Pobierz Wybrane techniki obrazowania stosowane w kryminalistyce i więcej Publikacje w PDF z Kryminalistyka tylko na Docsity!
II. studIa I analIzy 89
Anna Łasińska
Wybrane techniki obrazowania stosowane w kryminalistyce
Kryminalistyka to szeroka, wielodyscyplinarna nauka wykorzystująca różne techniki i metody badań uznawane i rozwijane od dawna w naukach przyrodniczych. Przez wiele tysiącleci człowiek gromadził wiedzę o obiektach ożywionych na podstawie tego, co mógł zobaczyć gołym okiem. Dopiero na przełomie wieków XVI i XVII pojawiły się pierwsze mikroskopy. Za twórców mikroskopu uważa się Holendrów, Hansa i Zachariasza Janssennów, którzy pierwsze konstrukcje wykonali ok. 1590 r. Ze względu na słabe powiększenie (ok. 10 razy) mikroskopy nie zdobyły wtedy uzna- nia jako narzędzia badawcze. Przełomu dokonał wynalazca i przedsiębiorca Antonie van Leeuwenhoek, który w XVII w. udoskonalił konstrukcję mikroskopu, a następnie rozwinął produkcję tych urządzeń. A. Leeuwenhoek jako pierwszy obserwował żywe komórki – plemniki, pierwotniaki, erytrocyty itp. Odkrycie przez Wilhelma Roentgena tzw. promieni X przyczyniło się m.in. do rozwoju metod obrazowania pozwalających na nieinwazyjne badanie wnętrza żywych organizmów. Postęp technologii obserwowany we współczesnym świecie pociąga za sobą zmiany we wszystkich dziedzinach życia, usprawnia je, przyspiesza ich rozwój oraz otwiera na nowe możliwości badawcze. Współczesna kryminalistyka adaptuje na swo- je potrzeby nowe metody badawcze, technologie i urządzenia w celu optymalizowania uzyskiwanych wyników i dostarczania ich wymiarowi sprawiedliwości w jak najpeł- niejszej i najpewniejszej formie. Zadaniem ekspertów pracujących w laboratoriach kryminalistycznych jest dostarczanie dogłębnej informacji na temat zabezpieczonego materiału dzięki stosowaniu zarówno niszczących, jak i nieniszczących rodzajów ba- dań. W chemii sądowej istotne są badania śladowych ilości różnorodnych substan- cji chemicznych tworzących ślad na miejscu przestępstwa i stanowiących materiał dowodowy. Mikroślad jako dowód materialny w sprawie sądowej nie powinien ulec zniszczeniu bądź zużyciu podczas przeprowadzania badań. Stawia to wysokie wyma- gania biegłym oraz w badaniach wykorzystywanym przez nich technikom. W bada- niach strukturalnych oraz właściwości fizycznych i chemicznych mikrośladów stosuje się wiele różnorodnych metod i technik obrazowania. Głównym celem tych metod – niezależnie od zastosowanego rozwiązania technicznego i narzędzia (od najprostszego szkła powiększającego do zaawansowanych mikroskopów elektronowych) jest uzy- skanie powiększonego obrazu niewielkich obiektów. Obecnie na świecie używa się wielu rodzajów mikroskopów oraz sprzężonych z nimi innych urządzeń wielozadaniowych w celu uzyskania informacji dotyczą- cych kształtu analizowanych próbek i obiektów, ich rozmiarów, składu chemicznego, struktury krystalicznej, właściwości mechanicznych, elektrycznych bądź magnetycz- nych. Najczęściej stosuje się techniki mikroskopii optycznej i elektronowej, techniki
90 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
spektrometryczne, m.in. podczerwieni i Ramana, oraz techniki wykorzystujące pro- mieniowanie rentgenowskie. W artykule zostaną zaprezentowane niektóre techniki obrazowania, takie jak mikroskopia konfokalna^1 , elektronowa i sił atomowych oraz spektrometria mikro- -Ramana, które mają zastosowanie w wielu dziedzinach kryminalistyki. W tabeli 1 porównano podstawowe właściwości mikroskopów: optycznego (świetlnego), skanin- gowego elektronowego (ang. scanning electron microscope , SEM) oraz mikroskopu sił atomowych (ang. atomic force microscope , AFM).
Tab. 1. Podstawowe właściwości mikroskopów: optycznego, elektronowego i sił atomowych^2.
