






Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
Termin 'interferencja RNA'. (RNAi) został pierwszy raz zaproponowany przez Fire i wsp. (3) na określenie wyci szania ekspresji sterowanej przez dsRNA u ...
Typologia: Prezentacje
1 / 11
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Adres do korespondencji Anna Nadolska-Orczyk, Zakład Inżynierii Komórkowej i Transformacji, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Radzików, 05-870 Błonie,
biotechnologia 3 (90) 53-63 2010
Anna Nadolska-Orczyk, Wojciech Zalewski, Sebastian Gasparis, Wacław Orczyk Zakład Inżynierii Komórkowej i Transformacji, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Państwowy Instytut Badawczy, Radzików
Application of RNA interference for cereal crops biotechnology
Summary
RNAi technology is based on a natural process of RNA-directed gene regula tion. The technique is widely used for gene functional analysis and to obtain plants with modified traits. The main advantage of this system, particularly when applied for polyploid species, is the possibility of simultaneous silencing of homologous, homoeologous or orthologous genes. The article discusses the results of relatively few papers where RNAi has been used for functional analysis of native genes of wheat and barley. The main part of the article presents the research on RNAi based gene silencing in cereals performed by our group. The experimental basis of our work was the elabora tion of efficient Agrobacterium-hased transformation and plant regeneration sys tems of different cereal species (wheat, barley, triticale and oat). Currently, the method is applied for modification of two types of traits in wheat, triticale and barley. The first one is a technological trait related to cereal grain hardness. It is genetically controlled by Pina and Pinb genes. We obtained over a hundred transgenic lines with various degrees of Pina and Pinb silencing. Currently, the lines are being analyzed for the amount of PINA and PINB proteins, composition of storage proteins, and the grain texture. The second set of traits depends on CKX genes encoding cytokinin oxidase/dehydrogenase - the part of the system specifically governing the cytokinin level in different organs and developmental stages. We obtained over forty barley transgenic lines with silenced HvCKXl. This modification was found to be tightly correlated with enhanced plant pro ductivity measured as the higher grain number and higher mass of a thousand kernels. The Ti and T 2 transgenic seedlings developed bigger root system.
Key words: RNAi, cereals, wheat, barley, gene silencing.
Anna Nadolska-Orczyk i inni
1. RNAi u roślin
Odkrycie procesu interferencji RNA (RNAi) jest jednym z największych osiągnięć biologii molekularnej ostatnich kilkunastu lat. Pozwoliło ono poznać nowe mecha nizmy regulacji genetycznej, zaoferowało potężne narzędzie badawcze i jednocze śnie stworzyło bardzo konkretne możliwości aplikacyjne. Pierwsze wyniki wskazujące na istnienie nowego rodzaju regulacji genetycznej pochodzą z badań ekspresji syntazy chalkonowej, enzymu szlaku biosyntezy antocy- janów, w transgenicznej petunii (1). Van der Kroi i wsp. (2) zaobserwowali, że dodat kowa kopia genu kodującego ten enzym w transgenicznych roślinach powodowała, zamiast spodziewanej ciemniejszej barwy kwiatów, wykształcenie kwiatów bez barwnych. Efekt ten określono terminem ‘kosupresja’, lub ‘wyciszanie potranskryp- cyjne’ w skrócie PTGS (Post-Transcrłptional Gene Silencing). Termin ‘interferencja RNA’ (RNAi) został pierwszy raz zaproponowany przez Fire i wsp. (3) na określenie wyci szania ekspresji sterowanej przez dsRNA u Ceanorhabditis elegans. W badaniach mechanizmu interferencji RNA wykazano, że we wszystkich przy padkach główną rolę odgrywały krótkie, 18-26-nukleotydowe, dwuniciowe RNA (dsRNA). jest to grupa bardzo heterogenna, w której, dla zastosowań biotechnolo gicznych najważniejsze są krótkie interferujące RNA (siRNA). Powstają one w wyniku specyficznego cięcia dowolnej cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) na przykład dsRNA będącego transkryptem odpowiedniego transgenu. Homologia siRNA do ja kiegokolwiek transkryptu (RNA) inicjuje proces jego degradacji. Efektem jest po- transkrypcyjne wyciszanie ekspresji (PTGS). Homologia siRNA do DNA promotora skutkuje jego metylacją. Konsekwencją jest inaktywacja promotora i wyciszenie transkrypcyjne (TGS) (4). Duża skuteczność oraz wysoka specyficzność tych procesów są głównymi atuta mi RNAi w genomice funkcjonalnej i biotechnologii. Wykazano, że RNAi było indu kowane po wprowadzeniu transgenu, którego przejściowa lub stała ekspresja pro wadziła do akumulacji dsRNA lub RNA o strukturze spinki do włosów - hpRNA (ang. hairpin RNA) (5, 6). Homologia dsRNA / hpRNA do promotora indukowało se- kwencyjnie-specyficzną metylację DNA promotora (RdDM), prowadząc do wycisza nia transkrypcyjnego (7). Pierwsze prace dokumentujące skuteczne wyciszanie ekspresji różnych genów endogennych przy użyciu transgenów kodujących hpRNA ukazały się w 2000 r. (8-10). Opracowano różne systemy wektorów umożliwiające wprowadzenie do ge nomu rośliny transgenu z fragmentem określonego genu w orientacji sensowej i an- tysensowej (11,12, http;//www.chromdb.org/rnai/pMCG161.html), którego ekspre sja prowadziła do powstania hpRNA. Udokumentowano, że użycie małego fragmen tu genu lub jego elementu regulacyjnego jest wystarczające do uzyskania wycisza nia. Bazy z sekwencjami kodującymi i regulatorowymi mogą być bezpośrednio wy korzystane do analizy funkcjonalnej lub do wyciszania ekspresji i uzyskiwania roślin o korzystnych cechach użytkowych.
54 PRACE PRZEGLĄDOWE
Anna Nadolska-Orczyk i inni
dobnie od dawki kaset wyciszających (21). Uzyskanie roślin o wyciszaniu słabym, pośrednim i silnym daje większe możliwości analizy, zwłaszcza w przypadku kiedy brak białka jest skorelowany z letalnością. Bardzo dużą zaletą metody RNAi jest wspomniana możliwość jej wykorzystania, wówczas gdy znany jest jedynie frag ment sekwencji kodującej (znacznik transkrypcji - EST) lub sekwencji regulatoro wej danego genu. Wprowadzenie kasety wyciszającej poprzez stabilną transforma cję umożliwia analizę cech w czasie rozwoju rośliny oraz ich przekazywanie do na stępnych pokoleń.
3. Analiza cech w zbożach
Analiza funkcjonalna genów z wykorzystaniem metody RNAi u zbóż jest nadal w początkowej fazie aplikacji. Skonstruowanie kasety wyciszającej określony gen, dysponując wcześniej opracowanymi systemami wektorów i wiedzą o sekwencji wy ciszanego genu jest zadaniem stosunkowo łatwym. Obecnie głównym czynnikiem li mitującym szerokie zastosowanie tej metody jest brak prostych i wydajnych metod genetycznej transformacji zbóż. Ponadto długi cykl życiowy tych roślin i koniecz ność weryfikacji wyników w kilku pokoleniach generatywnych znacznie wydłuża te badania.
3.1. Diploidalne gatunki zbóż - jęczmień
Do najważniejszych diploidalnych gatunków zbóż należą: ryż (modelowy gatu nek rośliny zbożowej) oraz kukurydza i jęczmień. Obiektem naszych badań jest głównie jęczmień - gatunek ekonomicznie ważny, hodowany i szeroko uprawiany w Polsce. Dotychczas ukazało się zaledwie kilka publikacji, w których opisano wyko rzystanie metody RNAi u tego gatunku. W pierwszej publikacji wykorzystano kasetę wyciszającą, której ekspresja pro wadziła do powstania hpRNA wybranego fragmentu genomu wirusa żółtej karłowa tości jęczmienia (BYDV-PAV). Uzyskane transgeniczne linie były wysoce i jednocze śnie specyficznie odporne na tego wirusa (9). Wyciszenie ekspresji jest ważnym narzędziem badania funkcji genu. Ta strategia została wykorzystana do analizy funkcji genu Jekyll. Badania zmian fenotypowych w roślinach z obniżoną od 20 do \00% ekspresją tego genu pozwoliło wnioskować o istotnej roli białka JEKYLL w programowanej śmierci komórek i rozwoju nasion jęczmienia (22). Stosując podobną metodę badano funkcję genu MSH7 jęczmienia, o którym sądzono, że podobnie jak Ph2 u pszenicy, kontroluje parowanie chromosomów oraz procesy rekombinacji i naprawy DNA. Wyciszenie ekspresji MSH7 pozytywnie zwe ryfikowało te przypuszczenia i potwierdziło istotną rolę tego genu w przebiegu me-
56 PRACE^ PRZEGLĄDOWE
Wykorzystanie interferencji RNA w biotechnologii zbóż
jozy (23). Podobnie Gubler i wsp. (24) zastosowali metodę RNAi do sprawdzenia roli genu HvABAS’OHl w procesach warunkujących spoczynek nasion.
