, a dalsze 10% frakcja κ. Kazeiny strącają się z surowego, odtłuszczonego mleka w temp. 20ºC przy pH 4,6; w mleku występują w postaci miceli tworzących roztwór koloidalny. Kuliste micele mają kształt maliny (średnica 20-300 nm), a ich masa micelarna wynosi 107-1010. Micele posiadają porowatą strukturę i są wyraźnie widoczne pod mikroskopem; cząstki miceli wypełniają mniej niż połowę jej objętości. Taka budowa sprzyja wiązaniu wody, jonów, laktozy i enzymów. W 1 ml mleka jest około 7·1013 miceli, które stanowią łącznie od 5 do 6% objętości mleka. Micele utworzone są z podjednostek złożonych z 25-30 cząsteczek kazeiny α, β, κ, których domeny hydrofobowe są zwrócone do wnętrza, a hydrofilowe w kierunku rozpuszczalnika (Rys. 1). Podjednostki te, podobnie jak micele, mają budowę sferyczną, a ich średnica nie przekracza 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 6 10-20 nm. Rysunek 1. Struktura miceli kazeinowej W miceli podjednostki połączone są mostkami utworzonymi przy jony wapniowe, fosforanowe i cytrynianowe: białko‾ − Ca2+− ‾ białko białko − − Ca2+− HPO4 2‾ − Ca2+ − ‾białko białko − − Ca2+− H-cytrynian2- − HPO4 2‾ − Ca2+ − ‾białko Niecała kazeina występuje w mleku w postaci micelarnej, czyli kompleksu fosforokazeinowego. Pewna jej część (do 8 -10%) stanowi tzw. kazeinę rozpuszczalną, która występuje w postaci pojedynczych cząsteczek. Pomiędzy kazeiną cząsteczkową i micelarną istnieje stan równowagi, zależny od stężenia jonów wapnia- Wzrost stężenia jonów wapniowych przesuwa równowagę w kierunku postaci micelarnej, natomiast gdy stężenie jonów wapniowych maleje, następuje dysocjacja miceli. Micele kazeinowe, w świeżym mleku przy pH ok. 6,6 mają ujemny ładunek elektryczny, czyli występuje przewaga zdysocjowanych grup kwasowych nad zasadowymi. Warunkuje to tworzenie się wokół miceli warstw hydratacyjnych o jednoimiennych ładunkach. Warstwy te odpychają się, stabilizując roztwór koloidalny kazeiny. Micele kazeinowe cechuje wysoka stabilność podczas ogrzewania świeżego mleka – koagulację cieplną powoduje dopiero długotrwałe ogrzewanie w temp. ponad 100ºC. Proces koagulacji kazeiny w mleku można wywołać także wieloma innymi czynnikami:  Poprzez zakwaszenie mleka do punktu izoelektrycznego, w którym ilość zdysocjowanych grup kwasowych i zasadowych w micelach kazeiny jest jednakowa (w świeżym mleku 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 7 w temp. 20ºC odpowiada wartości pH 4,6). Zakwaszenie mleka może być osiągnięte w wyniku fermentacji mlekowej laktozy, która podczas dłuższego przechowywania mleka pod wpływem bakterii kwasu mlekowego przekształca się w kwas mlekowy. Bezpośrednie dodanie do mleka kwasu mlekowego, siarkowego (VI) czy octowego również powoduje koagulację kwasową kazeiny.  Dodatek soli metali, takich jak FeCl3, PG(CH3COO)2, lub wprowadzenie do mleka znacznych ilości soli dysocjujących, np. (NH4)2SO4, NaCl, CaCl2. Powoduje się wówczas koagulację przez wysalanie.  Działając na mleko enzymami, np. podpuszczką, chymozyną czy pepsyną. Wytrącanie kazeiny zachodzi na drodze koagulacji enzymatycznej. Nie wszystkie wymienione metody prowadzą do selektywnego wydzielenia kazeiny. Często temu procesowi towarzyszy wytrącanie się pozostałych białe mleka, np. ogrzewanie mleka w temp. 80ºC z wodnym roztworem CaCl2 pozwala na wytrącenie 90% białek zawartych w mleku w postaci obfitego skrzepu. Mechanizm kwasowej koagulacji kazeiny można przedstawić w następujący sposób. Przy pH mleka ok. 6,65 ogólny ładunek elektryczny miceli kazeinowych jest ujemny. Otoczone są więc cząsteczkami wody przy czym bieguny dodatnie jej dipoli zwrócone są w kierunku miceli, a ujemne na zewnątrz. W ten sposób micele otoczone zostają warstwą hydratacyjną o jednoimiennym zewnętrznym ładunku elektrycznym i dlatego wzajemnie odpychają się, co stabilizuje roztwór koloidalny kazeiny, a warstwa hydratacyjna uniemożliwia także bezpośredni kontakt między micelami. Stopień hydratacji miceli zależny jest m.in. od wartości ich ładunku elektrycznego, Stopień jonizacji tych grup zmienia się przy zmianach wartości pH środowiska. Dodawanie do mleka kwasu octowego do momentu osiągnięcia punktu izoelektrycznego, powoduje utratę przez micele zdolności wiązania wody, a zatem warstwy hydratacyjne. Siły odpychania miedzy micelami zanikają, następuje wzajemne zbliżenie się w agregaty z wytworzeniem żelu. Mechanizm koagulacji enzymatycznej kazeiny oparty jest na odłączeniu hydrofilowych fragmentów submicel. Po zewnętrznej części miceli kazeinowej znajdują się submicele, które charakteryzują się sferycznym nagromadzeniem hydrofilowej frakcji κ-kazeiny (Rys. 1). Skrzep podpuszczkowy powstaje w wyniku odłączenia przez enzym proteolityczny (podpuszczkę) fragmentu κ-kazeiny. Od miceli odłączany jest fragment o silnych właściwościach hydrofilowych, fragment ten określany jest jako glikomakropeptyd. Fragment κ-kazeiny, który pozostał 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 10 Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów (Rys. 3). Kolejne etapy przemian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyższym procesie cząsteczki ninhydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum absorpcji przy l = 570 nm), którego natężenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Reakcja z ninhydryna może służyć do ilościowego oznaczania aminokwasów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów, peptydów i białek także sole amonowe, aminocukry i amoniak. 2. WYKONANIE ĆWICZENIA 2.1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie studentów z niektórymi czynnikami powodującymi wytrącanie kazeiny z roztworu oraz z badaniem właściwości tego białka, tj. wyznaczaniem punktu izoelektrycznego, wykrywaniem aminokwasów aromatycznych, wolnych aminokwasów oraz jonów wapniowych. 2.2. Wykonanie ćwiczenia [1] Analizowane produkty spożywcze: - Mleko krowie świeże - Mleko krowie przechowywane w temperaturze pokojowej Odczynniki: - 1 M NaOH, 6 M NaOH - 0,2 M octan sodu (CH3COONa) - 0,2 M kwas octowy (CH3COOH) - 1 % Roztwór glicyny - 0,5 % Wodny CuSO4 - 0,2 % Roztwór CaCl2 - Stężony HNO3 - Nasycony roztwór szczawianu amonu - Nasycony roztwór siarczanu amonu - 0,1% Roztworu ninhydryny - 2 M Kwas octowy - Stężony kwas azotowy (V) HNO3 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 11 Sprzęt i akcesoria: - Statyw: probówki 14 szt. - Łapa do probówek - Pipety 1 ml x 6 szt. - Pipety 2 ml 2 szt. - Pipety 5 ml 1 szt. - Pipety 10 ml 1 szt. - Kolba stożkowa 100 ml 3 szt. - Kolba stożkowa 200 ml 4 szt. - Łapa do kolby stożkowej 1 szt. - Kolba ssawkowa próżniowa 1 szt. - Pompka wodna 1 szt. - Cylinder miarowy 50 ml 3 szt. - Cylinder miarowy 100 ml 1 szt. - Lejek większy 3 szt. - Sączki bibułowe - Termometr 1 szt. - Papierki lamusowe - Łaźnia z lodem 1 szt. - Wrząca łaźnia wodna 1 szt. - Płyta grzejna 1 szt. - Bagietka szklana 3 szt. 2.2.1 Badanie odczynu mleka Papierkiem lakmusowym zbadać odczyn mleka świeżego oraz przechowywanego w temperaturze pokojowej. Porównać wyniki. 2.2.2. Wytrącanie kazeiny z mleka świeżego NICZEGO NIE WYLEWAĆ DO ZAKOŃCZENIA EKSPERYMENTÓW!!! 2.2.2.1. Z użyciem kwasu octowego – CH3COOH Do kolby stożkowej 200 ml wlać 25 ml mleka, dodać 25 ml wody o temp. 38°C, a następnie porcjami łagodnie mieszając 1 ml 2 M kwasu octowego. Całość pozostawić na 10 minut, po czym zdekantować ciecz znad osadu przez lejek z sączkiem bibułowym gładkim do drugiej kolby. Osad 3. Właściwości fizykochemiczne białek mleka – kazeiny 12 osuszać między kartkami bibuły i pozostawić do przygotowania roztworu kazeiny. Ciecz po odsączeniu kazeiny można stosować do wytrącania globulin i albumin. 2.2.2.2. Z użyciem siarczanu amonu – (NH4)2SO4 Do kolby stożkowej 100 ml wlać 5 ml mleka i dodać 35 ml nasyconego roztworu (NH4)2SO4. Następnie całość pozostawić w łaźni z lodem w temp. 2°C do wytrącenia kazeiny, po czym zdekantować ciecz znad osadu przez lejek z sączkiem bibułowym gładkim do drugiej kolby. 2.2.2.3. Z użyciem chlorku wapnia – CaCl2 Do kolby stożkowej 200 ml wlać 25 ml mleka, ogrzać je do temp 80°C, a następnie dodać porcjami łagodnie mieszając 25 ml 0,2% roztworu CaCl2. Całość pozostawić na 10 min, po czym zdekantować ciecz znad osadu przez lejek z sączkiem bibułowym gładkim do drugiej kolby. Kazeina w tym przypadku wytrąca się w postaci ko-precypitatu z białkami serwatkowymi. 2.2.3. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny Przygotowanie roztworu kazeiny Do kolby stożkowej 100 ml odważyć 1 g wytrąconej w punkcie 2.2.2.1. kazeiny i dodać 50 ml wody ogrzanej do temp 40 °C oraz 4 ml 1 M NaOH. Po rozpuszczeniu kazeiny roztwór zobojętnić wobec papierka lakmusowego dodając 4 ml 1 M kwasu octowego. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny W 6 probówkach sporządzić roztwory buforu octowego o pH wzrastającym od 3,6 do 5,6 według tabelki zamieszczonej poniżej. Tabela 3. Sporządzenie roztworów buforu octowego o pH wzrastającym od 3,6 do 5,6 Składniki buforu octanowego [w ml] Odczynniki, odczyn i osad Numer probówki 1 2 3 4 5 6 0,2 M kwas octowy 4,6 4,1 3,0 2,0 1,0 0,5 0,2 M octan sodu 0,4 0,9 2,0 3,0 4,0 4,5 pH 3,6 4,0 4,4 4,6 5,2 5,6 Ocena obfitości osadu Po wymieszaniu do każdej probówki dodać 1 ml przygotowanego roztworu kazeiny, dokładnie