Cecha mikroskopu
Mikroskop optyczny
SEM AFM
Rozdzielczość względem osi x , y
1000 nm 5 nm 0,1 nm
Rozdzielczość względem osi z –^ –^ 0,01 nm
Powiększenie do 2000 do 10^6 do 10^8
Głębia ostrości średnia duża mała Środowisko pro- wadzenia badań
powietrze, ciecz, próżnia próżnia^
powietrze, ciecz, próżnia
Rodzaj ograniczenia
dyfrakcja światła (CLSM – mikroskop konfokalny – dyfrak- cja lasera)
dyfrakcja elektronów rozmiar igły
Niezależnie od typu narzędzia zastosowanego do obrazowania jednym z jego istotnych parametrów jest tzw. z d o l n o ś ć r o z d z i e l c z a, czyli najmniejsza od- ległość miedzy dwoma punktami, które na uzyskanym obrazie mogą być uznawane jako odrębne. Przyczyną ograniczonej zdolności rozdzielczej mikroskopu optyczne- go jest dyfrakcja światła, która powoduje, że obrazy szczegółów sąsiadujących ze sobą na próbce stają się nierozróżnialne, gdy odległość między nimi była bliska długości fali świetlnej. Idea budowy mikroskopu optycznego stała się podstawą mikroskopii
(^1) Odmiana mikroskopii świetlnej charakteryzująca się powiększonym kontrastem i rozdzielczo- ścią. Używana do uzyskania wysokiej jakości obrazów oraz rekonstrukcji obrazów w trzech wymia- rach, za: https://pl.wikipedia.org/wiki/Mikroskopia_konfokalna [dostęp: 29 XII 2017] (przyp. red.). (^2) Wszystkie tabele i materiały ilustracyjne zostały opracowane przez autorkę tekstu (przyp. red.).
92 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
trójwymiarowy. Tego rodzaju mikroskopy charakteryzują się niewielkim, powyżej 300-krotnym powiększeniem. Obserwacja odbywa się w świetle przechodzącym lub odbitym. Mikroskopy stereoskopowe są zalecane do prac związanych z badaniem pisma ręcznego, archeologią, gemmologią, botaniką, badaniami jakości elektronicznych płytek drukowanych, badaniami jakościowymi próbek do analizy SEM/EDX, do ob- serwacji struktur krystalicznych na poziomie mikrometrycznym, wstępnych oględzin materiału dowodowego (zdj. 2) oraz wszelkich prac precyzyjnych.
A B
Zdj. 2. Stoliki do mikroskopu SEM z próbkami wydruku na papierze (A) i mieszaniny pirotechnicznej (B) widziane w mikroskopie stereoskopowym^3.
Jednym z istotnych ograniczeń klasycznej mikroskopii optycznej jest światło po- chodzące spoza płaszczyzny ogniskowania. Obiektyw mikroskopu zbiera obrazy nie tylko z płaszczyzny ogniskowania, lecz także z całego przekroju próbki. Obraz obiek- tów leżących w płaszczyźnie ogniskowania jest ostry i wyraźny. Obrazy obiektów leżących przed i za tą płaszczyzną są nieostre (rozmyte) i to tym bardziej, im dalej leżą od tej płaszczyzny. W rezultacie obraz obiektu widoczny w klasycznym mikroskopie charakteryzuje się wysokim tłem zmniejszającym ostrość konturów. Najdoskonalszym typem mikroskopu świetlnego pod względem optycznym jest mikroskop konfokalny. Jego wynalazca, Marvin Minsky, twierdził, że ideal- ny mikroskop świetlny powinien odcinać światło niepochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu oraz skanować punkt po punkcie badany preparat. W dzi- siejszych czasach parametry laserowo skanującego mikroskopu konfokalnego (ang. Laser Scanning Confocal Microscope , LSCM) zbliżyły się do teoretycznych granic powiększenia i rozdzielczości obrazu, które obowiązują dla mikroskopii świetlnej od XIX w. (ich autorem jest niemiecki fizyk Ernst Abbe). Mikroskop
(^3) A. Łasińska, K. Barszcz, Ilościowa i jakościowa analiza mieszanin pirotechnicznych SEM/EDS , „Przegląd Bezpieczeństwa Wewnętrznego” 2014, nr 11, s. 181.
II. studIa I analIzy 93
konfokalny (zdj. 3) jest zbudowany na bazie mikroskopu fluorescencyjnego 4 , przy czym źródłem światła jest laser lub kilka laserów, które zapewniają skupioną wiąz- kę światła o dużej intensywności.