3-2. Gatunki poHploidalne
Do poliploidalnych, rodzimych gatunków zbóż należą: pszenica {Triticiim aestivLim L.), pszenżyto {xTriticosecale Wittmack) i owies {Avena sativa L.). Badania prowadzone w laboratoriach na świecie koncentrują się wokół pszenicy, gatunku 0 bardzo dużym znaczeniu gospodarczym. Pierwsze doniesienie, w którym użyto stabilnej transformacji do wyciszania ge nów natywnych pszenicy dotyczyło genu odpowiedzialnego za wernalizację, VRN z T. monococaim L (25). Wprowadzenie kasety RNAi zawierającej 347 pz tego genu spowodowało obniżenie (do 60%) ilości transkryptów wszystkich homologów VRN w allotetraploidalnej pszenicy i przyspieszało czas kwitnienia roślin. Ta sama strate gia i wyciszenie VRN1, genu warunkującego kwitnienie po wernalizacji, pozwoliła na redukcję ilości transkryptu o 80% i opóźnienie czasu kwitnienia o 2 tygodnie (26). Inną grupą cech modyfikowanych przy użyciu metody RNAi była zawartość 1 skład frakcji skrobi (tj. amylozy i amylopektyny) w ziarnie pszenicy. Geny SBEII ko dują dwie izoformy enzymu syntezy amylopektyny. Regina i wsp. (27) skonstruowali kasety specyficznie wyciszające jeden lub obydwa geny SBEII. W obydwu przypad kach wykazano redukcję białka do poziomu 10% roślin kontrolnych, przy czym zgodnie z oczekiwaniem, pierwsza konstrukcja wyciszała ekspresję tylko jednego, a druga obydwu genów. Ziarna linii transgenicznych miały zredukowaną zawartość amylopektyny i podwyższoną zawartość amylozy. W badaniach na szczurach wyka zano, że zmiana ta jest potencjalnie korzystna żywieniowo. W innych pracach wykorzystujących metodę RNAi skoncentrowano się na jedno czesnym wyciszeniu wielu homeologów wybranych genów. Travella i wsp. (21) ba dali wyciszenie PDS i EIN2 obecnych w każdym z trzech genomów A, B i D alloheksa- ploidalnej pszenicy. Do wyciszania użyto fragmentów genów o długości około 500 pz, wykazujących 96% podobieństwa do trzech homeologicznych kopii. W liniach trans genicznych ilość transkryptów wahała się od 10 do 80% w stosunku do kontroli i było to skorelowane z nasileniem zmian fenotypowych. W transgenicznych liniach homozygotycznych wyciszenie było silniejsze niż w liniach hemizygotycznych co wskazuje, że w heksaploidalnej pszenicy efekt RNAi zależy od dawki transgenu (licz by kaset). Uauy i wsp. (28) analizowali funkcję wielu homologicznych kopii genów NAM pszenicy. W otrzymanych roślinach, charakteryzujących się zredukowaną (od 30 do 60%) ilością transkryptów tych genów obserwowano opóźnienie procesów starzenia oraz obniżenie zawartości białek i mikroelementów (cynku i żelaza) w ziarniakach. Wykorzystując metodę RNAi Yue i wsp. (29) potwierdzili, że podjed- nostka gluteniny lDx5 (produkt genu Wx5) istotnie wpływa na jakość ciasta, a Gil-Humanes i wsp. (30) otrzymali rośliny o zredukowanej zawartości y-gliadyn.