A B
Zdj. 3. Odwrócony mikroskop konfokalny Nikon TiE Eclipse A1 z mikroselektorem oraz mikrodysekcją laserową (A) oraz mikroskop optyczny Nikon Eclipse 80i z wypo- sażeniem konfokalnym C1 (B).
Wiązka światła jest ogniskowana na oglądanym obiekcie. Założeniem mikrosko- pii konfokalnej jest wyeliminowanie obrazów pochodzących spoza płaszczyzny ognis- kowania. Światło jest skupiane w jednym punkcie preparatu na określonej głębokości. Fluorescencja jest wzbudzana w punkcie ogniskowania, ale także powyżej i poniżej płaszczyzny tego punktu. Dzięki konfokalnej przysłonie otworowej (pinholi), sprzę- żonej wielkością i położeniem z przysłoną otworową toru oświetlenia, w detektorze jest rejestrowany tylko obraz punktu z płaszczyzny ogniskowej preparatu. Głębokość wzbudzenia fluorescencji promieniem lasera i odbierania światła emitowanego wynosi ok. 50 μm. W mikroskopach konfokalnych dwufotonowych zakres jest poszerzony do 400–500 μm. Automatyczne powtórzenie skanowania i kolejnych przesunięć wzdłuż
(^4) M i k r o s k o p i a f l u o r e s c e n c y j n a – rodzaj mikroskopii świetlnej, która jest wykorzystywana do badania próbek fluoryzujących (absorbujących jedną długość światła i emi- tujących inną). Światło o jednej długości fali jest używane do wzbudzania cząsteczek fluorescen- cyjnych, a światło o innej długości fali, które jest emitowane przez cząsteczki, jest gromadzone i używane do wytworzenia obrazu. W przypadkach, gdy obiekty, np. części komórki lub tkanki, które mają być obserwowane, nie wykazują fluorescencji, muszą być znakowane przed obserwacją barwnikiem fluorescencyjnym lub znacznikiem.
II. studIa I analIzy 95
krótkie impulsy promieniowania o dużej gęstości fotonów (dziesiątki kilowatów w maksimum impulsu), jednak o niskiej energii impulsu (nanodżul na impuls). Za- sada skanowania obiektu jest w tej konstrukcji analogiczna do działania mikroskopu ze skanowaniem laserowym. Mikroskopy dwu- lub wielofotonowe mają wiele zalet wynikających ze stosowania wiązki wzbudzenia z zakresu bliskiej podczerwieni, do których należy zaliczyć m.in.:
- niską energię niesioną przez wiązkę, która powoduje znacznie mniejsze uszko- dzenie fotochemiczne i termiczne obiektu,
- lepszą penetrację preparatów biologicznych niż przy stosowaniu krótkofalowe- go światła widzialnego lub promieniowania UV. Umożliwia to pracę z obiekta- mi o większej grubości,
- większą czułość niż LSCM, co pozwala pracować z niższymi stężeniami fluorochromów. Dane o analizowanym obiekcie są zbierane w formie intensywności świecenia punktu i ze swej natury są monochromatyczne. Po zebraniu kompletu danych obraz jest przetwarzany w format typowy dla zdjęć cyfrowych. Może być wówczas łatwo kolorowany. Jeżeli obiekt jest barwiony więcej niż jednym fluorochromem, to muszą się one różnić długością fali światła wzbudzającego. Dla każdej długości fali są zbiera- ne niezależne dane o obiekcie. Emisji pochodzącej od poszczególnych fluorochromów przypisuje się zwykle kontrastowe barwy. Te dane kompiluje się w jeden obraz na etapie tworzenia zdjęcia cyfrowego. Obecnie w handlu są dostępne mikroskopy konfokalne pozwalające na wzbudzenie światła przy trzech lub więcej zakresach fal. Wraz z rozwojem oferty dostępnych fluorochromów i wzrostem ich specyficzności mikroskopia konfokalna staje się coraz bardziej dostępną techniką badawczą dostar- czającą ogromnych ilości szczegółowych informacji. Możliwe jest uzyskanie pojedyn- czego skanu w czasie mniejszym niż 0,05 s. Pozwala to rejestrować przebieg szybko zmieniających się procesów zachodzących w żywej komórce lub tkance i obserwować je potem w formie filmu wideo. Przewagą mikroskopii konfokalnej, która nie występuje w innych rozwiązaniach technicznych, jest możliwość uzyskania serii przekrojów badanego obiektu na róż- nych głębokościach. Taka seria przekrojów może być wykorzystana do odtworzenia przestrzennej struktury obiektu. Technika mikroskopii konfokalnej znalazła szerokie zastosowanie w naukach biologicznych, medycynie, inżynierii genetycznej^6 , a także w kryminalistyce. W me- dycynie sądowej pozwala wykryć i zobrazować zmiany patologiczne w przypadku nagłej śmierci, rozróżnić rany wejściowe i wyjściowe po pocisku, określić odległość strzału, a także zmiany skórne i urazy powstałe po eksplozji materiałów wybucho- wych. Daje też możliwość bezpośredniego trójwymiarowego obrazowania mikrosko- powego pojedynczych komórek ludzkich lub kawałków tkanek (zdj. 4).