BIOTECHNOLOGIA 3 (90) 53-63 2010 57
Wykorzystanie interferencji RNA w biotechnologii zbóż
wojowych roślin. W obydwu przypadkach wspólnym elementem jest sposób wyci szania prowadzący do degradacji transkryptu (PTGS). W badaniach używany jest wektor binarny pMCGlGl, skonstruowany z myślą o zbożach (http://www.chromdb. org/rnai/pMCG161.html). Zawiera on kasetę selekcyjną genu bar pod promotorem zbożowym Ubił pochodzącym z kukurydzy oraz miejsca restrykcyjne do wprowa dzania fragmentów wyciszanych genów w orientacji sensowej i antysensowej.
Twardość ziarna jest ważną cechą technologiczną. W pszenicy alloheksaploidalnej T. aestivum L., uprawianej w Polsce i dominującej w uprawie na świecie, jest ona głów nie warunkowana dwoma genami Pina i Pinb zlokalizowanymi w genomie D. Geny te kodują puroindolinę a (PINA) i puroindolinę b (PINB). PINA i PINB są dwoma podjed- nostkami friabiliny - białka obecnego we frakcji skrobiowej endospermu i warstwie aleuronowej dojrzałych ziarniaków. Brak tego białka powoduje twardość ziarniaków, co z kolei warunkuje określone cechy technologiczne mąki. Zarówno geny puroindoli- nowe, ich ortologi oraz kodowane przez nie białka puroindolinopodobne występują w niektórych genomach Triticeae i Aveneae. Są one obecne w genomach: H jęczmie nia, R żyta i pszenżyta i D owsa. Brak tych genów w niektórych genomach diploidal- nych i tetraploidalnych zbóż determinuje twardość ziarna. Przykładem jest uprawiana w basenie Morza Śródziemnego pszenica tetraploidalna Triticum turgidum var. dumni (AABB) przeznaczana głównie do produkcji makaronów, kaszy kuskus itp. Mutacje ge nów P/n powodują wykształcenie ziarna o różnym stopniu twardości (37). Wybraliśmy ten prosty model genetyczny do analizy samego efektu wyciszania metodą RNAi jak również ze względu na wartość użytkową warunkowanej przez te geny cechy. Chcemy sprawdzić czy jest możliwe całkowite wyciszenie obydwu ge nów i czy pozwoli to uzyskać ziarno tak twarde jak u pszenicy durum. Jak ta modyfi kacja wpłynie na zawartość innych białek w ziarniakach i ich wartość technolo giczną? Czy występuje sugerowany związek pomiędzy białkami puroindolinowymi a odpornością na patogeny? Badania nad wyciszaniem genów Pin prowadzimy u dwóch odmian pszenicy, Kontesa i Torka oraz odmianie pszenżyta Wanad. Zostały skonstruowane dwie kase ty wyciszające, do wyciszania genu Pina i w osobnym wektorze dla genu Pinb. Rośli ny były transformowane wektorami zawierającymi pojedyncze kasety i kotransfor- mowane obydwoma wektorami. Po wielu eksperymentach wyselekcjonowaliśmy 150 roślin Tq reprezentujących wszystkie kombinacje. Obecność T-DNA sprawdzano wieloma niezależnymi testami PGR z użyciem specyficznych starterów. Funkcjonal ność wprowadzonych kaset weryfikowano badając obecność i ilość transkryptów genu selekcyjnego bar metodą półilościowego RT-PCR. W celu wykonania prawidłowych analiz wyciszania, charakteryzowano allele ge nów Pina i Pinb w badanych odmianach. Poznano ich sekwencję nukleotydową oraz
BIOTECHNOLOGIA 3 (90) 53-63 2010 59
Anna Nadolska-Orczyk i inni
zbadano ekspresję w dojrzewających ziarniakach. Najsilniejszą ekspresję obserwo wano od 20 do 26 dni po zapyleniu (DAP), niezależnie od odmiany. Te stadia rozwo ju ziarniaków wybrano do analizy w wyciszanych liniach. W wyniku przeprowadzo nej analizy sekwencji badanych genów w odmianach Kontesa i Torka wykazano, że allel Pina jest typu dzikiego, a allel Pinb zawiera mutację punktową, prowadzącą do zamiany aminokwasu leucyny na prolinę w pozycji 60 (mutacja Pinb-Dlc).Jest to opi sana mutacja, często występująca w pszenicach europejskich, nie prowadząca do utraty białka (38). Analizę ekspresji obydwu genów Pina i Pinb przeprowadzono w ziarniakach 20 i 26 DAP w transgenicznych liniach Ti i T 2 obydwu odmian pszeni cy i jednej odmiany pszenżyta. Część linii wykazywała całkowite lub częściowe wyci szenie ekspresji obydwu genów. Na podstawie pomiarów ilości białek izolowanych z frakcji skrobi zawierającej PINA i PINB wykazano występowanie u większości linii korelacji pomiędzy zawartością ekstrahowanej frakcji białka i poziomem transkryp- tów obydwu genów. Metoda (SDS-PAGE) rozdziału białek tej frakcji na dwuwarstwo wym żelu pozwoliła na separację PINA i PINB. Białko całkowite w wyciszanych li niach nie uległo obniżeniu. Na podstawie tych analiz wytypowano pojedynki do dal szych badań.