(^6) A. Raczkowska i in., Pleiotropic effects of a Yersini enterocolitica ompR mutation on adher- ent-invasive abilities and biofilm formation , „FEMS Microbiology Letters” 2011, nr 321, s. 43–49.
96 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
A B
Zdj. 4. Obraz 3D komórek ludzkich: limfocytów (A) oraz HeLa (B) wykonany za pomocą odwróconego laserowego mikroskopu konfokalnego Nikon TiE Eclipse A1.
Już w XIX w. zauważono, że część barwników ma zdolność oddziaływania na niektóre składniki komórek: białka, lipidy, kwasy nukleinowe itp. Z biegiem czasu opracowano standardowe procedury wybarwiania preparatów pozwalające na uwidocznienie elementów kluczowych dla komórki. Na zdj. 4 pokazano mikrofo- tografię komórek ludzkich wybarwionych mieszaniną trzech barwników. Dzięki ta- kiej kombinacji barwników widać jednocześnie błony komórkowe i jądra komórek. Również niektóre barwniki fluorescencyjne mają zdolność wybiórczego wiązania się z elementami komórki. Zastosowanie barwników fluorescencyjnych ma wiele zalet i pozwala m.in. na:
- obserwację emisji światła na ciemnym tle, co zwiększa czułość metody i po- prawia kontrast obserwowanych szczegółów. Ten wzrost czułości jest na tyle istotny, że we wszystkich technikach wybiórczego wybarwiania konkretnych makrocząsteczek stosuje się w zasadzie barwniki fluorescencyjne, a nie klasycz- ne barwniki absorpcyjne,
- zróżnicowanie komórek lub ich fragmentów ze względu na panujące w nich warunki, do czego wykorzystuje się siłę i barwę fluorescencji zależną od warun- ków panujących w środowisku, czyli: pH, potencjału redox, lipofilowości, po- tencjału błonowego. Na zdj. 4 pokazano jądra komórkowe wybarwione barw- nikiem DAPI. Ten związek fluoryzuje na niebiesko po interkalacji^7 do dna;
- wykrycie różnic w stężeniu niektórych jonów, np. Ca2+, od czego zależy siła i barwa fluorescencji. Zaawansowane systemy mikrodysekcji laserowej są obecnie wyposażone w mo- duły laserowe emitujące promieniowanie UV lub IR, zintegrowane z mikroskopem
(^7) I n t e r k a l a c j a – zjawisko wiązania niewielkich cząsteczek wewnątrz cząsteczek związków wielkocząsteczkowych lub wewnątrz struktur ponadcząsteczkowych zbudowanych z cząsteczek związanych ze sobą np. wiązaniami wodorowymi czy oddziaływaniami van der Waalsa, za: https:// pl.wikipedia.org/wiki/Interkalacja_(chemia) [dostęp: 29 XII 2017] (przyp. red.).
98 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
A B
Zdj. 5. Obraz 3D powierzchni tonera widoczny na wydruku z drukarki laserowej: dokument przeszedł przez urządzenie dwukrotnie (A), dokument przeszedł przez urzą- dzenie jednokrotnie (B). Zdjęcia wykonane w powiększeniu 200 razy za pomocą mi- kroskopu Nikon 80i.
W celu ustalenia cech charakterystycznych budowy tonera widocznych na wydrukach wykorzystano mikroskop optyczny Nikon Eclipse 80i z wyposaże- niem konfokalnym C1 (zdj. 5 B). Fragmenty wydruków stron testowych podda- wano obserwacji w świetle przechodzącym z zastosowaniem kolorowej kamery CCD Nikon DS5NC z chłodzeniem, o rozdzielczości 2560 x 1980 oraz obiektywu LU Plan Fluor 200x, N.A. 0,90, WD 1.0. Konstrukcja mikroskopu pozwala na wy- konywanie badań metodą nieniszczącą dokumentów o formacie A4. Z obserwacji mikroskopowych wynika, że powierzchnia tonera naniesionego przez urządzenie na papier jest silnie rozbudowana (zdj. 6). Dla każdego wydruku tworzy swoisty indywidualny układ struktur. Widoczne są dwa rodzaje charakterystycznych ob- szarów, tj. powierzchnia lita, bardziej płaska, oraz ziarnista, tworząca mniejsze lub większe skupiska o różnym zagęszczeniu.