4.4. Badania nad wyciszaniem genów z rodziny HvCKX jęczmienia i TaCKK pszenicy i pszenżyta
Geny CKX należące do rodziny genów, występują u różnych gatunków roślin. Ko dują one enzymy oksydaz/dehydrogenaz cytokinin regulujące endogenny poziom cytokinin w roślinach. Cytokininy, jako regulatory wzrostu, biorą udział w wielu eta pach wzrostu i rozwoju rośliny, m. in. kontroli formowania i wzrostu pąków bocz nych u ryżu (39). Zróżnicowane profile ekspresji poszczególnych genów i subko- mórkowa lokalizacja ich produktów sugerują zróżnicowane funkcje w poszczegól nych organach (40,41). Poszczególne enzymy CKX różnią się właściwościami bioche micznymi, w szczególności powinowactwem substratu do różnych cytokinin (42). Funkcje genów z rodziny CKX zostały dotąd scharakteryzowane w gatunku modelo wym A. thaliana (43,44) i w niektórych zbożach: ryżu (39) i kukurydzy (45-48). W po zostałych gatunkach zbóż niektóre geny zostały sklonowane, ale ich funkcja jest po znana bardzo słabo lub jest nieznana. U jęczmienia są to geny HvCKX2 i HvCKX3 (49) a u pszenicy TaCKXl, TaCKX2 i TaCKX5 (50-52). Te ostatnie sklonowano w ostatnich latach. Nasze badania nad kierunkowym wyciszaniem genów z rodzin CKX u jęczmienia, pszenicy i pszenżyta rozpoczynaliśmy w 2006 r. przy współpracy z zespołem dr P. Gałuszki (Uniwersytet Palacky, Olomouc, Czechy). Do doświadczeń wybraliśmy geny HvCKX] (fragment sekwencji z baz danych NCBl), HvCKX2 jęczmienia sklono wany przez współpracujący zespół (49) oraz TaCKXl pszenicy (fragment sekwencji z baz danych NCBl). Do kaset wyciszających wektora pMCG161 klonowaliśmy różne
60 PRACE PRZEGLĄDOWE
Anna Nadolska-Orczyk i inni
Literatura 1. 2. 3.
4. 5. 6. 7.
8. 9. 10. 11.
12.
**13.
15.**
16.
**17.
19.** 20. 21. 22.
23.
24. 25.
26. 27.
**28.
30.**
**31.
34.**
35. 36.
Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R., (1990), Plant Cell., 2, 279-289. van der Krol A. R., Mur L. A., Beld M., Mol j. N., Stuitje A. R., (1990), Plant Cell., 2, 291-309. Fire A., Xu S., Montgomery M. K., Kostas S. A., Driver S. E., Mello C. C., (1998), Nature, 391, 806-811. Baulcombe D., (2004), Nature, 431, 365-363. Brummelkamp T. R., Bernards R., Agami R., (2002), Science, 296, 550-553. Tuschl T., (2002), Nat. Biotechnol., 20, 446-448. Mette M. F., Aufsatz W., van der Winden j., Matzke M. A., Matzke A. J., (2000), EMBO j., 19, 5194-5201. LevinJ. Z., de Framond A. j., Tuttle A., Bauer M. W., Fleifetz P. B., (2000), Plant Mol. Biol., 44, 759-775. Wang M. B., Abbott D. C., Waterhouse P. M., (2000), Mol. Plant Pathol., 1, 347-356. Chuang C. F., Meyerowitz E. M., (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 4985-4990. Wesley S. V., Flelliwell C. A., Smith N. A., Wang M. B., Rouse D. T., Liu Q., Gooding P. S., Singh S. P., Abbott D., Stoutjesdijk P. A., Robinson S. P., Cleave A. P., Green A. G., Waterhouse P. M., (2001), Plant j., 27, 581-590. Flimmelbach A., Zierold U., Flensel G., Riechen j., Douchkov D., Schweizer P., Kumlehn j., (2007), Plant Physiol., 145, 1192-1200. Lacomme C., Flrubikova K., Flein I., (2003), Plant j., 34, 543-553. Scofield S. R., Huang L., Brandt A. S., Gill B. S., (2005), Plant Physiol., 138, 2165-2173. Faivre-Rampant 0., Gilroy E. M., Hrubikova K., Hein I., Millam S., Loake G. J., Birch P., Taylor M., La comme C., (2004), Plant Physiol., 134, 1308-1316. Brigneti G., Martin-Hernandez A. M., jin H., Chen J., Baulcombe D. C., Baker B., Jones J. D., (2004), Plant J., 39, 264-272. Arabidopsis Genome Initiative, (2000), Nature, 408, 796-815. Miki D., Itoh R., Shimamoto K., (2005), Plant Physiol., 138, 1903-1913. Moore G., (2000), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, 195-222. Lawrence R. J., Pikaard C. S., (2003), Plant J., 36, 114-121. Travella S., Klimm T. E., Keller B., (2006), Plant Physiol., 142, 6-20. Radchuk V., Borisjuk L., Radchuk R., Steinbiss H-H., Rolletschek H., Broeders S., Wobus U., (2006), Plant Cell, 18, 1652-1666. Lloyd A. H., Milligan A. S., Langridge P., Able J. A., (2007), BMC Plant Biology, 7, 67-76. doiilO.l 186/1471-2229-7-67. Gubler F,, Hughes T., Waterhouse P., Jacobsen J., (2008), Plant Physiol., 147, 886-896. Van L., Loukoianov A., Blechl A., Tranquilli G., Ramakhrisna W., SanMiquel P., BennetzenJ. L., Eche- nique V., DubcovskyJ., (2004), Science, 303, 1640-1644. Loukoianov A., Yan L., Blechl A., Sanchez A., DubcovskyJ., (2005), Plant Physiol., 138, 2364-2373. Regina A., Bird A., Topping D., Bowden S., Freeman J., Barsby T., Kosar-Hashemi B., Li Z., Rahman S., Moreli M., (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 3546-3551. Uauy C., Distelfeld A., Fahima T., Blechl A., DubcovskyJ., (2006), Science, 314, 1298-1301. Yue H., Jiang D., Dai T., Qin X., Jing Q., Cao W., (2008), J. Cereal Sci., 47, 153-161. Gil-Humanes J., Piston F., Hernando A., AlvarezJ. B., Shewry P. R., Barro F., (2008), J. Cereal Sci., 48, 565-568. Nadolska-Orczyk A., Orczyk W., (2000), Mol. Breed., 6, 185-194. Przetakiewicz A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2003), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 73, 245-256. Przetakiewicz A., Karas A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2004), Cell. Mol. Biol. Lett., 9, 903-917. Nadolska-Orczyk A., Przetakiewicz A., Kopera K., Binka A., Orczyk W., (2005), J. Plant Growth Re guł., 24, 2-10. Gasparis S., Bregier C., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2008), Plant Cell Rep., 27, 1721-1729. Sijen T., Vijn I., Rebochoa A., van Blokland R., Roelofs D., Mola J. N. M., KooterJ. M., (2001) Curr. Biol., 11, 436-440.
62 PRACE PRZEGLĄDOWE
Wykorzystanie interferencji RNA w biotechnologii zbóż
**37. Nadolska-Orczyk A., Gasparis S., Orczyk W., (2009), J. Appl. Genet., 50, 185-197.
BIOTECHNOLOGIA 3 (90) 53-63 (^2010 )