A B
Zdj. 6. Obraz 3D tonera na wydrukach uzyskanych z kolorowej drukarki laserowej C734/C736w (A) oraz z monochromatycznej drukarki laserowej T650n/T652/T654n (B). Zdjęcia wykonane w powiększeniu 200 razy za pomocą mikroskopu Nikon 80i.
Dobrą metodą obrazowania może być również spektroskopia Ramana. Po- dobnie jak spektroskopia absorpcyjna w podczerwieni należy ona do technik badania widm oscylacyjnych materiałów. Może być stosowana zarówno do gazów, cieczy, jak
II. studIa I analIzy 99
i ciał stałych. W większości spektrometrów ramanowskich jako źródła wzbudzenia używa się laserów. Ta technika jest komplementarna do spektroskopii w podczerwie- ni. W praktyce najczęściej rejestruje się widma z maksimami stokesowskimi 10 , które mają większe natężenia niż antystokesowskie 11 , ponieważ liczba molekuł w pierw- szym oscylacyjnym stanie wzbudzonym jest mniejsza niż w stanie podstawowym. Ze wzrostem temperatury wzrasta liczba molekuł w pierwszym stanie wzbudzonym, wzrasta zatem natężenie linii antystokesowskich. Całkowite widmo ramanowskie składa się z: maksimum rozpraszania Rayleigha 12 (duże natężenie, długość fali taka sama jak długość fali wzbudzającej), maksimów stokesowskich (niższe częstotli- wości, większe długości fali) oraz maksimów antystokesowskich (wyższe często- tliwości, mniejsze długości fali). Przesunięcia ramanowskie w widmach Ramana są identyczne co do wartości z położeniem pików absorpcyjnych w widmach w pod- czerwieni, różnią się jednak ich względne natężenia. Niektóre maksima mogą być widoczne w jednym widmie, w drugim zaś nie. Rozpraszanie Ramana jest związane ze zniekształceniem rozkładu gęstości elektronów wokół wiązania, po którym na- stępuje reemisja promieniowania połączona z powrotem wiązania do pierwotnego kształtu. Molekuły homojądrowe, nieaktywne w podczerwieni, dają linie ramanow- skie, ponieważ polaryzowalność wiązań (czyli siła wiązania elektronów w moleku- le) zmienia się periodycznie i zgodnie w fazie z drganiami rozciągającymi. Warun- kiem pojawienia się pasma ramanowskiego w widmie jest zmiana polaryzowalności w czasie normalnego drgania. W czasie drgania powodującego periodyczne zmiany struktury szkieletu zrębów atomowych może zmieniać się periodycznie również polaryzowalność. To zróżnico- wanie reguły wyboru widma w podczerwieni i Ramana powoduje, że niektóre drga- nia nieaktywne w podczerwieni mogą być aktywne w widmie Ramana i na odwrót. Na przykład drganie dwuatomowej molekuły homonuklearnej (m.in. O 2 , n 2 ) jest w pod- czerwieni nieaktywne, natomiast pojawia się w widmie Ramana, ponieważ w tym drga- niu zmienia się polaryzowalność. W przypadku molekuł NaCl, KCl nie obserwujemy widm Ramana nawet w fazie gazowej, gdzie nie są one zdysocjowane. Dzieje się tak dlatego, że są to molekuły jonowe, ich elektrony walencyjne należą do odpowiednich zrębów atomowych i w czasie drgania poruszają się ze swymi zrębami atomowymi.
(^10) P a s m a s t o k e s o w s k i e – powstają, gdy cząsteczka po oddziaływaniu z promieniowa- niem przenosi się na wyższy poziom oscylacyjny i rozproszony foton ma energię mniejszą o różnicę energii poziomów oscylacyjnych hν. (^11) P a s m a a n t y s t o k e s o w s k i e – jeśli molekuła przed oddziaływaniem z promienio- waniem znajdowała się na wzbudzonym poziomie oscylacyjnym, to oddziaływanie przenosi ją na podstawowy (zerowy) poziom oscylacyjny. Energia rozproszonego fotonu jest większa o różnicę energii poziomów oscylacyjnych hν. Pasmo antystokesowskie pojawia się w widmie Ramana po stronie przeciwnej co pasmo stokesowskie w stosunku do pasma Rayleigha. To pasmo ma zwykle niższą intensywność niż pasma stokesowskie. (^12) P a s m a R a y l e i g h a – powstają na skutek oddziaływania fotonów padającego promie- niowania o częstości ν 0, niepasujących do poziomów energetycznych cząsteczki. Gdy molekuła po oddziaływaniu z promieniowaniem powraca na ten sam poziom energetyczny, to zjawisko to sprowadza się do klasycznego rozproszenia Rayleigha.
II. studIa I analIzy 101
Zdj. 7. Schemat analizy powierzchni ziarna niespalonego prochu za pomocą spektro- metrii mikro-Ramana.
Typowe urządzenie do przesuwania preparatu pod mikroskopem pozwala wybrać odpowiednie miejsce do analizy za pomocą spektrometrii ramanowskiej. Spektrosko- pia mikro-Ramana jest uważana za metodę nieniszczącą substancję podczas jej bada- nia i pozwala na uzyskanie informacji o składzie chemicznym próbki w mikroskali.
102 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
Badania tonerów przeprowadzone metodą spektroskopii ramanowskiej wykazały obecność węglowych struktur cząsteczkowych, na podstawie pasm pochodzących od węgla amorficznego lub (i) grafitu, a także obecność krzemionki amorficznej. W za- leżności od linii wzbudzenia obserwowano pasma w 1574 cm -1^ i 1332cm-1^ (zdj. 8) oraz 1375 cm-1^ , 1253 cm-1, a także 2693 cm-1.
Zdj. 8. Widmo Ramana próbki tonera w postaci proszku pobranego bezpośrednio z kartridża urządzenia Lexmark C780 – zamiennik, wykonane przy wzbudzeniu la- serem o długości fali 532 nm.
Dzięki sprzężeniu spektrometru ramanowskiego z mikroskopem wyposażonym w przesuw skanujący jest możliwe zebranie widm z kilku punktów powierzchni górnej lub dolnej próbki i sporządzenie map na podstawie wielkości wybranej do porówny- wania widm. Właściwy obraz, jaki się uzyskuje, jest przedstawiony w postaci mapki składającej się z kolorowych kwadracików. W ten sposób otrzymuje się rozkład funk- cji dyskretnej i dopiero sam program za pomocą odpowiedniego wielomianu aproksy- muje^14 do rozkładu funkcji ciągłej. W celu zbadania homogeniczności mikrodrobin niespalonego lub częściowo spalonego prochu wykonano mapowanie ramanowskie kilku ziaren prochu. Jedynie niektóre ziarna wykazały obecność ostrych pasm charakterystycznych. Najbardziej wyraźne w widmie ramanowskim mikrodrobin pozostałości powystrzałowych są pa- sma odpowiadające grupom NO 2 oraz CH 2 , nitrogliceryny i nitrocelulozy. Na zdj. 9 pokazano mapy zmiany intensywności pasma drgań rozciągających grupy NO 2 oraz pasma drgań rozciągających symetrycznych grupy CH 2. W przypad- ku mikrodrobiny pochodzącej z pozostałości od amunicji G.F.L 9 × 19 mm Fiocchi zawierającej nitroglicerynę i nitrocelulozę intensywność pasma grupy NO 2 zmienia się od 0,10 do 5,50. Ta zmiana pozwala sądzić, że układ nie jest homogeniczny. Pojawiają się obszary niemal pozbawione związków chemicznych zawierających pasma grupy NO 2.
(^14) A p r o k s y m a c j a (łac. approximare – ‛przybliżać’) – proces określania rozwiązań przybli- żonych na podstawie rozwiązań znanych, które są bliskie rozwiązaniom dokładnym w ściśle spre- cyzowanym sensie, za: https://pl.wikipedia.org/wiki/Aproksymacja [dostęp: 8 I 2018] (przyp. red.).
104 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
obrazowania (mapowania) zmian intensywności pasm niektórych grup funkcyjnych substancji organicznych obecnych w pojedynczym ziarnie. Pełną identyfikację mater- iału dowodowego zapewniają badania morfologii oraz nieorganicznych składników typowych cząstek pozostałości powystrzałowych. W spektroskopii Ramana stosuje się obecnie wiele nowych technik, które przede wszystkim zwiększają czułość tej metody. Rezonansowa spektroskopia Ramana (ang. Resonance Raman Spectroscopy , RRS) jest techniką, w której częstość wiązki monochromatycznej lasera jest dostrojona do częstości przejścia elektronowego anali- zowanego związku, co prowadzi do selektywnego wzrostu intensywności pasm rama- nowskich 10^2 –10^6 razy w stosunku do klasycznej dyspersyjnej spektroskopii Ramana. W badaniach stosuje się również powierzchniowo wzmocnioną spektrosko- pię Ramana (ang. Surface Enhanced Raman Spectroscopy , SERS), w której mierzy się rozproszenie ramanowskie cząsteczek zaadsorbowanych na powierzchni metalu lub metalicznego zolu (głównie srebra). Zjawisko wzmocnienia tłumaczy się dwo- ma różnymi mechanizmami: chemicznym i elektromagnetycznym. SERS zwiększa intensywność sygnału ramanowskiego 10^3 –10 7 razy w stosunku do sygnału otrzymy- wanego w klasycznym eksperymencie ramanowskim^17. Wykorzystując konfokalną mikroskopię ramanowską (ang. Confocal Raman Microscopy ), można wykonać widma z bardzo małego, precyzyjnie wybranego obszaru próbki (ok. 1 μm^2 ). Dzięki możliwościom, jakie daje mikroskop konfokalny, uzyskuje się przekroje optyczne ba- danych materiałów, obrazy trójwymiarowe oraz wizualizację komórek i fragmentów tkanek powłok lakierniczych pochodzących od różnych samochodów, pozostałości powystrzałowych, detekcji śladowych ilości substancji lub zanieczyszczeń, trudnych do podrobienia zabezpieczeń dokumentów. Niektóre rodzaje nowoczesnej mikroskopii świetlnej mogą dawać zdjęcia o bardzo wysokiej rozdzielczości. W przeszłości podstawowym ograniczeniem jakości uzys- kiwanych obrazów mikroskopowych były wady soczewek (aberracja chromatyczna, aberracja sferyczna). Ten problem pokonano, przynajmniej w najdroższych modelach, w drugiej połowie XIX w. Napotkano jednak kolejną barierę – zjawiska dyfrakcji oraz interferencji, które powodują, że odpowiednią ostrość obrazu można uzyskać jedynie dla obiektów o rozmiarach wielokrotnie większych niż długość stosowanej fali. Obiek- ty mniejsze niż 1/2 długości fali nie są w ogóle widoczne. Obiekty o wielkości rzędu długości fali pojawiają się w obrazie mikroskopowym, ale w formie zniekształconej: otoczone barwnymi obwódkami. Dlatego też nawet najlepsze mikroskopy optycz- ne pracujące w zakresie światła widzialnego dają maksymalne powiększenia rzędu 1500 razy. Mikroskopy pracujące w zakresie ultrafioletu osiągają maksymalne po- większenie do ok. 3500 razy. Potrzeba uzyskania dużych powiększeń obiektów, nie- możliwych do uzyskania w mikroskopach optycznych, zdeterminowała rozwój mi- kroskopii elektronowej. Jeśli chce się zobaczyć coś bardzo małego o bardzo wysokiej
(^17) B. Sharma i in., SERS: Materials, applications, and the future , „Materials today” 2012, nr 15, s. 16–25.
II. studIa I analIzy 105
rozdzielczości, a także poznać skład pierwiastkowy badanej substancji, to należy wy- korzystać technikę, jaką jest mikroskopia elektronowa sprzężona z mikroanaliza- torem rentgenowskim (zdj. 10).
Zdj. 10. Skaningowy mikroskop elektronowy z detektorem mikroanalizy rentgenowskiej.
Od 70 lat mikroskop elektronowy stał się powszechnie stosowanym urządze- niem zarówno w nauce, przemyśle, jak i kryminalistyce. Mikroskopy elektronowe różnią się od mikroskopów świetlnych tym, że tworzą obraz próbki za pomocą wiązki elektronów, a nie promieni światła. Elektrony mają znacznie krótszą dłu- gość fali niż światło widzialne, co pozwala mikroskopom elektronowym uzyskiwać obrazy o wyższej rozdzielczości, niż standardowe obrazy uzyskiwane w mikrosko- pach świetlnych. Po opracowaniu odpowiedniej metodyki analitycznej mikroskop elektronowy daje szerokie możliwości badawcze dla mikroskopijnych próbek substancji chemicz- nych oraz złożonych materiałów w postaci ciał stałych. Umożliwia przeprowadzenie jednoczesnych badań ich składu chemicznego i morfologii, a dodatkową jego zaletą jest to, że nie wymaga on w wielu przypadkach zniszczenia próbki – ani w procesie jej przygotowania do analizy, ani podczas pomiaru. W skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM) obraz jest uzyskiwany w wyniku detekcji elektronów wtórnych i (lub) odbitych, którymi próbka jest bom- bardowana. Techniki obrazowania, takie jak: BSE (elektrony wstecznie rozproszone), SE (elektrony wtórne), CL (katodoluminescencja), LVSTD (w zmiennej próżni) oraz mikroanaliza rentgenowska, pozwalają na dokonanie analizy próbek – poza gazem – zarówno przewodzących, jak i nieprzewodzących prąd. Elektrony wtórne i wstecznie rozproszone są powszechnie używane do obrazowania próbek. Najbardziej wartoś- ciowymi dla ukazania morfologii i topografii próbek są elektrony wtórne, nato- miast elektrony wstecznie rozproszone służą do zilustrowania kontrastu w składzie
II. studIa I analIzy 107
po wykonaniu fotografii BSE, lecz także określić zmiany jakościowe i ilościowe ich składu. Analizy liniowe i mapy zawartości pozwalają także na badanie powierzchni pró- bek w celu uchwycenia subtelnych zmian w składzie pierwiastkowym, niewidocznych na fotografii BSE. Skład pierwiastkowy przeliczony na procenty wagowe można łatwo zinterpretować, a podając skład w przeliczeniu na procent atomowy można wyciągać wnioski na temat stechiometrii związków budujących daną próbkę (zdj. 12 i tab. 2).
Zdj. 12. Widmo EDS uzyskane podczas obserwacji SEM. Symbolami pierwiastków glinu, miedzi, tlenu, i bizmutu zostały oznaczone linie K, L, M charakterystycznego promieniowania rentgenowskiego.
Tab. 2. Wyniki ilościowe mikroanalizy rentgenowskiej. Tabelę wyników wygenero- wano za pomocą programu Aztek wchodzącego w skład oprogramowania mikroskopu SEM Mira 3XMU 18. Pierwiastek Typ linii k-Ratio Wt% (^) SigmaWt% związek chemicznyProponowany O K 0,00576 10,38 0,05 SiO al K 0,01818 19,11 0,06 Al2O Cu l 0,01357 18,53 0,08 Cu Bi M 0,04348 51,97 0,12 Bi
Wyniki analizy ilościowej zawierają następujące informacje: •Wt % – procent wagowy danego pierwiastka w próbce, •Wt% Sigma – błąd procentu wagowego, •k-Ratio – stosunek natężenia promieniowania linii charakterystycznej danego pierwiastka w próbce do natężenia od czystego pierwiastka w tych samych warunkach.
(^18) A. Łasińska, Badania mikrośladów …, s. 810.
108 PRZEGLĄD BEZPIECZEŃSTWA WEWNĘTRZNEGO 18/
Charakterystyczne promieniowanie rentgenowskie jest wykorzystywane do otrzymywania map rozkładu stężenia pierwiastków (ang. mapping ). Wiązka analitycz- na skanuje badany obszar punkt po punkcie. spektrometr jest tak ustawiany, aby reje- strował punkt w zadanym obszarze, gdy wykryje impuls rentgenowski o energii cha- rakterystycznej dla danego pierwiastka. W ten sposób powstaje mapa odwzorowująca rozmieszczenie tego pierwiastka w badanym obszarze. Nowoczesne systemy EDS potrafią utworzyć kolorowe mapy w odpowiednich odcieniach, na których jest ukaza- na wartość względna intensywności impulsu w każdym punkcie. Wymaga to jednak zastosowania wystarczająco długiego czasu postoju wiązki w każdym punkcie anali- tycznym. Podczas jednego przebiegu wiązki analitycznej można zarejestrować mapy rozkładu dla kilkunastu pierwiastków (zdj. 13a i 13b). Mapka jest zbiorem plamek odpowiadających impulsom promieniowania rentgenowskiego. Stopień zagęszczenia plamek odpowiada stężeniu pierwiastka. Istotny wpływ na ocenę rozkładu stężenia pierwiastka ma czas zbierania impulsów. Mapki nie pozwalają jednak na wychwyce- nie małych różnic w stężeniach oraz niskich stężeń (ze względu na obecność plamek pochodzących od tła – promieniowanie ciągłe).
Zdj. 13a. Przykłady map rozkładu stężenia pierwiastków. Mapy wygenerowano za pomocą programu Aztek wchodzącego w skład oprogramowania mikroskopu SEM Mira 3XMU, na podstawie zmierzonego widma EDS.
